Cartas oncológicas

Introducción

El cáncer de pulmón es el cáncer más común después del cáncer de mama y de colon en todo el mundo (1). La incidencia del cáncer de pulmón es similar a las tasas de mortalidad de esta enfermedad debido a la alta mortalidad del cáncer de pulmón. Según los datos disponibles de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, se espera que las muertes anuales por cáncer de pulmón aumenten aproximadamente a 10 millones para 2030 (2).El tipo histológicamente más común de cáncer de pulmón es el adenocarcinoma, que representa casi el 50% de todos los cánceres de pulmón(3).

Desde el punto de vista histológico, hay dos tipos principales de cáncer de pulmón, el carcinoma de pulmón de células pequeñas (CPCP) y el no CPCP (CPCNP). El SCLC representa aproximadamente el 20% de todos los casos de cáncer de pulmón, mientras que el CLC representa casi el 80% de los casos de cáncer de pulmón (4). Hay tres subtipos histológicos de CPNM: i) carcinoma de células escamosas (CCE), ii) adenocarcinoma, yii) carcinoma de pulmón de células grandes, cada uno de los cuales representa 25, 40 y 15% del total de casos de CPNM, respectivamente (5).

A pesar de que se reconoce que el cáncer de pulmón es uno de los tipos de cáncer más agresivos, el progreso en los resultados clínicos es lento, a pesar de que existe un gran número de nuevos fármacos disponibles. El problema más importante de este inconveniente en el manejo clínico del cáncer de pulmón es la falta de marcadores de tumores de suero validados, que son útiles tanto en el diagnóstico como en la progenosis de la enfermedad (6). Muchos tipos de tumores malignos causan derrames pleurales, y los cánceres que con mayor frecuencia hacen metástasis en la pleura son carcinomas pulmonares y mamarios y linfomas. A pesar de que el examen citológico de la efusión pleural se considera un enfoque estándar para el diagnóstico, su sensibilidad es típicamente de solo el 50-70% (7,8).

En muchos estudios se evaluaron varios marcadores tumorales, como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno carbohidrato 125 (CA125) y la CIFRA21-1,un fragmento de citoqueratina 19 (CK19), como marcadores tumorales mejores y más precisos en suero y en líquido pleural (7,8). También se ha observado que una combinación de dos o más marcadores es más poderosa que un solo marcador. Sin embargo, en muchos de estos estudios no se evaluó el poder de predicción diagnóstica real de estos marcadores, ya que se detectó la presencia citológica de células tumorales en los derrames pleurales de los pacientes (9-11). Se encontró que muchos de los marcadores mencionados estaban elevados en los derrames pleurales de pacientes con cáncer en comparación con los derrames pleurales benignos (7). Se encontró que las células de cáncer de pulmón humano derivadas de la efusión pleural eran más invasivas y metastásicas que las células cancerosas de lesiones primarias, y esta diferencia puede estar relacionada con la transición epitelial-mesenquimatosa(EMT).

La EMT, que por lo general desempeña un papel importante en la morfogénesis del tejido embrionario y en la fibrosis posterior a la lesión(12,13), se reactiva inadecuadamente durante la adultez bajo ciertas condiciones patológicas, como el cáncer, y contribuye a la metástasis tumoral (13). La EMT es conocida por mediar en muchas alteraciones y la modulación del fenotipo resultante en la arquitectura tumoral. La EMT se caracteriza por la interrupción de la adhesión intercelular, la motilidad elevada de las células tumorales, la disminución de la susceptibilidad a anoikis y apoptosis y la liberación de células del tejido epitelial (9-11). Las células tumorales liberadas, que son resistentes a los anoikis, asumen fenotipo mesenquimatoso que es susceptible de migración, invasión y diseminación, contribuyendo a la progresión metastásica. En muchos casos, el grado de EMT de las células cancerosas determina la gravedad del cáncer (14). También se ha demostrado que la EMT participa en la resistencia al anoikis, que es fundamental en la inhibición de la metástasis del cáncer en varios tumores sólidos (15).

Las citoqueratinas (CKs) son marcadores tumorales comunes y son los principales elementos estructurales del citoesqueleto en células epiteliales, y sobre la base de las propiedades estructurales CKs, hay 20 subtipos. De estos, la CK19 es una CK soluble y ácida de tipo I y se expresa en el revestimiento del epitelio del árbol bronquial y se sabe que está sobreexpresada en tejidos de cáncer de pulmón (16). Hay una degradación elevada de CK19 en células epiteliales transformadas de forma neoplástica debido al aumento de la actividad de la fase 3, y los fragmentos proteolíticos, en particular,CYFRA21-1, se liberan en la sangre. Se considera que la CK19 está estrechamente relacionada con el cáncer de pulmón; sin embargo, algunos estudios informaron que la expresión de la CK19 es negativa en ciertos cánceres de pulmón (9-11). La expresión de CK19 en algunas líneas celulares de cáncer de pulmón se redujo tras la EMT inducida por el factor de crecimiento transformante (TGF)-β (17). Las concentraciones circulantes de fragmentos de CK19, incluida la CIFRA21-1, probablemente reflejan la extensión de la formación del citoesqueleto en las células cancerosas y también pueden asociarse con el grado de diferenciación tumoral hacia el epitelio escamoso (16).

En el presente estudio, se emplearon muestras tumorales de 111 pacientes con cáncer de pulmón y se investigó la incidencia de expresadores negativos de CK19 en diferentes tipos de cáncer de pulmón, así como si la inducción de la EMT en las células de enfoque primarias influye en la expresión de CK19. También examinamos si los cánceres de pulmón negativos a CP19 eran más invasivos y metastásicos.

Pacientes y métodos

General

Los 111 pacientes se seleccionaron de acuerdo con la estadificación TNM de 7ª versión, descrita por el American Joint Committee onCancer y la Unión Internacional para el Control del Cáncer en 2007 (9-11). En el presente estudio se reclutaron pacientes con cáncer de pulmón diagnosticados con diferentes tipos de cáncer de pulmón en la etapa IV y tratados con inhibidores de la tirosina cinasa o quimioterapia basada en platino(75 mg/m2) y docetaxel (75 mg/m2). Los pacientes fueron ingresados en el Hospital Popular Subei entre enero de 2013 y diciembre de 2014.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular Subei. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante. Este estudio se ajusta al «Código de Ética de la Asociación Médica Mundial» (Declaración de Helsinki, 1964).Los 111 pacientes comprendían 90 hombres(44-82 años de edad) y 21 mujeres (40-75 años de edad). Las características de los pacientes se muestran en la Tabla I. Se identificaron un total de 56 casos de adenocarcinoma, 21 de CPC, 32 de CPCP y 2 de carcinoma adenocamoso.Los pacientes incluidos cumplieron los siguientes criterios: Karnofskyscore con una esperanza de vida >60 años de >3 meses, sin enfermedades del sistema inmunológico, electrocardiograma normal, función hepática y renal normal, y sin tratamiento antitumoral en el plazo de un mes antes del estudio. Los casos tratados con inhibidores de la tirosina cinasa fueron del tipo adenocarcinoma.

Se recogieron muestras de sangre de todos los pacientes y los sueros se separaron y congelaron hasta el análisis posterior.Las muestras de derrame pleural se recogieron siguiendo los procedimientos aprobados, se examinaron citológicamente y se procesaron para inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica

Se procesaron muestras de tejido tumoral (focos primarios) para inmunohistoquímica para la detección de CK19, E-cadherina y vimentina. Las muestras de tejido de foco primario se fijaron en formol y se añadieron en bloques de parafina. Se utilizaron múltiples secciones (4 µm) de cada muestra para el análisis inmunohistoquímico. Las muestras fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Se compraron anticuerpos anti-CK19, anti-E-cadherina y anti-vimentina a TIYO Biotechnology Corporation (Shanghai, China). Anticuerpo policlonal Anti-CK19 para conejos(referencia no. Z98123) se utilizó en una dilución de 1:50;policlonal de conejo anti-E-cadherina CK19 (referencia no. Z86603) se utilizó el anticuerpo a una dilución de 1:100 y el anticuerpo policlonal anti-vimentina CK19rabbit (no de catálogo. Z40651) se utilizó en una dilución de 1: 500, seguida de incubación con anti-IgG conjugado con rábano picante (Beijing CellChip Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China) a una dilución de 1:100. El desarrollo del color se realizó utilizando sustrato de 3,3 ‘ – diaminobencidina.

La aparición de partículas de bronceado en la membrana celular y el citoplasma se consideró positiva para CKl9, E-cadherina yvimentina, respectivamente. Los resultados inmunohistoquímicos fueron confirmados por dos patólogos utilizando un método de doble ciego.

Análisis de marcadores

Se utilizó un analizador automático de inmunoensayos de quimioluminiscencia Cobas Roche E601 (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) para medir el ACE, el CA125, la enolasa neuronal específica (NSE),la α-fetoproteína (AFP) y la CIFRA21-1 séricos en sueros de pacientes y efusiones pleurales. CYFRA21-1 >3,3 ng/ml, NSE >15.2 ng/ml, CEA >5.0 ng/ml, CA125 >35.0 ng/ml y AFP >7 ng/ml fueron consideredpositive valores.

La EMT inducida por TGF-β1 en células tumorales pulmonares

Se aislaron células tumorales de tejidos de enfoque primario obtenidos de los pacientes. Se aislaron células primarias del tejido tumoral primario y del derrame pleural del mismo paciente y se cultivaron. Las células se aislaron en dos pasos: i) centrifugación a través de un medio de separación de linfocitos (gravedad específica de 1.077), seguido de cultivo en medio RPMI-1640 que contiene un 20% de suero fetal bovino (corporación de biotecnología de Beijing LabLead, Beijing, China) durante 2 días. ii) Posteriormente 40/20% de Percoll (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China) se utilizó como centrifugación de segundo paso para separar las células. Las células recolectadas se cultivaron de nuevo en medio de cultivo RPMI-1640 que contenía un 20% de suero fetal bovino, y se incubaron a 37°C bajo un 5% de atmósfera de CO2 hasta un 70-80% de confluencia. Las células fueron tratadas con TGF-β1 (adquirido de Shanghai Kexing Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) a 5 ng/ml durante 24 h. A continuación, las células se lavaron y procesaron. Se realizó un análisis inmunohistoquímico de E-cadherina, CK19 y vimentina antes y después del tratamiento con TGF-β1, como se describió anteriormente. La presencia o la presencia de estos marcadores se calificaron como positivos o negativos,respectivamente.

El análisis estadístico

P< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Características de los pacientes

Los 111 pacientes comprendieron 90 hombres y 21 mujeres, con una distribución de edad similar (40-80 años). Los pacientes fueron diagnosticados con cáncer de pulmón en estadio IV. Desde el punto de vista histológico, la mayoría de los casos fueron de tipo adenocarcinoma, seguidos de CPCP y CCE, tanto en hombres como en mujeres (tabla I). Sólo hubo dos casos de carcinoma adenosquamous eneste muestra del paciente. La mayoría de los pacientes recibieron quimioterapia, basada en quimioterapia con platino y docetaxel,mientras que a los pacientes con mutaciones de ganancia de función del receptor del factor de crecimiento epidérmico se les administró terapia con inhibidor de la tirosina cinasa (TKI) (Gefitinib). Solo un pequeño número de pacientes (5 hombres y 1 mujer)no recibieron estas terapias debido a limitaciones financieras.

Histología de los tumores primarios

Se examinaron inmunohistoquímicamente los tejidos tumorales de 111 pacientes para determinar la expresión de CK19. Si bien se observó una expresión elevada de CK19 en ciertos cánceres de pulmón, es probable que se asocie una pérdida de CK19 con la EMT (17). En el presente estudio, la expresión de CK19 estuvo ausente en muchos tumores de CPCP,>50% en hombres y 100% en mujeres. Como tal, la expresión de CK19 disminuyó de forma relativa en los tumores de CPCP en comparación con otros cáncer de pulmón (Fig. 1). De los adenocarcinomas, aproximadamente 31% de los tumores de pacientes varones fueron negativos para CK19, lo que fue mucho menor para las mujeres (7%).En general, los tejidos tumorales de CPCP mostraron más probabilidades de presentar características EMT (Cuadro I). Hubo una reducción aparente en la proporción de tumores primarios expresos negativos a CK19, así como de células de derrame pleural después de la terapia T, en comparación con tumores de pacientes no tratados o tratados con quimioterapia, en todos los tipos de cáncer de pulmón (Fig. 2).

Niveles de CIFRA21-1

Derrame sérico y pleural Los niveles de CIFRA21-1 se consideran marcadores importantes de malignidad para muchos tipos de cáncer, en particular para el cáncer de pulmón. Dado que CYFRA21-1 es un fragmento de CK19, examinamos los niveles séricos y pleurales de CIFRA21-1 en función de la pérdida de expresión de CK19 en las células de derrame pleural. Los resultados mostraron que cuando CK19 se expresaba fuertemente en las células de foco primario y derrame pleural,los niveles de CIFRA21-1 eran altos y cuando se perdía la expresión de CK19 en los tumores primarios y/o en las células de derrame pleural, los niveles de CIFRA21-1 disminuían significativamente en todos los tipos de cáncer (Fig. 3). Además, los niveles de CIFRA21-1 fueron mucho más altos en el derrame sérico y pleural de los pacientes con tumores de CCE con KK19 positivo en comparación con otros tipos de tumores(Fig. 2). Los altos niveles de CIFRA21-1 en sueros de pacientes con CCE y el derrame pleural probablemente reflejan la fuerte presencia de CK19 en tumores positivos (Fig. 1). Los resultados también sugirieron que los niveles de CYFRA21-1 de suero se elevaron solo marginalmente en los cáncer de pulmón en comparación con los niveles de base benignos (1,3–2,6 ng/ml), con la excepción del CCE, donde el aumento fue muy superior al rango normal (Fig. 3). Sin embargo, los niveles de CIFRA21-1 estuvieron muy elevados por encima del rango benigno (6,5–35 ng/ml)(18) en el derrame pleural de los pacientes con cáncer de pulmón, lo que indica que la medición del derrame pleural de CIFRA21-1 es un marcador tumoral óptimo.

Otros marcadores séricos

Marcadores de malignidad tumoral, como CA125,ACE, NSE y AFP, se midieron en los sueros de algunos de los pacientes y hubo una variación considerable entre los pacientes y las concentraciones.Por lo tanto, para los pacientes con ADC, el promedio de CA125, ACE, NSE y AFPWA 23.6±10.9, 48.3±39.7, 10.1±2.4, y 2,1±0,6, respectivamente. Para pacientes con CCE, el promedio de CA125, ACE, NSE y AFP fue de 57.1±31.5, 5.6±2.7, 20.8±2.5, y 2,6±0,4, respectivamente, Ninguno de los marcadores fue significativamente diferente del rango normal (Fig. 4).

La inducción de la EMT en células focales primarias por TGF-β1

TGF-β1 cuando se incubó con células tumorales pulmonares de foco primario creó cambios relevantes para la EMT, en muchos casos. Por lo tanto, casi el 40% de los tumores de adenocarcinoma, las células focales primarias con CK19 positivas fueron inducidas a perder la expresión de CK19 y someterse a EMT byTGF-β1. Esta proporción de tumores fue de 28% para el CCE y de 50% para el CPCP(Fig. 5). Por lo tanto, las células focales primarias de CPCP son inducibles a someterse a EMT por TGF-β1 más fácilmente. Como se mencionó anteriormente, las células primarias de CPCP muestran un nivel más alto de EMT, incluso sin inducción por TGF-β1 (tabla I).

Otro conjunto de marcadores importantes de EMT es la pérdida de cadherina y la ganancia de expresión de vimentina. La E-cadherina fue negativa en casi el 37,5% de las células tumorales primarias de adenocarcinoma,el 52,3% de las células tumorales de CCE y el 22% de las células tumorales de CPCP (Fig. 6), antes de tratar con TGF-β1. Por contraste, la expresión de vimentina en estos tumores fue positiva en el 23,2% de las células tumorales de adenocarcinoma, el 33,3% de las células tumorales de CCE y el 31,3% de las células tumorales de CPCP (Fig. 7). Tras el tratamiento de las células focales primarias tumorales de pulmón con TGF-β1, la pérdida de expresión de E-cadherina siempre se asoció con un aumento de la expresión de invimentina (Fig. 8). El porcentaje de tumores de CCE que mostraron esta respuesta al TGF-β1 (cambio del 40% en la expresión de E-cadherina y del 57% en la expresión de vimentina) es mayor que el de adenocarcinoma y CPCP (Fig. 6).

Discusión

El estado de expresión comparativo de CK19 en tejidos de cáncer de pulmón primario y en derrames pleurales puede ser útil para evaluar la capacidad metastásica de estas células cancerosas. Por lo tanto, si las células de derrame pleural del paciente con FIA tienen un nivel más alto de expresión negativa de CK19 en comparación con los tejidos de cáncer de pulmón primario del mismo paciente, se asume que la expresión negativa de CK19 está asociada con invasión y metástasis (19). Así, en el presente estudio, una gran proporción de pacientes con tumores de CPCP tenían tejido tumoral sin expresión de CK19 y las células de derrame pleural en estos pacientes mostraban una falta de expresión de CK19, lo que indica un alto grado de metástasis en este tipo de cáncer de pulmón, que es una característica típica del CPCP (20). Se han sugerido varias razones para la pérdida de expresión de CK19, incluida la expresión alterada y la degradación proteolítica mejorada(21).

Dado que CYFRA21-1 es un fragmento de CK19, los niveles séricos y de derrame pleural de CYFRA21-1 se consideran marcadores importantes de malignidad para muchos tipos de cáncer, en particular para el cáncer de pulmón (7,21). Sin embargo, es difícil estar seguro con respecto al diagnóstico de cáncer basado en los niveles circulantes de CIFRA21-1, ya que hay casos de cáncer de pulmón en los que hay una disminución de los niveles de CIFRA21-1, mientras que hay un aumento en otros casos (7,21).Sin embargo, a partir de los hallazgos actuales, los niveles séricos de CIFRA21-1 disminuyeron con el aumento de la posibilidad de EMT, detectada por pérdida de expresión de CK19 en derrames pleurales en comparación con el tejido tumoral primario correspondiente. Por lo tanto, los niveles séricos de CIFRA21-1 junto con el estado de expresión de CK19 de las células cancerosas a partir del foco primario y los derrames pleurales pueden identificar positivamente la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas de pulmón. Otros marcadores, como CA125, ACE, AFP y NSE, que se utilizan comúnmente para el diagnóstico de cáncer, no fueron consistentes en esta evaluación.

La capacidad de metástasis se otorga a las células cancerosas primarias a través de la EMT y uno de los factores primarios que pueden inducir la EMT es el TGF-β1. Aunque el TGF-β1 normalmente funciona como un inhibidor de la proliferación de células epiteliales, debido a las vías alteradas de señalización en muchas células cancerosas, el TGF-β1 actúa para mejorar la proliferación de células cancerosas, incluidas las células cancerosas de pulmón(22). Además de mejorar el crecimiento de las células cancerosas, se sabe que el TGF-β1 promueve la EMT en las células cancerosas y, por lo tanto, contribuye a la invasión y metástasis de las células cancerosas. Se ha sugerido que en las primeras etapas del desarrollo del tumor primario en tejidos epiteliales, el TGF-β1 actúa como inhibidor del crecimiento tumoral a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis (23,24).Sin embargo, a medida que se produce la progresión del tumor, durante las etapas más tardías del desarrollo tumoral, hay inactivación de la vía de señalización del TGF-ß1 o regulación aberrante del ciclo celular y las células cancerosas se vuelven resistentes a la inhibición del crecimiento por el TGF-β1(23,24). En estas condiciones, las células cancerosas utilizan el TGF-β1 como promotor del crecimiento (25). La expresión de ARNm y proteína de GF-β1 fue muy elevada en muchos tipos de cáncer, incluyendo el páncreas, colon, estómago, pulmón, endometrio, próstata,mama, cerebro y hueso (26).

Considerando que la propensión a someterse a EMT se ve reforzada en presencia de una citocina como la TGF-β1, que se sabe que es elevada en pacientes con cáncer de pulmón, examinamos la inducibilidad de EM de las células focales primarias, ex vivo, por TGF-β1.Según el marcador de TME empleado, los tumores de CPCP y CCE tenían una mayor capacidad para someterse a un TME inducido por TGF-β1. Las células focales primarias de CPCP son inducibles a someterse a EMT por TGF-β1 más fácilmente, si consideramos la pérdida de expresión de CK19. De hecho, hay un mayor grado de EMT, en términos de falta de CK19 en las células tumorales primarias de CPCP. Por contraste, las células primarias tumorales del CCE responden por la pérdida de expresión de E-cadherina y vimentina elevada. La regulación a la baja de la E-cadherina, junto con la regulación al alza de la N-cadherina, caracteriza el proceso EMT y estos cambios en la expresión de estas proteínas se asocian con la adquisición de resistencia a la apoptosis y al anoikis (27,28).

En resumen, los resultados del presente estudio sugieren que la invasión y metástasis de células tumorales pulmonares se pueden evaluar teniendo una imagen completa de la CIFRA21-1 sérica junto con el estado de expresión de CK19 de las células de foco primario y la efusión pleural. Esta evaluación puede mejorarse aún más examinando la propensión de las células de foco primarias aisladas a la TEM inducida por GF-β1 en cultivos celulares.

Agradecimientos

Los autores agradecen la asistencia técnica de los doctores Yong Chen y Jixin Jiang.

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