ADN tumoral circulante

Consideraciones preanalíticaseditar

Cuando la sangre se recoge en tubos de EDTA y se almacena, los glóbulos blancos comienzan a lisar y liberar ADN genómico de tipo salvaje en la muestra en cantidades que, por lo general, son muchas veces más altas que las que contiene el ADNct. Esto dificulta la detección de mutaciones u otros biomarcadores de ADNct. El uso de tubos de estabilización celular disponibles en el mercado puede prevenir o retrasar la lisis de los glóbulos blancos, reduciendo así el efecto de dilución del ADNct. Sherwood et al demostraron una detección superior de mutaciones en KRAS en muestras coincidentes colectadas en tubos BCT de EDTA K3 y Streck. Las ventajas de los tubos de estabilización celular se pueden aprovechar en situaciones en las que la sangre no se puede procesar en plasma inmediatamente.

Otros procedimientos también pueden reducir la cantidad de ADN de tipo salvaje «contaminante» y hacer más factible la detección del ADNct:

• Nunca congele una muestra de sangre antes de extraer el plasma para el análisis de ADNct
• Procese la muestra en plasma dentro de 2-4 horas (si se recoge en un tubo EDTA)
• Nunca use tubos heparinizados, la heparina inhibe la PCR imitando la estructura helicoidal del ADN
• Realice un paso de centrifugación doble (centrifugeé la sangre para eliminar el plasma, en el plasma para eliminar los residuos en la parte inferior del tubo) para eliminar más residuos celulares antes de la extracción de ADN.
• El plasma es mejor que el suero para la recuperación de ADNct

Extracción de ADNCTEDITAR

El principal atractivo del análisis de ADNct es que se extrae de manera no invasiva a través de la recolección de sangre. La adquisición de cfDNA o ctDNA generalmente requiere la recolección de aproximadamente 3 ml de sangre en tubos recubiertos con EDTA. El uso de EDTA es importante para reducir la coagulación de la sangre. Las fracciones plasmáticas y séricas de sangre se pueden separar mediante una etapa de centrifugación. ctadn o cfDNA puede ser posteriormente se extrae de estas fracciones. Aunque suero tiende a tener mayores niveles de cfDNA, esto se atribuye principalmente al ADN de los linfocitos. Los niveles altos de ADNCC contaminante no son óptimos porque esto puede disminuir la sensibilidad de la detección de ADNCCT. Por lo tanto, la mayoría de los estudios utilizan plasma para el aislamiento del ADNct. El plasma se procesa de nuevo por centrifugación para eliminar las células sanguíneas intactas residuales. El sobrenadante se utiliza para la extracción de ADN, que se puede realizar utilizando kits disponibles en el mercado.

Análisis del ADNCTEDITAR

El análisis del ADNct después de la extracción requiere el uso de varios métodos de amplificación y secuenciación. Estos métodos se pueden separar en dos grupos principales en función de si el objetivo es interrogar todos los genes en un enfoque no dirigido, o si el objetivo es monitorear genes y mutaciones específicos en un enfoque dirigido.

Enfoques no orientadoseditar

Es posible que se necesiten enfoques de secuenciación de genoma completo o de exoma completo para descubrir nuevas mutaciones en el ADN tumoral mientras se monitorea la carga de la enfermedad o se hace un seguimiento de la resistencia a los medicamentos. Los enfoques no dirigidos también son útiles en la investigación para observar la heterogeneidad tumoral o para descubrir nuevos objetivos farmacológicos. Sin embargo, si bien los métodos no dirigidos pueden ser necesarios en ciertas aplicaciones, son más caros y tienen una resolución más baja. Esto hace que sea difícil detectar mutaciones raras, o en situaciones en las que los niveles bajos de ADNct están presentes (como la enfermedad residual mínima). Además, puede haber problemas para distinguir entre el ADN de las células tumorales y el ADN de las células normales utilizando un enfoque de genoma completo.

La secuenciación del genoma completo o del exoma suele utilizar tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento. Limitar la secuenciación a todo el exoma en su lugar puede disminuir el gasto y aumentar la velocidad, pero a costa de perder información sobre mutaciones en las regiones reguladoras no codificantes del ADN. Si bien el simple hecho de observar los polimorfismos de ADN a través de la secuenciación no diferencia el ADN del tumor o de las células normales, este problema se puede resolver comparándolo con una muestra de control de ADN normal (por ejemplo, ADN obtenido a través de un hisopo bucal). Es importante destacar que la secuenciación de todo el genoma y el exoma son útiles para el descubrimiento inicial de mutaciones. Esto proporciona información para el uso de técnicas específicas más sensibles, que luego pueden utilizarse con fines de vigilancia de enfermedades.

La secuenciación del genoma completo permite recuperar las propiedades estructurales del ADNcf, el tamaño de los fragmentos y sus patrones de fragmentación. Estos patrones únicos pueden ser una fuente importante de información para mejorar la detección del ADNct o localizar el tejido de origen de estos fragmentos. La selección del tamaño de fragmentos cortos (<150 pp) con métodos in vitro o in silico podría mejorar la recuperación de mutaciones y aberraciones en el número de copias.

Cariotipo digitaleditar

Este método fue desarrollado originalmente por el laboratorio de Bert Vogelstein, Luis Díaz y Victor Velculescu en la Universidad Johns Hopkins. A diferencia del cariotipado normal, donde se usa un tinte para teñir bandas cromosómicas con el fin de visualizar los cromosomas, el cariotipado digital utiliza secuencias de ADN de loci en todo el genoma para calcular la variación del número de copias. Las variaciones en el número de copias son comunes en los cánceres y describen situaciones en las que la pérdida de heterocigosidad de un gen puede conducir a una disminución de la función debido a una expresión más baja, o a la duplicación de un gen, lo que conduce a la sobreexpresión.

Análisis personalizado de extremos reordenados (PARE)Editar

Después de secuenciar todo el genoma utilizando un método de secuenciación de alto rendimiento, como Illumina HiSeq, el PARE se aplica a los datos para analizar reordenamientos y translocaciones cromosómicas. Esta técnica se diseñó originalmente para analizar ADN tumoral sólido, pero se modificó para aplicaciones de ADNct.

Metilación del ADN e hidroximetilacióneditar

El marcado epigenético adecuado es esencial para la expresión génica normal y la función celular, y las alteraciones aberrantes en los patrones epigenéticos son un sello distintivo del cáncer. Un estado epigenético normal se mantiene en una célula al menos en parte a través de la metilación del ADN. La medición de patrones de metilación aberrantes en el ADNct es posible debido a la metilación estable de regiones de ADN denominadas «islas CpG». La metilación del ADNct se puede detectar mediante el tratamiento con bisulfito. El tratamiento con bisulfito convierte químicamente las citosinas no metiladas en un uracilo mientras deja las citosinas metiladas sin modificar. El ADN es secuenciado posteriormente, y cualquier alteración en el patrón de metilación del ADN puede ser identificada. La hidroximetilación del ADN es una marca relacionada de manera similar que ha demostrado ser un marcador predictivo de afecciones saludables versus enfermedades en el adNFC, incluido el cáncer. La medición de patrones de hidroximetilación aberrantes en el ADNct ha sido probada por investigadores de la Universidad de Chicago (Chuan He lab), de la Universidad de Stanford (Quake lab) y de la empresa Cambridge Epigenetix.

Enfoques selectivoseditar

En un enfoque dirigido, la secuenciación del ADNct se puede dirigir hacia un panel genético construido sobre la base de puntos críticos mutacionales para el cáncer de interés. Esto es especialmente importante para informar el tratamiento en situaciones en las que se identifican mutaciones en dianas medicables. También es posible personalizar el análisis dirigido del ADNct para cada paciente combinando biopsias líquidas con biopsias de tejido primario estándar. La secuenciación del genoma completo o del exoma completo de la biopsia del tumor primario permite el descubrimiento de mutaciones genéticas específicas del tumor de un paciente y se puede utilizar para la secuenciación dirigida posterior del ADNct del paciente. La mayor sensibilidad de detección de ADNct se logra a través de la secuenciación dirigida de polimorfismos de nucleótido único (SNP) específicos. Los genes comúnmente mutados, como los oncogenes, que por lo general tienen mutaciones hotspot, son buenos candidatos para enfoques de secuenciación dirigidos. Por el contrario, la mayoría de los genes supresores de tumores tienen una amplia gama de posibles mutaciones de pérdida de función en todo el gen y, como tales, no son adecuados para la secuenciación dirigida.

Los enfoques dirigidos tienen la ventaja de amplificar el ADNct a través de reacciones en cadena de polimerasa (PCR) o PCR digital. Esto es especialmente importante cuando se analiza el ADNct, no solo porque hay niveles relativamente bajos de ADN circulando en el torrente sanguíneo, sino también porque el ADNct constituye una pequeña proporción del ADN libre de células total extraído. Por lo tanto, la amplificación de las regiones de interés puede mejorar drásticamente la sensibilidad de la detección de ADNct. Sin embargo, la amplificación a través de PCR puede introducir errores dada la tasa de error inherente de las ADN polimerasas. Los errores introducidos durante la secuenciación también pueden disminuir la sensibilidad para detectar mutaciones en el ADNct.

PCR Digital de gotas (ddPCR)Editar

Este método se deriva de la PCR digital, originalmente nombrada por el grupo de Bert Vogelstein en la Universidad Johns Hopkins. La PCR digital de gotas utiliza un generador de gotas para dividir piezas individuales de ADN en gotas utilizando una emulsión de aceite / agua. Luego se producen reacciones en cadena de polimerasa individuales en cada gota utilizando cebadores seleccionados contra regiones de ADNct y se procede al punto final. La presencia de las secuencias de interés se mide mediante sondas fluorescentes, que se unen a la región amplificada. ddPCR permite una evaluación altamente cuantitativa de las frecuencias de alelos y mutantes en el ADNct, pero está limitada por el número de sondas fluorescentes que se pueden usar en un ensayo (hasta 5). La sensibilidad del ensayo puede variar dependiendo de la cantidad de ADN analizada y es de alrededor de 1 en 10.000.

Perlas, Emulsificación, Amplificación y Magnetismo (Barrado)Editar

Esta técnica se basa en la PCR Digital de Gotas para identificar mutaciones en el ADNct mediante citometría de flujo. Después de extraer el ADNct de la sangre, la PCR se realiza con cebadores diseñados para apuntar a las regiones de interés. Estos cebadores también contienen secuencias de ADN específicas, o etiquetas. El ADN amplificado se mezcla con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina y se emulsiona en gotitas. Los cebadores biotinilados diseñados para unirse a las etiquetas se utilizan para amplificar el ADN. La biotinilación permite que el ADN amplificado se una a las perlas magnéticas, que están recubiertas con estreptavidina. Una vez completada la PCR, las perlas unidas al ADN se separan mediante un imán. El ADN de las perlas se desnaturaliza y se permite hibridar con oligonucleótidos fluorescentes específicos de cada plantilla de ADN. Los complejos de ADN-PERLA resultantes se analizan mediante citometría de flujo. Esta técnica es capaz de capturar frecuencias de alelos y mutaciones debido al acoplamiento con ddPCR. Sin embargo, a diferencia del ddPCR, se puede interrogar un mayor número de secuencias de ADN debido a la flexibilidad de usar sondas unidas fluorescentemente. Otra ventaja de este sistema es que el ADN aislado también se puede utilizar para secuenciar aguas abajo. La sensibilidad es de 1,6 en 104 a 4,3 en 105.

Perfil personalizado del cáncer mediante secuenciación profunda (CAPP-Seq)Editar

Este método fue descrito originalmente por los grupos de Ash Alizadeh y Maximilian Diehn en la Universidad de Stanford. Esta técnica utiliza sondas selectoras de oligonucleótidos biotinilados para apuntar secuencias de ADN relevantes para la detección de ADNct. Se utilizaron bases de datos de cáncer disponibles al público para construir una biblioteca de sondas contra mutaciones recurrentes en el cáncer mediante el cálculo de su índice de recurrencia. El protocolo se optimizó para los bajos niveles de ADN observados en la colección de ADNct. Luego, el ADN aislado se somete a una secuenciación profunda para aumentar la sensibilidad. Esta técnica permite la interrogación de cientos de regiones de ADN. Se informa que la sensibilidad de detección de ADNct de CAPP-Seq es de 2,5 moléculas en 1.000.000.

Secuenciación profunda del AMplicón etiquetado (TAM-Seq)Editar

TAM-Seq permite la secuenciación dirigida de genes enteros para detectar mutaciones en el ADNct. En primer lugar, se realiza un paso de amplificación general utilizando cebadores que abarcan todo el gen de interés en secciones de 150 a 200 bp. Luego, se utiliza un sistema de microfluidos para unir adaptadores con un identificador único a cada amplicón para amplificar aún más el ADN en reacciones paralelas de un solo complejo. Esta técnica demostró identificar con éxito mutaciones dispersas en el gen supresor tumoral TP53 en pacientes con cáncer de ovario avanzado. La sensibilidad de esta técnica es de 1 en 50.

Secuenciación segura (Safe-Seq)Editar

Este método fue descrito originalmente por Bert Vogelstein y su grupo en la Universidad Johns Hopkins. Safe-Seq disminuye la tasa de error de la secuenciación paralela masiva para aumentar la sensibilidad a los mutantes raros. Esto se logra mediante la adición de una secuencia de identificador único (UID) a cada plantilla de ADN. El ADN se amplifica usando los UID añadidos y se secuencian. Todas las moléculas de ADN con el mismo UID (una familia de UID) deben tener la misma secuencia de ADN ya que se amplificaron a partir de una molécula. Sin embargo, las mutaciones se pueden introducir a través de la amplificación, o se pueden llamar asignaciones de bases incorrectas en los pasos de secuenciación y análisis. La presencia del UID permite separar estos errores metodológicos de las mutaciones verdaderas del ADNct. Una mutación se considera un «supermutante» si el 95% de las lecturas secuenciadas están de acuerdo. La sensibilidad de este enfoque es de 9 en 1 millón.

Secuenciación duplex Edit

Este método es una mejora de los UID individuales añadidos en la técnica Safe-Seq. En la secuenciación dúplex, el ADN de doble cadena aleatorio actúa como etiquetas únicas y se adjunta a un espaciador invariante. Las etiquetas se unen a ambos extremos de un fragmento de ADN (etiquetas α y β), lo que da como resultado dos plantillas únicas para PCR: una hebra con una etiqueta α en el extremo de 5′ y una etiqueta β en el extremo de 3′ y la otra hebra con una etiqueta β en el extremo de 5′ y una etiqueta α en el extremo de 3′. Estos fragmentos de ADN se amplifican con cebadores contra las secuencias invariantes de las etiquetas. El ADN amplificado es secuenciado y analizado. El ADN con los adaptadores dúplex se comparan y las mutaciones solo se aceptan si hay un consenso entre ambas hebras. Este método tiene en cuenta tanto los errores de secuenciación como los errores de amplificación de PCR en etapas tempranas. La sensibilidad del enfoque para descubrir mutantes es de 1 en 10^7.

Supresión de errores Digitales Integrados (IDEs)-CAPP-SeqEdit mejorado

IDEs mejora el análisis CAPP-Seq del ADNc para disminuir los errores y, por lo tanto, aumentar la sensibilidad de detección. Según se informó en 2016, IDEs combina CAPP-Seq con tecnología de secuenciación de códigos de barras dúplex y con un algoritmo computacional que elimina los errores estereotipados asociados con el paso de hibridación CAPP-Seq. El método también integra la secuenciación dúplex cuando es posible e incluye métodos para una recuperación dúplex más eficiente del ADN libre de células. La sensibilidad de esta versión mejorada de CAPP-Seq es de 4 en 100.000 copias.