Clazakizumab en el rechazo mediado por anticuerpos tardíos: protocolo de estudio de un ensayo piloto controlado aleatorizado

Diseño del estudio y flujo del ensayo

Este estudio prospectivo bicéntrico (Medical University Vienna y Charité University Medicine Berlin) es un ensayo piloto de fase 2 iniciado por investigadores diseñado para evaluar la seguridad, tolerabilidad y eficacia (evaluación preliminar) del anti-IL humanizado 6 anticuerpo monoclonal clazakizumab en la RMBA tardía. El patrocinador de este ensayo no comercial es la Universidad de Medicina de Viena. Además del diseño del estudio, el patrocinador llevará a cabo el ensayo (en colaboración con socios de investigación), siendo responsable de todos sus aspectos científicos, éticos, reglamentarios y legales. El financiador (Vitaeris Inc. Vancouver, Canadá) ha establecido condiciones de financiación y proporcionará financiación externa.

Planteamos la hipótesis de que la administración de clazakizumab en receptores de trasplante renal además de la inmunosupresión basal tendrá un perfil de seguridad aceptable, como se notificó anteriormente en pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, planteamos la hipótesis de que la administración repetida de clazakizumab contrarrestará la inflamación y la lesión tisular en la RMBA en curso, en particular, la inflamación en la microcirculación, la alorespuesta de células B específicas del antígeno leucocitario humano (HLA) y la lesión crónica del injerto provocada por aloanticuerpos.

En la Fig. 1. En la Fig. 2, y una lista de verificación firmada de SPIRIT 2013 se adjunta como archivo complementario (Archivo adicional 1). El estudio consta de dos partes subsecuentes. En una primera parte (parte A), los participantes serán aleatorizados para recibir clazakizumab (inyección subcutánea de 25 mg) o placebo durante un período de 12 semanas (administración de clazakizumab/placebo en el día 0 y después de cuatro y ocho semanas). Después de 11 semanas, los pacientes serán sometidos a una primera biopsia de trasplante de seguimiento. En la semana 12, se completará la parte A y la secuencia de aleatorización se revelará para un primer análisis de los datos. Los objetivos principales de esta parte del ensayo son evaluar la seguridad y tolerabilidad de un ciclo corto de tratamiento. Además, la parte A permitirá una primera evaluación preliminar del impacto de clazakizumab en la inflamación asociada a la RMAB detectada en sangre periférica y en el aloinjerto de órgano de rechazo. Después de la semana 12, todos los pacientes del estudio entrarán en una parte abierta del estudio (parte B) y recibirán 25 mg de clazakizumab en intervalos de cuatro semanas hasta la visita al final del estudio después de 52 semanas. Después de 51 semanas, los pacientes serán sometidos a una segunda biopsia de protocolo. Los objetivos principales de la parte B son evaluar la seguridad y tolerabilidad de un período prolongado de tratamiento con clazakizumab y el impacto a largo plazo de este anticuerpo en la evolución de la RMAB, los biomarcadores asociados al rechazo y la función y supervivencia del aloinjerto renal durante un período de 12 meses.

Aunque el estudio no se diseñó para investigar ningún efecto de rebote tras la interrupción del tratamiento con clazakizumab, después de la última visita al estudio, se controlará a todos los participantes del estudio para detectar cualquier signo de empeoramiento de la función del trasplante renal en visitas de seguimiento regulares cada cuatro semanas durante cinco meses después de la última dosis (5 × semivida) en clínicas ambulatorias.

Esperamos completar el reclutamiento de pacientes después de 18 meses y finalizar el ensayo después de 30 meses.

Participantes

Incluiremos a los receptores de trasplante de riñón con ASD anti-HLA circulante y características de biopsia de RMAB en una biopsia de indicación realizada para un resultado positivo de ASD post-trasplante y / o deterioro lento de la función del aloinjerto y/o proteinuria. Otros criterios de inclusión clave son un injerto funcional ≥ 365 días después del trasplante y una tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) > 30 ml/min/1.73 m2. Este umbral de TFGe se ha elegido para evitar la inclusión de trasplantes con un alto grado de daño crónico irreversible (para pacientes con lesión de injerto muy avanzada, ya no se puede esperar un beneficio del tratamiento sostenible). Los criterios de inclusión y exclusión se enumeran en la Tabla 1.

Procedimiento de aleatorización

Para la parte A, los pacientes se aleatorizarán 1:1 a uno de los dos grupos del estudio (clazakizumab versus placebo) utilizando una plataforma de aleatorización basada en la web (https://www.meduniwien.ac.at/randomizer). La aleatorización se estratificará por lugar de estudio y de acuerdo con las categorías de RMCA (RMCA activa versus RMCA crónica/activa) para garantizar un equilibrio de pacientes con estos dos tipos histológicos entre los dos grupos.

Cálculo del tamaño de la muestra

Para este estudio piloto, no se ha realizado una estimación exacta del tamaño de la muestra, porque se desconoce el tamaño del efecto (no hay información previa en la que basar el tamaño de la muestra). El objetivo principal será la seguridad y la tolerabilidad. Una evaluación preliminar de los resultados de eficacia en 20 receptores de trasplante renal con RMBA tardía proporcionará los primeros datos sobre el efecto de clazakizumab en las variables clínicas, morfológicas, inmunológicas y moleculares. Se puede esperar que los resultados respectivos (por ejemplo, comparación entre clazakizumab y placebo con respecto a las puntuaciones de inflamación de la microcirculación y rechazo molecular), incluida una evaluación de la variabilidad, proporcionen una base valiosa para el diseño de ensayos futuros.

Intervenciones

Clazakizumab o placebo se administrarán como inyección subcutánea única de 1 ml cada una por personal cualificado ciego del estudio. Clazakizumab se suministrará en viales de dosis única (25 mg/ml) para inyección y será suministrado por Vitaeris Inc. El medicamento placebo se administrará con solución salina normal para inyección y será proporcionado por el investigador. En la parte A del ensayo, clazakizumab o placebo se administrarán en dosis de cuatro semanas como inyección única SUBCUTÁNEA el día 0 y en las semanas 4 y 8. Durante la parte B, todos los pacientes recibirán dosis de clazakizumab cuatro veces por semana a partir de la semana 12, luego a las semanas 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, y 48 (visita de fin de estudio en la semana 52).

Se prohibirán los siguientes medicamentos durante el estudio: rituximab; eculizumab; inhibidores del proteasoma; inmunoglobulina intravenosa; intercambio plasmático o inmunoadsorción; y otros medicamentos/tratamientos en investigación, incluidos los anticuerpos monoclonales anti-IL-6/IL-6R disponibles comercialmente, como tocilizumab. Se permitirán los siguientes medicamentos concomitantes durante el estudio: inhibidores de la calcineurina (tacrolimus o ciclosporina A); inhibidor de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) (everolimus o rapamicina); micofenolato mofetilo (MMF)/micofenolato sódico; y corticosteroides a dosis bajas (prednisolona ≤ 5 mg/día).

Inmunosupresión basal

Tras el diagnóstico de RMBA tardía, todos los receptores (ambos grupos de la parte A) en tratamiento con inhibidores de calcineurina o inhibidores de mTOR, sin azatioprina o MMF / ácido micofenólico, recibirán MMF (inicialmente 2 × 500 mg por día; aumento gradual a 2 × 1000 mg al día si se tolera) para evitar una inmunosupresión insuficiente. Nuestro protocolo no permite dosis de MMF > 2000 mg por día. Se carece de datos sólidos sobre la dosificación óptima de FMM en la RMAB; una preocupación a este respecto puede ser que dosis más altas de FMM podrían aumentar notablemente la toxicidad hematológica del bloqueo de la IL-6 (por ejemplo, leucopenia). Tacrolimus se ajustará para alcanzar niveles valle objetivo en el rango de 5-10 ng/ml, CyA a 80-120 ng/ml. Los receptores que antes habían sido destetados de los esteroides recibirán dosis bajas de prednisolona (5 mg/día). Para cada participante, se documentará el tipo de inmunosupresión y sus modificaciones durante el período de estudio.

Enmascaramiento y desenmascaramiento

La aleatorización (parte A) se realizará en los dos lugares de estudio por farmacéuticos no enmascarados, que también son responsables de la preparación de clazakizumab y placebo (solución salina al 0,9%). Para mantener y garantizar el cegamiento y evitar el posible desbloqueo de la asignación de grupos, las preparaciones de fármaco real y placebo serán idénticas en color, apariencia y olor. Los investigadores participantes, el personal médico interactivo y los participantes del estudio no podrán ver la asignación de grupos; el equipo clínico no podrá acceder a la lista de asignación segura (acceso protegido con contraseña restringida) hasta que el último paciente haya completado la parte A. Puede ser necesario desenmascarar prematuramente en casos de emergencias médicas, afecciones médicas graves, en las que los participantes no pueden recibir un tratamiento adecuado a menos que el personal médico conozca las condiciones de tratamiento asignadas o informe de sospechas de eventos adversos graves inesperados (SAEs). Si es necesario, el comité de vigilancia de datos y seguridad (DSMB) puede solicitar el desbloqueo.

Los parámetros de los resultados

Las medidas de los resultados primarios y secundarios se detallan en la Tabla 2. En la Fig. 2. Las medidas primarias de los resultados son la seguridad y tolerabilidad de clazakizumab, evaluadas durante todo el período del estudio (19 visitas hasta la visita de EOS a las 52 semanas, día 0, semanas 1, 2, 3, 4, 8, 11, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 51, y 52). De acuerdo con los principios estadísticos de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH), la seguridad se refiere al riesgo médico para los participantes, evaluado mediante pruebas de laboratorio, signos vitales y EA, mientras que la tolerabilidad describe el grado en que los EA manifiestos pueden ser tolerados por el individuo (como se refleja en la tasa de abandonos debido a la falta de tolerabilidad). Las variables secundarias son la farmacocinética( FC; concentración de clazakizumab) y la farmacodinamia (PD) de clazakizumab, evaluadas mediante mediciones seriadas de la proteína C reactiva (PCR). La supresión de esta proteína de fase aguda derivada de hepatocitos se demostró anteriormente como un valioso marcador sustituto de la eficacia anti-IL-6 . Para la evaluación preliminar de la eficacia, se evaluarán biomarcadores derivados de la sangre de la RMAB (características de la ASD, citoquinas y marcadores de activación/lesión endotelial, patrones de subpoblaciones de leucocitos de sangre periférica) en el día 0 y después de 12 y 52 semanas. Además, estudiaremos las transcripciones de IL-6/IL-6R (antes del inicio del estudio y en las semanas 12 y 52), para aclarar si la neutralización de IL-6 modula la expresión génica y en qué medida. El efecto inmunosupresor global de clazakizumab se evaluará mediante la monitorización de la carga de TVT en plasma.

El estudio incluirá dos biopsias de protocolo, una biopsia temprana después de 11 semanas (antes del final de la parte A) para diseccionar principalmente el efecto del bloqueo de IL-6 sobre la inflamación de la microcirculación en comparación directa con el placebo, y una biopsia tardía después de 51 semanas (antes del final de la parte B) para evaluar el efecto de clazakizumab en la progresión de la lesión crónica (extensión de la glomerulopatía fibrosis y atrofia tubular). Las dos biopsias se realizarán cada una poco (una semana) antes del final de las partes del estudio respectivas, para evitar interferencias con los análisis farmacocinéticos detallados programados para las semanas 12 y 52, respectivamente. Todas las biopsias se evaluarán para determinar los patrones de expresión génica típicos de la RMAB (ATAGC, Universidad de Alberta, Edmonton; lectura importante: puntuación molecular de la RMAB). Además, se evaluarán la función renal, la excreción de proteínas, el fallo del injerto y la muerte durante todo el período de estudio. Finalmente, evaluaremos el impacto del bloqueo de la IL-6 (en comparación con el placebo) en la farmacocinética del pantoprazol como fármaco sonda del metabolismo hepático dependiente del citocromo (CYP). Se eligió pantoprazol porque las dosis únicas son bien toleradas y la actividad del CYP2C19 es sensible a la fenoconversión durante la inflamación . En el día 0 y en las semanas 12 y 52, se administrará pantoprazol a una dosis de 20 mg por vía intravenosa y se determinarán los niveles del fármaco cada hora durante un período de 6 h. En pacientes en tratamiento continuo con inhibidores de la bomba de protones, el tratamiento oral se interrumpirá durante tres días antes de la prueba FC y se reiniciará un día después.

Evaluación de la seguridad y notificación de acontecimientos adversos

En cualquier situación clínica, incluidas las emergencias, se proporcionará atención médica adecuada. La evaluación de la seguridad incluirá un seguimiento cuidadoso de todos los efectos adversos (EA), incluidos los SAES. No se dispone de datos sobre la seguridad y tolerabilidad de clazakizumab en poblaciones trasplantadas. Sin embargo, los resultados de estudios previos obtenidos en > 1000 pacientes/participantes tratados con clazakizumab están disponibles para la evaluación de los patrones de seguridad. La Tabla 3 proporciona un resumen de los EA notificados para clazakizumab a una dosis de 25 mg/mes en dos ensayos de fase 2 representativos realizados en pacientes con artritis.

Análisis intermedios

Este estudio será supervisado por un DSMB independiente para evaluar la seguridad y la calidad de los datos. Para detectar las principales diferencias entre los grupos en términos de aspectos de seguridad de manera oportuna, se instruirá a los miembros de la junta para que realicen análisis provisionales después de que 10 y 20 pacientes hayan finalizado la parte A del estudio. El DSMB analizará los AEs registrados y los resultados de laboratorio de seguridad en relación con la secuencia de aleatorización.

El DSMB puede considerar la suspensión del ensayo si el patrón general de SAES relacionados o los cambios en los resultados de laboratorio de seguridad apoyan firmemente una señal de seguridad importante. Parte A: si seis participantes experimentan SAEs relacionados (definitiva y posiblemente) (criterios comunes de toxicidad > Grado 3 o grave/médicamente significativo ) y/o niveles sustancialmente elevados de parámetros hepáticos (alanina aminotransferasa , aspartato aminotransferasa y/o bilirrubina > 3× límite superior de normalidad) o neutropenia (< 0,5 G/L), el DSMB desenmascarará los resultados de seguridad. Si cinco o todos los participantes están en el grupo de clazakizumab, se suspenderá el estudio. De manera similar, si se producen seis AAS relacionadas y/o anomalías sustanciales en los recuentos de enzimas hepáticas o neutrófilos en la misma clasificación de órganos del sistema, el DSMB desenmascarará estos AAS y si cinco o todos los AAS están en el grupo de clazakizumab, se interrumpirá el estudio. Parte B (todos los participantes en tratamiento con clazakizumab): si ≥ 10 individuos experimentan SAES relacionados con el fármaco o ≥ 10 SAEs relacionados se presentan en la misma clase de órganos del sistema, se suspenderá el ensayo (el número total de SAEs relacionados también debe incluir los SAEs relacionados que ocurren en los individuos tratados con clazakizumab durante la parte A).

Para este ensayo piloto, no se definen las definiciones estadísticas exactas de los criterios para la terminación prematura del estudio.

Control de calidad y garantía de calidad

Los procedimientos de seguimiento incluirán visitas regulares predefinidas a los dos lugares de estudio. Los investigadores darán acceso a todos los documentos de origen, incluidos los formularios de denuncia de casos y otros documentos relacionados con el protocolo. La confidencialidad de los participantes se mantendrá de acuerdo con las regulaciones locales. El monitor designado se pondrá en contacto con el investigador y lo visitará periódicamente, y se le permitirá tener acceso a todos los documentos de origen necesarios para verificar las entradas en los formularios de notificación de casos y otros documentos relacionados con el protocolo, siempre que se mantenga la confidencialidad de los participantes de acuerdo con las normas locales. Será responsabilidad del monitor inspeccionar el formulario de reporte de caso a intervalos regulares de acuerdo con el plan de monitoreo durante todo el estudio, para verificar la adherencia al protocolo y la integridad, consistencia y precisión de los datos ingresados. Los estándares de monitoreo requieren una verificación completa de la presencia de consentimiento informado, el cumplimiento de los criterios de inclusión/exclusión, la documentación de EA y el registro de los principales criterios de eficacia, seguridad y tolerabilidad.

Metodología

Función renal

El eGFR se evaluará utilizando la ecuación de Colaboración en Epidemiología de la Enfermedad Renal Crónica (ERC-EPI) (mL/min/1, 73m2). La excreción de proteínas se documentará como relación proteína / creatinina en orina puntual (mg/g).

Biopsias de trasplante

Las biopsias de índice y de seguimiento se realizarán utilizando técnicas percutáneas guiadas por ultrasonido (1-2 núcleos por biopsia, aguja de calibre 16). Después de la biopsia, los pacientes serán monitorizados de cerca durante 5-8 h para cualquier complicación (mediciones seriadas de la presión arterial, monitoreo de hematuria, verificación de hemoglobina 4 h después de la biopsia). La histomorfología se evaluará en secciones embebidas en parafina aplicando metodología estándar. Para la tinción inmunohistoquímica C4d, utilizaremos un anticuerpo policlonal anti-C4d (BI-RC4D, Biomedica, Viena, Austria) y la tinción inmunohistoquímica mínima (puntuación de Banff C4d ≥ 1) a lo largo de los capilares peritubulares se considerará positiva. Las biopsias también se evaluarán mediante microscopía electrónica para la detección de lesiones por microcirculación. Los resultados morfológicos serán evaluados por patólogos experimentados en trasplantes renales ciegos para la asignación del tratamiento. Además, las biopsias se analizarán utilizando un método molecular completamente validado (MMDx™), como propone el esquema Banff . Para cada biopsia, una porción de 3 mm de un núcleo se colocará inmediatamente en un recipiente RNAlater, se almacenará a – 20 °C y se enviará a temperatura ambiente o hielo seco al Centro de Genómica Aplicada para Trasplantes de Alberta (ATAGC, Universidad de Alberta, Edmonton, AB, Canadá) para el análisis de matrices genéticas. Las puntuaciones moleculares basadas en clasificadores basados en lesiones derivadas de aprendizaje automático relacionados con el rechazo (ABMRpm, TCMRt, todo rechazo) se generarán utilizando el conjunto de referencia de Edmonton de > 1200 biopsias. Además, los patrones de expresión génica se evaluarán utilizando un análisis de arquetipos imparcial . Para la clasificación de la RMAB, todos los resultados de la biopsia se analizarán en el contexto de los resultados moleculares. Las categorías de RMBA y las lesiones individuales morfológicas se definirán y puntuarán tras las actualizaciones recientes de la clasificación de Banff .

Detección de anticuerpos HLA

Los sueros se inactivarán térmicamente para evitar artefactos in vitro dependientes del complemento (fenómeno prozone) y se someterán a pruebas de flujo de antígeno único (ensayos de antígeno único en pantalla de laboratorio; Un Lambda, Canoga Park, CA, EE.UU.). Los resultados de las pruebas se documentarán como intensidades medias de fluorescencia; una intensidad de fluorescencia media (IMF) > 1000 se considerará positiva. La especificidad del donante se definirá de acuerdo con los resultados de tipificación de HLA de donantes y receptores de baja o alta resolución. Los niveles de anticuerpos reactivos de panel virtual se calcularán utilizando herramientas de software específicas (http://www.eurotransplant.org/cms/).

Las citocinas y los marcadores de activación/lesión endotelial

Los sueros recolectados en las semanas 0, 12 y 52 se analizarán en busca de IL-6, IL-6R soluble y marcadores que reflejen inflamación o activación endotelial y lesión utilizando matrices de perlas en una plataforma Luminex o tecnología de ensayo de inmunoabsorción enzimática. Paralelamente, se analizarán muestras de orina utilizando la misma metodología. Para el análisis basado en Luminex de biomarcadores séricos y urinarios, utilizaremos inmunoensayos ProcartaPlex Simplex humanos siguiendo el protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Las pruebas se realizarán en un instrumento Luminex 200. Los paneles de cuentas incluirán combinaciones de diferentes marcadores que potencialmente reflejan el alcance de la inflamación y la lesión, incluidas quimiocinas (por ejemplo, CXCL9 y CXCL10) y marcadores endoteliales (por ejemplo, VCAM-1 y E-selectina), respectivamente. Los resultados urinarios se normalizarán a concentraciones de creatinina urinaria.

Subpoblaciones leucocitarias

Los mecanismos subyacentes de la RMBA, especialmente el papel de los subconjuntos periféricos de células T y B, no están completamente aclarados. Por lo tanto, el fenotipado inmune prospectivo es un enfoque prometedor para dilucidar aún más el impacto del bloqueo de la IL-6 en las vías inmunorreguladoras. Para el monitoreo de (sub)poblaciones de leucocitos, utilizaremos paneles de monitoreo inmune reproducibles para el fenotipado. Recientemente, el consorcio internacional «The ONE study» ha diseñado un panel estandarizado (DuraClone®, Beckman Coulter, Marsella, Francia) para el fenotipado inmune basado en citometría de flujo que demostró resultados sólidos . En los kits de monitoreo inmunitario de DuraClone, los tubos de ensayo predefinidos contienen una capa con el panel de anticuerpos secos listo para usar. Hasta 10 anticuerpos monoclonales diferentes por tubo permiten la identificación de subpoblaciones de leucocitos (por ejemplo, células T, células B, células asesinas naturales) presentes en muestras de sangre total.

Análisis de expresión génica

Para el análisis de expresión génica, se recogerán 5 ml de sangre en tubos de ARN sanguíneo de PAXgene y se almacenarán a – 80 °C hasta el análisis. Después de la descongelación, el ARN se aísla y se transcribe en ADN complementario (ADNc). La cantidad de ARN / ADNc de IL-6 o IL-6R se determinará mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real utilizando el ensayo TaqMan.

Cuantificación del virus Torque Teno (TTV)

El ADN de TTV se cuantificará en muestras de plasma almacenadas mediante PCR en tiempo real, como se describió anteriormente .

Pantoprazol PK

Se aplicará una espectrometría de masas en tándem por cromatografía líquida para evaluar los niveles y la cinética de pantoprazol .

Métodos estadísticos

Los análisis se realizarán de acuerdo con el principio de intención de tratar. Los datos continuos se presentarán como media y desviación estándar (DE) o mediana y rango intercuartílico (RIC), según corresponda, y las variables categóricas como frecuencias absolutas y relativas. Las comparaciones de grupos (al inicio y después de tres meses) para datos continuos (niveles de PCR, eGFR, cociente proteína/creatinina, niveles de biomarcadores de rechazo en suero y orina, niveles de expresión de IL-6/IL-6R, características de anticuerpos HLA , puntuaciones de biopsia morfológicas o moleculares (por ejemplo , puntuación ABMR)) se analizarán mediante pruebas paramétricas (prueba t) o no paramétricas (prueba U de Mann-Whitney), según corresponda. La prueba exacta de Fisher se utilizará para comparar datos categóricos entre grupos (ocurrencia de EA, categorías morfológicas/moleculares de RMBA y rechazo agudo comprobado por biopsia al inicio y después de tres meses). La supervivencia del paciente y del trasplante o la supervivencia sin AE se evaluarán mediante el análisis de Kaplan–Meier y se aplicará la prueba de rango logarítmico de Mantel Cox para las comparaciones de grupos. Para los datos emparejados (por ejemplo, puntuaciones de biopsia morfológica y molecular después de 3 vs 12 meses en la cohorte general), se utilizará la prueba t emparejada o la prueba de Wilcoxon. Un valor de P bilateral < 0.05 se considerará estadísticamente significativo. El análisis de FC de clazakizumab y pantoprazol incluirá una descripción de la evolución temporal de la concentración de anticuerpos/fármaco. La semivida de eliminación, Tmáx, Cmáx, aclaramiento y volumen de distribución se calcularán utilizando un software estándar. Para el análisis estadístico IBM SPSS Statistics 24 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) y SAS para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Registro del estudio

El estudio fue aprobado por las autoridades reguladoras austriacas (Oficina Federal de Seguridad Sanitaria, Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria) y alemanas (Instituto Federal de Vacunas y Biomedicina, Instituto Paul-Ehrlich). El estudio se registró en la Base de Datos Europea de Ensayos Clínicos (número EudraCT: 2017-001604-30; registro prospectivo) y en una base de datos pública de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov NCT03444103; registro retrospectivo).