La microscopía por defecto es una técnica que nos permite observar, en lugar de medir, eventos biológicos y hacer conclusiones basadas en lo que vemos, en lugar de basarse en algunos cálculos. Por lo tanto, el tema de este artículo puede parecer un poco sorprendente, ya que trata sobre las medidas de colocalización. Si bien hay situaciones en las que se puede determinar visualmente la colocalización de proteínas, a menudo será necesaria una confirmación más precisa de una distribución mutua de dos sondas.
¿Por qué es Insuficiente una Determinación Visual de Colocalización?
Solo si ha recopilado imágenes siguiendo un protocolo controlado para el análisis de colocalización (señal suficiente en cada canal, sin autofluorescencia o sangrado de señal), es seguro decir que las dos sondas se colocalizan únicamente en función de la observación. En este caso, si la señal verde se coloca junto con la señal roja y la imagen es principalmente amarilla, no se necesita una medición estadística. Pero si no ves una superposición, ¡no significa que no esté allí! Puede ser que las intensidades de los dos canales no sean las mismas. Es decir, el color intermedio que vemos solo puede aparecer si ambas sondas son de la misma intensidad. Por lo tanto, las conclusiones basadas en la determinación visual a menudo pueden conducir a resultados falsos negativos.
¿Qué Métodos de Medición de Solapamiento Existen?
Si bien no hay un enfoque estándar para este asunto, hay dos métodos que son ampliamente utilizados y generalmente aceptados. Estos incluyen el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) o el coeficiente de colocalización de Mander (MCC).
Estos dos métodos se relacionan con dos aspectos diferentes de la colocalización: correlación y co – ocurrencia. El coeficiente de Pearson está relacionado con la correlación de las intensidades de píxeles en los dos canales. Mide la relación entre señales, ya sea que los valores de la señal en un canal suban simultáneamente con el otro, o que una señal caiga cuando la otra suba. La correlación es distinta de la co-ocurrencia, que se expresa matemáticamente a través del coeficiente de Mander. Esto representa la cobertura de una señal sobre la otra, lo que revela la medida en que dos sondas ocupan el mismo lugar. Exploremos esto un poco más.
Coeficiente de Correlación de Pearson (CCP)
Definición: El CCP refleja la relación lineal entre las intensidades de señal. Los valores pueden oscilar entre 1 (correlación positiva perfecta) y -1 (correlación negativa perfecta), mientras que 0 significa que no hay correlación. Es posible explorar PCC visualmente a través de un diagrama de dispersión donde las coordenadas en la gráfica representan los valores de píxeles (señal) en ambos canales. Cuantos más puntos se agrupen alrededor de una línea recta, mejor será la correlación entre las dos señales
Requisitos: El PCC debe medirse en la región de interés (ROI) para evitar falsos positivos o negativos. Si mide PCC sobre toda la imagen, los píxeles del fondo se correlacionarán perfectamente e inflarán el PCC. Por el contrario, si la medición se realiza en una región sin interés donde hay una distribución heterogénea de ambos canales, el PCC se deprimirá.
Puede seleccionar el ROI a mano o por umbral para excluir el fondo. Sea cual sea la forma en que lo haga, tenga cuidado, especialmente cuando se fije un umbral. La selección del ROI debe incluir todas las regiones relevantes de la(s) célula (s), es decir, cada lugar donde se espera que se distribuya una sonda. Si está utilizando un método basado en la intensidad para seleccionar el ROI (umbral), puede excluir inadvertidamente los resultados relevantes. ¿Cómo puede pasar esto? Podría haber una región de exclusión mutua, donde no aparece ninguna etiqueta, y esto puede ser un resultado biológicamente relevante (ambas moléculas no se expresan en ese lugar de la célula). Sin embargo, el umbral no incluirá esta región en el ROI, lo que lo pondrá en peligro de perder resultados relevantes.
Recomendado para: PCC debe usarse en imágenes si existe una relación lineal entre intensidades. Si los datos se ajustan a un modelo más complejo, el PCC no funcionará bien. También se debe elegir un método diferente si hay una superposición desigual, donde las sondas se distribuyen conjuntamente pero en proporciones diferentes. Esto puede ocurrir cuando se usa GFP como una sonda. Su nivel de expresión puede diferir entre las células, y potencialmente causar depresión de PCC debido a la alta variabilidad intercelular.
Coeficientes de colocalización de Mander
Definición: MCC es una métrica que describe la co-ocurrencia, la fracción de una proteína que se coloca con la otra. El CCM le dará una buena medida de colocalización cuando etiqueta una proteína en una vesícula y desea ver cómo se coloca en una estructura determinada de una célula, por ejemplo, un microtúbulo. Si asumimos que todas las vesículas se colocan con microtúbulos, pero solo una proporción de microtúbulos se coloca con la vesícula, puede calcular el CCM para cada canal y obtener una métrica que describa cuantitativamente esta superposición fraccional.
Requisitos: La captura con MCC es que requiere la eliminación del fondo. La parte más complicada aquí es establecer un punto de corte para la intensidad que permitirá la resta de fondo. MCC mide la fluorescencia completa de una sonda en cada píxel por encima de cero. Sin embargo, los píxeles por encima de cero son extremadamente raros, debido a factores como: autofluorescencia, fugas de luz, etiquetado no específico o fluorescencia de planos de imagen fuera de foco. Por lo tanto, la medición de MCC requiere una cuidadosa selección del umbral (corte).
La primera forma de hacerlo es el umbral global, en el que se resta un valor de umbral de cada píxel, de modo que cada nivel por debajo del límite seleccionado se convierta en fondo y cada píxel por encima caiga en una región de interés. Si bien esto es muy intuitivo, el umbral global es bastante crudo y puede conducir a situaciones no deseadas, como la exclusión de los píxeles de bajo valor que están cerca del fondo pero que de hecho son positivos.
Una opción más automática y menos subjetiva es el método Costes, donde el umbral se estima calculando PCC varias veces. Esto sirve para definir el rango de valores de píxeles que son positivos y, por lo tanto, no deben excluirse. PCC se calcula para diferentes grupos de píxeles, y los valores de píxeles para los que PCC es igual o cercano a cero se toman como valores de umbral. Sin embargo, también debe comprobarse visualmente, ya que en imágenes con menor relación señal / ruido puede identificar un nivel de umbral muy bajo para que no distinga las estructuras etiquetadas del fondo.
Recomendado para: Cuando la pregunta biológica de su experimento se refiere a la medida en que las proteínas/estructuras se superponen, el CCM debe ser la medida de elección. Estos coeficientes se interpretan de forma más intuitiva que el PCC, y son independientes de la proporcionalidad de la señal (las diferencias en el número de estructuras etiquetadas por cada sonda).
Antes de comenzar Su Análisis
Sea cual sea la opción para medir la colocalización que elija, es muy importante que la recopilación de imágenes se realice de manera correcta. Intente controlar tantos factores como pueda y prepare un conjunto de muestras de control que le permitan monitorear tantas variables como sea posible.
Tenga en cuenta que la determinación de colocalización visual está influenciada por muchos factores, incluida la subjetividad del observador, el hecho de que el cerebro de cada individuo puede ver colores de manera diferente, un posible daltonismo del observador y la resolución espacial que determina el tamaño de píxel, entre otros. Asegúrese de procesar las imágenes que está a punto de analizar de manera uniforme, y tenga en cuenta que cualquier manipulación incontrolada puede hacer que pierda información relevante.
Y por Último, pero no menos Importante
Estos cálculos se implementan en la mayoría de los paquetes de software de análisis de imágenes, por ejemplo, ImageJ y Volocity. Pero, dado que la medición de la colocalización sigue siendo un campo un tanto confuso, se requieren mejoras, por lo que debe realizar un seguimiento de las nuevas versiones y paquetes para el software.
¿Cómo se mide la colocalización? ¡Háganoslo saber escribiendo en la sección de comentarios!
Literatura:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy (en inglés). Revista Americana de Fisiología-Fisiología Celular (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Análisis de Colocalización en Microscopía de fluorescencia. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, Nueva York: Humana Press, 2012, pp.97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Pruebas estadísticas para medidas de colocalización en microscopía biológica. Journal of microscopy (en inglés). 2013; 252(3): 295-302
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