El proceso de aplicación de imágenes de CLARIDAD comienza con una muestra de tejido postmortem. A continuación, se deben aplicar una serie de tratamientos químicos para lograr la transparencia, en los que se elimina el contenido de lípidos de la muestra, mientras que casi todas las proteínas y ácidos nucleicos originales se dejan en su lugar. El propósito de esto es hacer que el tejido sea transparente y, por lo tanto, susceptible de una investigación microscópica detallada de sus partes funcionales constituyentes (que son predominantemente proteínas y ácidos nucleicos). Para lograr esto, la estructura proteica preexistente debe colocarse en un andamio transparente que la conserve, mientras se eliminan los componentes lipídicos. Este «andamio» está compuesto por monómeros de hidrogel como la acrilamida. La adición de moléculas como formaldehído, paraformaldehído o glutaraldehído puede facilitar la unión del andamio a las proteínas y ácidos nucleicos que deben conservarse, y la adición de calor es necesaria para establecer los vínculos reales entre los componentes celulares y la acrilamida.
Una vez completado este paso, los componentes de proteínas y ácidos nucleicos de las células del tejido diana se mantienen firmemente en su lugar, mientras que los componentes lipídicos permanecen separados. Luego, los lípidos se eliminan durante 1-2 semanas de difusión pasiva en detergente, o se aceleran mediante métodos electroforéticos a solo horas o días. A medida que pasan, las propiedades lipofílicas del detergente le permiten recoger y eliminar los lípidos encontrados en el camino. Los tintes lipofílicos como DiI se eliminan, sin embargo, hay tintes lipofílicos compatibles con la CLARIDAD que se pueden fijar a proteínas vecinas. La gran mayoría de las moléculas no lipídicas, como las proteínas y el ADN, no se ven afectadas por este procedimiento, gracias al gel de acrilamida y a las propiedades químicas de las moléculas involucradas.
Como se informó en el documento inicial, el tejido se expande durante este proceso, pero según sea necesario puede restaurarse a sus dimensiones iniciales con un paso final de incubación en la solución de coincidencia del índice de refracción.
En esta etapa del proceso, la muestra se ha preparado completamente para la obtención de imágenes. El contraste para la obtención de imágenes puede provenir de moléculas fluorescentes endógenas, de etiquetas de ácido nucleico (ADN o ARN) o de inmunotinción, mediante la cual se utilizan anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia diana determinada. Además, estos anticuerpos están etiquetados con etiquetas fluorescentes que son la clave para el resultado final de la imagen. Los métodos de imágenes confocales, de dos fotones o de hojas de luz estándar son adecuados para detectar la fluorescencia emitida a la escala de localización de proteínas, lo que resulta en las imágenes finales tridimensionales y altamente detalladas que produce CLARITY.
Después de que una muestra ha sido inmunotenada para una imagen, es posible eliminar los anticuerpos y volver a aplicar otros nuevos, lo que permite obtener imágenes de una muestra varias veces y apuntar a múltiples tipos de proteínas.