microscopie is standaard een techniek die ons in staat stelt om biologische gebeurtenissen te observeren in plaats van te meten en conclusies te trekken op basis van wat we zien, in plaats van op basis van enkele berekeningen. Het onderwerp van dit artikel kan daarom een beetje verrassend lijken omdat het gaat over de metingen van colokalisatie. Hoewel er situaties zijn waarin u de eiwitcolokalisatie visueel kunt bepalen, is een nauwkeurigere bevestiging van een Wederzijdse verdeling van twee sondes vaak noodzakelijk.
Waarom is een visuele bepaling van Colokalisatie onvoldoende?
alleen als u beelden hebt verzameld volgens een gecontroleerd protocol voor colokalisatie analyse (voldoende signaal in elk kanaal, geen autofluorescentie of signaaldoorloop) is het veilig om te zeggen dat de twee sondes colokaliseren uitsluitend op basis van observatie. In dit geval, als het groene signaal colocalizeert met het rode signaal en het beeld meestal geel is, is geen statistische meting nodig. Maar als je geen overlapping ziet, betekent dat niet dat het er niet is! Het kan zijn dat de intensiteit van de twee kanalen niet hetzelfde is. Namelijk, de tussenliggende kleur die we zien kan alleen verschijnen als beide sondes van dezelfde intensiteit zijn. Daarom kunnen conclusies op basis van visuele bepaling vaak leiden tot vals negatieve resultaten.
welke methoden voor het meten van overlappingen bestaan er?
hoewel er niet één standaardbenadering is, zijn er twee methoden die op grote schaal worden gebruikt en algemeen worden aanvaard. Deze omvatten ofwel Pearson ’s correlation coefficient (PCC) of Mander’ s colocalization coefficient (MCC).
deze twee methoden hebben betrekking op twee verschillende aspecten van colokalisatie – correlatie en co-voorkomen. Pearson ‘ s coëfficiënt is gerelateerd aan de correlatie van de pixel intensiteiten in de twee kanalen. Het meet de relatie tussen signalen – of de signaalwaarden in het ene kanaal tegelijkertijd stijgen met het andere, of het ene signaal valt wanneer het andere stijgt. Correlatie is verschillend van co-voorkomen, die wiskundig wordt uitgedrukt door Mander ‘ s coëfficiënt. Dit vertegenwoordigt de dekking van het ene signaal over het andere, die de mate waarin twee sondes bezetten dezelfde plaats onthult. Laten we dit een beetje verder onderzoeken.
Pearson ‘ s Correlation Coefficient (PCC)
definitie: PCC geeft de lineaire relatie tussen signaalsterkte weer. De waarden kunnen variëren tussen 1 (perfecte positieve correlatie) en -1 (perfecte negatieve correlatie), terwijl 0 betekent dat er geen correlatie is. Het is mogelijk om PCC visueel te verkennen door middel van een scattergram waar de coördinaten op de plot pixelwaarden (signaal) in beide kanalen vertegenwoordigen. Hoe meer stippen rond een rechte lijn clusteren, hoe beter de correlatie tussen de twee signalen
Requirements: de PCC moet worden gemeten in de regio van belang (ROI) om valse positieven of negatieven te voorkomen. Als het meten van PCC over het gehele beeld, pixels van de achtergrond perfect correleren en opblazen van de PCC. In tegenstelling, als de meting wordt uitgevoerd in een gebied van geen belang waar er een heterogene verdeling van beide kanalen, zal de PCC worden gedrukt.
u kunt ROI met de hand of door drempelwaarde selecteren om achtergrond uit te sluiten. Hoe je het ook doet, wees voorzichtig, vooral bij het dorsen. De selectie van de ROI moet alle relevante gebieden van de cel(s) omvatten, d.w.z. elke plaats waar een sonde kan worden verwacht te verspreiden. Als u een op intensiteit gebaseerde methode gebruikt voor het selecteren van ROI (thresholding), kunt u per ongeluk relevante resultaten uitsluiten. Hoe kan dit gebeuren? Je zou een gebied van wederzijdse uitsluiting kunnen hebben, waar geen van beide labels verschijnt, en dit kan een biologisch relevant resultaat zijn (beide moleculen worden niet uitgedrukt op die plaats in de cel). Echter, thresholoding zal niet deze regio in de ROI, waardoor u in gevaar van het verliezen van relevante resultaten.
aanbevolen voor: PCC moet worden gebruikt op beelden waar er een lineair verband is tussen intensiteiten. Als de gegevens passen bij een complexer model, zal PCC niet goed presteren. Een andere methode moet ook worden gekozen als er een ongelijke overlap, waar sondes co-distribueren, maar in verschillende verhoudingen. Dit kan voorkomen wanneer GFP als één sonde wordt gebruikt. Het expressieniveau kan verschillen tussen cellen, en potentieel depressie van PCC veroorzaken toe te schrijven aan hoge intercellvariabiliteit.
Mander ‘ s Colocalization Coefficients
definitie: MCC is een metriek die co-occurrence beschrijft – de fractie van een eiwit dat colocalizeert met het andere. MCC geeft je een goede maat voor colokalisatie als je een eiwit in een blaasje labelt en wilt zien hoe het colokaliseert met een bepaalde structuur in een cel, bijvoorbeeld een microtubule. Als we aannemen dat alle blaasjes colokaliseren met microtubules maar slechts een deel van microtubules colokaliseert met het blaasjesje, kunt u MCC voor elk kanaal berekenen en een metriek krijgen die kwantitatief deze fractionele overlap beschrijft.
vereisten: de vangst met MCC is dat het de verwijdering van achtergrond vereist. Het lastigste deel hier is het instellen van een cutoff punt voor intensiteit die de achtergrond Aftrekken in staat zal stellen. MCC meet de volledige fluorescentie van één sonde in elke pixel boven nul. Echter, boven nul pixels zijn uiterst zeldzaam, als gevolg van factoren zoals: autofluorescentie, lichte lekkage, niet-specifieke etikettering of fluorescentie van onscherpe beeldvlaktes. De meting van MCC vereist daarom een zorgvuldige selectie van de drempel (cutoff).
de eerste manier om dit te doen is globale drempelwaarde, waarbij u een drempelwaarde van elke pixel aftrekt, zodat elk niveau onder de geselecteerde cutoff achtergrond zal zijn en elke pixel daarboven in een gebied van belang zal vallen. Hoewel dit zeer intuã tief is, is global thressing nogal ruw en kan leiden tot ongewenste situaties zoals de uitsluiting van de lage waarde pixels die dicht bij de achtergrond liggen, maar in feite positief zijn.
een meer automatische en minder subjectieve optie is de Costes-methode waarbij de drempelwaarde wordt geschat door PCC meerdere keren te berekenen. Dit dient om het bereik van pixelwaarden te definiëren die positief zijn en daarom niet mogen worden uitgesloten. PCC wordt berekend voor verschillende groepen pixels en de pixelwaarden waarvoor PCC gelijk is aan of dicht bij nul worden als drempelwaarden genomen. Niettemin moet het ook visueel worden gecontroleerd, omdat in beelden met een lagere signaal-ruisverhouding het een zeer laag drempelniveau kan identificeren zodat het gelabelde structuren niet van de achtergrond onderscheidt.
aanbevolen voor: wanneer de biologische vraag van uw experiment betrekking heeft op de mate waarin eiwitten/structuren elkaar overlappen, moet MCC de maat van keuze zijn. Deze coëfficiënten worden intuïtiever geà nterpreteerd dan PCC, en zijn onafhankelijk van signaalproportionaliteit (de verschillen in het aantal structuren die door elke sonde worden geëtiketteerd).
voordat u begint met uw analyse
welke keuze u ook kiest voor het meten van colokalisatie, het is zeer belangrijk dat de beeldverzameling op de juiste manier wordt uitgevoerd. Probeer zoveel mogelijk factoren te beheersen en bereid een set controlemonsters voor waarmee u zoveel mogelijk variabelen kunt controleren.
houd er rekening mee dat de bepaling van de visuele colokalisatie wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder de subjectiviteit van de waarnemer, het feit dat de hersenen van elk individu kleuren anders kunnen zien, een mogelijke kleurenblindheid van de waarnemer, en de ruimtelijke resolutie die de pixelgrootte bepaalt, onder andere. Zorg ervoor dat u de afbeeldingen die u op het punt staat te analyseren op een uniforme manier verwerkt, en houd er rekening mee dat elke ongecontroleerde manipulatie ervoor kan zorgen dat u relevante informatie verliest.
en Last but Not Least
deze berekeningen worden geïmplementeerd in de meeste softwarepakketten voor beeldanalyse, bijvoorbeeld ImageJ en Volocity. Maar gezien het feit dat het meten van colokalisatie nog steeds een enigszins verwarrend veld is, zijn verbeteringen nodig, dus blijf op de hoogte van de nieuwe versies en pakketten voor de software.
hoe meet u colokalisatie? Laat het ons weten door te schrijven in de commentaren sectie!
literatuur:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Een praktische gids voor het evalueren van colokalisatie in biologische microscopie. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Colocalization Analysis in Fluorescence Microscopy. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, pp. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistische tests voor metingen van colokalisatie in biologische microscopie. Journal of microscopy. 2013; 252(3): 295-302
heeft dit je geholpen? Dan kunt u delen met uw netwerk.