Cómo Realizar la Extracción de ADN de Manchas de Sangre Seca Utilizando Resina Chelex

Todo biólogo que quiera analizar el ADN sabe que el proceso comienza con la extracción de ADN de células de interés. Estas células podrían ser glóbulos rojos, parásitos o bacterias, por nombrar algunas. Además, hay varios métodos de extracción de DNA entre los que elegir, dependiendo del tipo de muestra, el análisis posterior, etc. Muchos científicos comienzan con manchas de sangre seca (DBS), por lo que la forma de extraer ADN de dichas muestras es de particular interés. Un DBS se prepara comúnmente, recolectando sangre en una tarjeta FTA de Whatman2 o papel de filtro cromatográfico de 3 mm de Whatman, y dejándolo secar durante un período de tiempo (~4 horas) antes de procesarlo. Este método de muestreo biológico se ha utilizado durante décadas.

A continuación se describe un método útil para aislar el ADN de dichas muestras utilizando BT Chelex 100 Resin3.

Primer paso: Lisis de eritrocitos

• Cortar una mancha de sangre seca y colocarla en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml) con un perforador. No olvide etiquetar el tubo, especialmente cuando trabaje con varias muestras. Para fines de control de calidad, también incluya una mancha de sangre de control positivo.
• Añadir 1 ml de saponina al 0,5% en el tubo de microcentrífuga que contiene la mancha de sangre. Cierre, vórtice e incube a 40 ° C durante al menos 4 horas, o mejor aún, durante la noche. En este paso, la saponina se complica con el colesterol en la membrana de los eritrocitos, lo que conduce a la formación de poros en la membrana y, por lo tanto, a la hemólisis.4 La saponina es un reactivo de lisis de uso común para liberar parásitos (por ejemplo, parásitos de la malaria) de los glóbulos rojos.
• Girar durante unos segundos a 4.000 rpm, para eliminar las gotas de la tapa interior, y aspirar la saponina del tubo utilizando una punta de pipeta sin barrera unida a una pipeta pasteur en una máquina de ensamblaje al vacío. También se puede utilizar una pipeta pasteur de plástico. Deje el lugar en el tubo de microcentrífuga.

Paso dos: Lavado

• Agregue 1 ml de solución salina tamponada con fosfato en la microcentrífuga, cierre, vórtice e incube a 4 0 ° C durante 20-30 minutos. Incubar durante la noche no causará ningún daño. Este paso asegura que la saponina se elimine del tubo.
• Gire durante unos segundos a 4.000 rpm, y luego retire el PBS, de la misma manera que eliminó la saponina. Deje el lugar en el tubo de microcentrífuga.

Paso tres: Extracción de ADN con resina Chelex

Principio: La resina Chelex actúa impidiendo la degradación del ADN a partir de enzimas degradadoras (DNasas) y de contaminantes potenciales que podrían inhibir los análisis posteriores. En general, la resina Chelex atrapará dichos contaminantes, dejando el ADN en solución. La resina Chelex detiene cationes como Mg2+, un cofactor importante para la acción de la DNasa, protegiendo así el ADN de la degradación.5,6

• Pipeta y agregue 150µL de solución de resina Chelex al 6,7% en el tubo de microcentrífuga que contiene el punto. Cierra el tubo. Un recordatorio importante: al preparar la solución de Chelex al 6,7%, use agua que esté libre de DNasas, nucleasas (o cualquier cosa que pueda dañar y degradar el ADN).
• Incubar a 95 0C durante 10 minutos utilizando un bloque de calor/ agitador. Es importante abrir el tubo dos veces, cada 2 minutos, para liberar presión, y luego agitar durante unos segundos a partir de entonces. Esto libera ADN en solución.

Paso Cuatro: Evitar las perlas de resina Chelex en el Extracto final

• Girar durante 5 minutos a 4.000 rpm
• Pipetear la mayor cantidad de extracto posible en un tubo de microcentrífuga más pequeño (0,6 ml) utilizando una punta de barrera para aerosoles, evitando la transferencia de las perlas Chelex.
• Centrifugar la microcentrífuga de 0,6 ml a 4.000 rpm durante 10 minutos. La idea del segundo giro es eliminar cualquier resto de cuentas de Quelex que puedan transferirse al extracto final. ¿Por qué es importante? Dos razones principales: 1) Quelex se une a iones de magnesio (cofactor esencial para la polimerasa Taq utilizada en PCR) y 2) fluorescencia Quelex. Si la fluorescencia es su forma de visualizar un resultado, esto puede crear un falso positivo.
• Pipetee aproximadamente 100 µL y transfiera el extracto final a una nueva microcentrífuga. Etiquetar y conservar en nevera.

Algunos Consejos Mientras realiza extracciones de ADN

• Trabaje en un ambiente limpio y libre de contaminantes
• Use puntas de pipeta libres de nucleasas
• Manipule todas las muestras con guantes
• De nuevo, evite las cuentas de Chelex en su extracto final

Conclusión

Chelex resin7, proporciona un método de extracción de ADN simple y rápido a partir de DBS, para su uso en diversas aplicaciones analíticas moleculares. Este método no requiere equipo costoso y es confiable cuando se prueba con otros métodos.

1. GE Healthcare (2010). Extracción fiable de ADN de Tarjetas TLC Whatman. Nota de solicitud 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Reino Unido: GE Healthcare.
2. Whatman (n.d.). Preparando un disco de TLC para Análisis de ADN. Protocolo de TLC Whatman BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 y Chelex 20 Resina de Intercambio Iónico Quelante Manual de instrucciones. LIT200RevB. Hercules, CA: Laboratorios Bio-Rad.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). La hemólisis de eritrocitos humanos con saponina afecta la estructura de la membrana. Acta Histochemica, 102 (1), 21-35.
5. IBRC (2016). Protocolo de extracción: Chelex. Sitio web del IBRC. Retrieved from http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (n.d.). Desarrollo y Validación Interna de un Protocolo de Extracción de ADN Chelex ® para Hisopos Orales de Referencia.
7. Walsh, P. S., Metzger, D. A., and Higuchi,R. (2013). Gema Chelex 100 de 30 Años de Biotecnología como Medio para la Extracción Simple de ADN para Mecanografía Basada en PCR a partir de Material Forense. Biotécnicas, 54(3), 134-139.