1.4.1 Medio de homogeneización
La disrupción celular generalmente se realiza en un medio ligeramente hipo-osmótico o iso-osmótico para preservar la integridad morfológica. La sacarosa se usa comúnmente como un osmótico para evitar que los orgánulos subcelulares o las vesículas se hinchen o contraigan adversamente. El manitol y el sorbitol también se han utilizado cuando se ha encontrado que la sacarosa interfiere con el análisis bioquímico del componente subcelular. Se prefiere la sacarosa a las soluciones salinas porque estas últimas tienden a agregar orgánulos subcelulares. Los medios hipo-osmóticos se utilizan a menudo en el aislamiento de fracciones de membrana plasmática porque en estas condiciones, las células alteradas producen membranas plasmáticas en forma de grandes fantasmas u hojas. Esto reduce significativamente el alto grado de variación en el tamaño de estos fragmentos antes de la centrifugación. Aunque el medio de homogeneización suele ser de naturaleza acuosa, se han utilizado medios no acuosos como éter/cloroformo para aislar orgánulos subcelulares. Sin embargo, los medios no acuosos pueden inactivar algunas enzimas y reducir la integridad morfológica de algunos tejidos.
Pueden añadirse agentes quelantes (EDTA o EGTA) al medio de homogeneización para eliminar los cationes divalentes, como Mg2+ o Ca2+, que requieren las proteasas de membrana. Es importante tener en cuenta que los inhibidores de la proteasa aún deben incluirse en el medio porque los reactivos de EDTA y tiol pueden activar algunas enzimas proteolíticas. Sin embargo, muchas enzimas marcadoras de membrana requieren estos cationes para su actividad y pueden inhibirse después de que los cationes se hayan eliminado del extracto. La adición de Mg2 + o Ca2 + al medio de homogeneización mantiene la integridad nuclear. Sin embargo, estos iones pueden causar agregación de membrana y disminuir el control respiratorio en las mitocondrias.
La alteración celular del tejido vegetal a menudo libera fenoles que pueden tener varios efectos nocivos sobre las enzimas de las plantas. Los compuestos fenólicos vegetales comprenden esencialmente dos grupos: los compuestos fenilpropanoides (por ejemplo, taninos hidrolizables) y los flavonoides (por ejemplo, taninos condensados). Los fenólicos pueden unirse al hidrógeno con enlaces peptídicos de proteínas, o sufrir oxidación por fenol oxidasa a quinonas. Las quinonas son potentes agentes oxidantes que también tienden a polimerizarse y condensarse con grupos reactivos de proteínas para formar un pigmento oscuro llamado melanina que forma la base del pardeamiento del tejido vegetal. La unión de melanina a proteínas puede inactivar muchas enzimas. Los grupos hidroxilo fenólicos pueden formar interacciones iónicas con aminoácidos básicos de proteínas o interactuar hidrofóbicamente con regiones hidrofóbicas de proteínas. Por lo tanto, es importante eliminar los compuestos fenólicos lo antes posible y esto se logra mejor utilizando adsorbentes que se unen a los fenoles o quinonas o utilizando agentes protectores como borato, germanato, sulfitos y mercaptobenzotiazol que inhiben la actividad de la fenol oxidasa. El adsorbente fenólico, la polivinilpirrolidona, en forma soluble en agua o como producto insoluble altamente reticulado «Policlar», puede añadirse al medio de aislamiento. La polivinilpirrolidona se une a los compuestos fenólicos que forman fuertes enlaces de hidrógeno con las proteínas. También se ha informado que la albúmina sérica bovina reacciona con los fenólicos de las plantas y también es un eliminador eficaz de quinonas.
El fraccionamiento de células o tejidos se realiza invariablemente a + 4 ° C para reducir la actividad de las proteasas de membrana. Las proteasas se pueden subdividir en endopeptidasas y exopeptidasas. Las endopeptidasas, que son enzimas que rompen enlaces peptídicos internos, incluyen: proteasas ácidas que tienen un pH óptimo de pH 2.5–3.8 y pueden ser inhibidas por el inhibidor de estado de transición pepstatina; proteasas de serina que pueden ser inhibidas por diisopropilfluorofosfato y fenilmetilsulfonilfluoruro; y proteasas de sulfhidrilo que son inhibidas por N-etilmaleimida o E-64 (l-trans-epoxisuccinil-leucilamida-butano). Ejemplos de exopeptidasas incluyen carboxipeptidasas que están presentes en la mayoría de los tejidos de las plantas y hidrolizan fácilmente la mayoría de los aminoácidos C-terminales. Todas las carboxipeptidasas vegetales estudiadas hasta la fecha son inhibidas por diisopropilfluofosfato. También se han identificado aminopeptidasas, dipeptidasas y tripeptidasas en plantas. Otros compuestos utilizados en medios de homogeneización incluyen agentes reductores de disulfuro como el 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, glutatión reducido o cisteína. Esto se debe a que muchas enzimas contienen un grupo sulfhidrilo de sitio activo esencial que debe permanecer reducido para mantener la actividad enzimática. Muchos de los problemas de aislamiento de orgánulos están asociados con la ruptura de las membranas frágiles, por ejemplo, el tonoplasto que rodea la vacuola. Aparte de la destrucción física de estas membranas, los tejidos vegetales contienen enzimas lipolíticas activas que pueden atacar directamente los componentes lipídicos de las membranas e interrumpir los orgánulos. Los ácidos grasos libres liberados por la acción hidrolítica de las acil hidrolasas pueden inhibir las actividades ATPasas de las mitocondrias, los cloroplastos y la membrana plasmática. Otros efectos nocivos de los ácidos grasos también están bien establecidos. Hay ciertas condiciones que pueden reducir la degradación de los lípidos por lipasas y acil hidrolasas lipolíticas en las plantas. Estos incluyen el uso de (1) un medio de aislamiento con un pH de 7.5-8 en el que la mayoría de las enzimas lipolíticas y lipooxigenasas exhiben poca actividad, (2) agentes quelantes como EDTA porque muchas fosfolipasas son dependientes de Ca2+; muchas enzimas lipolíticas, sin embargo, no se ven afectadas por agentes quelantes y (3) otros aditivos como antioxidantes para prevenir la descomposición oxidativa de los hidroperóxidos de ácidos grasos, agentes reductores de disulfuros, inhibidores enzimáticos específicos y el uso de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos que se une a los ácidos grasos libres. Cada medio de homogeneización individual es diferente y puede contener inhibidores específicos para enzimas como las fosfolipasas o las fosfatasas. El glicerol, por ejemplo, a menudo se agrega al medio de aislamiento para inhibir la fosfatasa ácida fosfatídica. La etanolamina y el cloruro de colina se usan comúnmente para inhibir la fosfolipasa D.
La capacidad de amortiguación del medio de homogeneización para el fraccionamiento de células vegetales debe ser alta para compensar la liberación de ácidos orgánicos por la vacuola interrumpida que constituye un volumen sustancial de la célula. El medio de homogeneización puede formularse mediante evaluación empírica o mediante análisis racional. Por ejemplo, para garantizar que la proteína purificada pertinente permanezca intacta, se pueden añadir todos los inhibidores principales de proteasas al medio de homogeneización o, alternativamente, se pueden copiar soluciones fisiológicas. Dado que el pH citoplasmático de la célula vegetal es de alrededor de 7,5–8,0, el medio de homogeneización debe reflejar el estado fisiológico de la célula y, por lo tanto, está débilmente amortiguado al pH citoplasmático.