Zirkulierende Tumor-DNA

Präanalytische Überlegungen

Wenn Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt und gelagert wird, beginnen die weißen Blutkörperchen zu lysieren und genomische Wildtyp-DNA in Mengen in die Probe freizusetzen, die typischerweise um ein Vielfaches höher sind, als die ctDNA vorhanden ist. Dies erschwert den Nachweis von Mutationen oder anderen ctDNA-Biomarkern. Die Verwendung von handelsüblichen Zellstabilisierungsröhrchen kann die Lyse weißer Zellen verhindern oder verzögern, wodurch der Verdünnungseffekt der ctDNA verringert wird. Zeigten einen überlegenen Nachweis von KRAS-Mutationen in übereinstimmenden Proben, die sowohl in EDTA K3- als auch in Streck-BCT-Röhrchen gesammelt wurden. Die Vorteile von Zellstabilisierungsröhrchen können in Situationen realisiert werden, in denen Blut nicht sofort zu Plasma verarbeitet werden kann.

Andere Verfahren können auch die Menge an „kontaminierender“ Wildtyp-DNA reduzieren und den Nachweis von ctDNA erleichtern:

• Niemals eine Blutprobe einfrieren, bevor das Plasma für die ctDNA-Analyse extrahiert wird
• Die Probe innerhalb von 2-4 Stunden zu Plasma verarbeiten (wenn in einem EDTA-Röhrchen gesammelt)
• Niemals heparinisierte Röhrchen verwenden, Heparin hemmt die PCR, indem es die helikale Struktur der DNA nachahmt
• Führen Sie einen doppelten Zentrifugationsschritt durch (zentrifugieren Sie das Blut, um b. auf dem Plasma, das von Ablagerungen im Boden des Röhrchens entfernt werden soll), um mehr Zelltrümmer vor der DNA-Extraktion zu entfernen.
• Plasma ist besser als Serum für die ctDNA-Wiederherstellung

Extraktion von ctDNAEdit

Der Hauptanreiz der ctDNA-Analyse besteht darin, dass sie auf nicht-invasive Weise durch Blutentnahme extrahiert wird. Der Erwerb von cfDNA oder ctDNA erfordert typischerweise die Entnahme von ungefähr 3 ml Blut in EDTA-beschichtete Röhrchen. Die Verwendung von EDTA ist wichtig, um die Blutgerinnung zu reduzieren. Die Plasma- und Serumfraktionen von Blut können durch einen Zentrifugationsschritt getrennt werden. Aus diesen Fraktionen kann anschließend ctDNA oder cfDNA extrahiert werden. Obwohl Serum tendenziell höhere cfDNA-Spiegel aufweist, wird dies hauptsächlich auf DNA aus Lymphozyten zurückgeführt. Hohe Konzentrationen an kontaminierender cfDNA sind suboptimal, da dies die Empfindlichkeit des ctDNA-Nachweises verringern kann. Daher verwenden die meisten Studien Plasma zur ctDNA-Isolierung. Plasma wird dann wieder durch Zentrifugation verarbeitet, um restliche intakte Blutzellen zu entfernen. Der Überstand wird zur DNA-Extraktion verwendet, die mit handelsüblichen Kits durchgeführt werden kann.

Analyse von ctDNAEdit

Die Analyse von ctDNA nach Extraktion erfordert die Verwendung verschiedener Amplifikations- und Sequenzierungsmethoden. Diese Methoden können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden, je nachdem, ob das Ziel darin besteht, alle Gene in einem ungezielten Ansatz abzufragen, oder ob das Ziel darin besteht, bestimmte Gene und Mutationen in einem gezielten Ansatz zu überwachen.

Ungezielte Ansätze

Ansätze zur Sequenzierung des gesamten Genoms oder des gesamten Exoms können erforderlich sein, um neue Mutationen in der Tumor-DNA zu entdecken und gleichzeitig die Krankheitslast zu überwachen oder die Arzneimittelresistenz zu verfolgen. Ungezielte Ansätze sind auch in der Forschung nützlich, um die Tumorheterogenität zu beobachten oder neue Wirkstoffziele zu entdecken. Während ungezielte Methoden in bestimmten Anwendungen erforderlich sein können, sind sie jedoch teurer und haben eine geringere Auflösung. Dies erschwert den Nachweis seltener Mutationen oder in Situationen, in denen niedrige ctDNA-Spiegel vorhanden sind (z. B. minimale Restkrankheit). Darüber hinaus kann es Probleme geben, zwischen DNA aus Tumorzellen und DNA aus normalen Zellen unter Verwendung eines gesamten Genomansatzes zu unterscheiden.

Die Sequenzierung des gesamten Genoms oder Exoms verwendet typischerweise DNA-Sequenzierungstechnologien mit hohem Durchsatz. Die Begrenzung der Sequenzierung auf nur das gesamte Exom kann stattdessen die Kosten verringern und die Geschwindigkeit erhöhen, jedoch auf Kosten des Verlusts von Informationen über Mutationen in den nicht kodierenden regulatorischen Regionen der DNA. Während das einfache Betrachten von DNA-Polymorphismen durch Sequenzierung die DNA nicht von Tumor- oder normalen Zellen unterscheidet, kann dieses Problem durch Vergleich mit einer Kontrollprobe normaler DNA (z. B. DNA, die durch einen bukkalen Abstrich erhalten wurde) gelöst werden.) Wichtig ist, dass die Sequenzierung des gesamten Genoms und des gesamten Exoms für die anfängliche Mutationsentdeckung nützlich ist. Dies liefert Informationen für die Verwendung empfindlicherer gezielter Techniken, die dann zur Überwachung von Krankheiten verwendet werden können.

Die Sequenzierung des gesamten Genoms ermöglicht es, die strukturellen Eigenschaften von cfDNA, die Größe von Fragmenten und ihre Fragmentierungsmuster wiederherzustellen. Diese einzigartigen Muster können eine wichtige Informationsquelle sein, um den Nachweis von ctDNA zu verbessern oder das Ursprungsgewebe dieser Fragmente zu lokalisieren. Die Größenselektion kurzer Fragmente (< 150bp) mit In-vitro- oder In-silico-Methoden könnte die Wiederherstellung von Mutationen und Kopienzahlaberrationen verbessern.

Digitale Karyotypisierung

Diese Methode wurde ursprünglich vom Labor von Bert Vogelstein, Luis Diaz und Victor Velculescu an der Johns Hopkins University entwickelt. Im Gegensatz zur normalen Karyotypisierung, bei der ein Farbstoff verwendet wird, um Chromosomenbanden zu färben, um die Chromosomen zu visualisieren, verwendet die digitale Karyotypisierung DNA-Sequenzen von Loci im gesamten Genom, um die Variation der Kopienzahl zu berechnen. Kopienzahlvariationen sind bei Krebserkrankungen häufig und beschreiben Situationen, in denen der Verlust der Heterozygotie eines Gens zu einer verminderten Funktion aufgrund einer geringeren Expression oder einer Duplikation eines Gens führen kann, was zu einer Überexpression führt.

Personalisierte Analyse neu angeordneter Enden (PARE)Bearbeiten

Nachdem das gesamte Genom mit einer Hochdurchsatzsequenzierungsmethode wie Illumina HiSeq sequenziert wurde, wird PARE auf die Daten angewendet, um chromosomale Umlagerungen und Translokationen zu analysieren. Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um solide Tumor-DNA zu analysieren, wurde aber für ctDNA-Anwendungen modifiziert.

DNA-Methylierung und Hydroxymethylierungbearbeiten

Die richtige epigenetische Markierung ist für eine normale Genexpression und Zellfunktion unerlässlich, und abnormale Veränderungen in epigenetischen Mustern sind ein Kennzeichen von Krebs. Ein normaler epigenetischer Status wird in einer Zelle zumindest teilweise durch DNA-Methylierung aufrechterhalten. Die Messung aberranter Methylierungsmuster in ctDNA ist aufgrund der stabilen Methylierung von DNA-Regionen, die als „CpG-Inseln“ bezeichnet werden, möglich. Die Methylierung von ctDNA kann durch Bisulfitbehandlung nachgewiesen werden. Die Bisulfitbehandlung wandelt unmethylierte Cytosine chemisch in ein Uracil um, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Die DNA wird anschließend sequenziert, und alle Änderungen des DNA-Methylierungsmusters können identifiziert werden. DNA-Hydroxymethylierung ist eine ähnlich assoziierte Markierung, die sich als prädiktiver Marker für gesunde und kranke Zustände in cfDNA, einschließlich Krebs, erwiesen hat. Die Messung abweichender Hydroxymethylierungsmuster in ctDNA wurde von Forschern der University of Chicago (Chuan He Lab), der Stanford University (Quake Lab) und der Firma Cambridge Epigenetix nachgewiesen.

Gezielte Ansatzebearbeiten

In einem gezielten Ansatz kann die Sequenzierung von ctDNA auf ein genetisches Panel gerichtet werden, das auf Mutations-Hotspots für den interessierenden Krebs basiert. Dies ist besonders wichtig, um die Behandlung in Situationen zu informieren, in denen Mutationen in arzneimittelfähigen Zielen identifiziert werden. Die Personalisierung der gezielten Analyse der ctDNA für jeden Patienten ist auch durch die Kombination von Flüssigbiopsien mit Standard-Primärgewebebiopsien möglich. Die Sequenzierung des gesamten Genoms oder des gesamten Exoms der Primärtumorbiopsie ermöglicht die Entdeckung genetischer Mutationen, die für den Tumor eines Patienten spezifisch sind, und kann für die nachfolgende gezielte Sequenzierung der ctDNA des Patienten verwendet werden. Die höchste Empfindlichkeit des ctDNA-Nachweises wird durch gezielte Sequenzierung spezifischer Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) erreicht. Häufig mutierte Gene wie Onkogene, die typischerweise Hotspot-Mutationen aufweisen, sind gute Kandidaten für gezielte Sequenzierungsansätze. Umgekehrt weisen die meisten Tumorsuppressorgene eine Vielzahl möglicher Funktionsverlustmutationen im gesamten Gen auf und sind daher nicht für eine gezielte Sequenzierung geeignet.

Gezielte Ansätze haben den Vorteil, ctDNA durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) oder digitale PCR zu amplifizieren. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse von ctDNA, nicht nur, weil relativ wenig DNA im Blutkreislauf zirkuliert, sondern auch, weil ctDNA einen kleinen Teil der gesamten extrahierten zellfreien DNA ausmacht. Daher kann die Amplifikation von Regionen von Interesse die Empfindlichkeit des ctDNA-Nachweises drastisch verbessern. Die Amplifikation durch PCR kann jedoch aufgrund der inhärenten Fehlerrate von DNA-Polymerasen zu Fehlern führen. Fehler, die während der Sequenzierung eingeführt werden, können auch die Empfindlichkeit beim Nachweis von ctDNA-Mutationen verringern.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

Diese Methode leitet sich von der digitalen PCR ab, die ursprünglich von Bert Vogelsteins Gruppe an der Johns Hopkins University benannt wurde. Die digitale Tröpfchen-PCR verwendet einen Tröpfchengenerator, um einzelne DNA-Stücke unter Verwendung einer Öl / Wasser-Emulsion in Tröpfchen aufzuteilen. Dann treten in jedem Tröpfchen einzelne Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung ausgewählter Primer gegen Regionen der ctDNA auf und gehen zum Endpunkt über. Das Vorhandensein der interessierenden Sequenzen wird durch Fluoreszenzsonden gemessen, die an die amplifizierte Region binden. ddPCR ermöglicht eine hoch quantitative Beurteilung der Allel- und Mutantenfrequenzen in ctDNA, ist jedoch durch die Anzahl der Fluoreszenzsonden begrenzt, die in einem Assay verwendet werden können (bis zu 5). Die Empfindlichkeit des Tests kann in Abhängigkeit von der Menge der analysierten DNA variieren und liegt bei etwa 1 zu 10.000.

Beads, Emulgierung, Amplifikation und Magnetics (Beamen)Bearbeiten

Diese Technik baut auf Tröpfchen-Digital-PCR auf, um Mutationen in ctDNA mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nachdem die ctDNA aus dem Blut extrahiert wurde, wird die PCR mit Primern durchgeführt, die auf die interessierenden Regionen abzielen. Diese Primer enthalten auch spezifische DNA-Sequenzen oder Tags. Die amplifizierte DNA wird mit Streptavidin-beschichteten Magnetperlen gemischt und zu Tröpfchen emulgiert. Biotinylierte Primer, die an die Tags binden sollen, werden verwendet, um die DNA zu amplifizieren. Durch die Biotinylierung kann die amplifizierte DNA an die magnetischen Kügelchen binden, die mit Streptavidin beschichtet sind. Nach Abschluss der PCR werden die DNA-gebundenen Beads mit einem Magneten getrennt. Die DNA auf den Kügelchen wird dann denaturiert und mit fluoreszierenden Oligonukleotiden hybridisiert, die für jede DNA-Schablone spezifisch sind. Die resultierenden Bead-DNA-Komplexe werden dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ist in der Lage, Allel- und Mutationshäufigkeiten aufgrund der Kopplung mit ddPCR zu erfassen. Im Gegensatz zur ddPCR kann jedoch aufgrund der Flexibilität der Verwendung fluoreszenzgebundener Sonden eine größere Anzahl von DNA-Sequenzen abgefragt werden. Ein weiterer Vorteil dieses Systems besteht darin, dass die isolierte DNA auch für die Downstream-Sequenzierung verwendet werden kann. Die Empfindlichkeit beträgt 1,6 in 104 bis 4,3 in 105.

CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)Edit

Diese Methode wurde ursprünglich von den Gruppen von Ash Alizadeh und Maximilian Diehn an der Stanford University beschrieben. Diese Technik verwendet biotinylierte Oligonukleotid-Selektorsonden, um DNA-Sequenzen anzuvisieren, die für den ctDNA-Nachweis relevant sind. Öffentlich zugängliche Krebsdatenbanken wurden verwendet, um eine Bibliothek von Sonden gegen wiederkehrende Mutationen bei Krebs zu konstruieren, indem ihr Rezidivindex berechnet wurde. Das Protokoll wurde für die niedrigen DNA-Spiegel optimiert, die bei der ctDNA-Sammlung beobachtet wurden. Dann wird die isolierte DNA einer tiefen Sequenzierung unterzogen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Diese Technik ermöglicht die Abfrage von Hunderten von DNA-Regionen. Es wird berichtet, dass die ctDNA-Nachweisempfindlichkeit von CAPP-Seq 2,5 Moleküle in 1.000.000 beträgt.

Tagged AMplicon Deep Sequencing (TAM-Seq)Edit

TAM-Seq ermöglicht die gezielte Sequenzierung ganzer Gene, um Mutationen in ctDNA nachzuweisen. Zuerst wird ein allgemeiner Amplifikationsschritt unter Verwendung von Primern durchgeführt, die das gesamte interessierende Gen in 150-200bp-Abschnitten umfassen. Dann wird ein Mikrofluidiksystem verwendet, um Adapter mit einer eindeutigen Kennung an jedes Amplikon anzubringen, um die DNA in parallelen Singleplex-Reaktionen weiter zu amplifizieren. Es wurde gezeigt, dass diese Technik erfolgreich Mutationen identifiziert, die im TP53-Tumorsuppressorgen bei Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs verstreut sind. Die Empfindlichkeit dieser Technik beträgt 1 zu 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq)Edit

Diese Methode wurde ursprünglich von Bert Vogelstein und seiner Gruppe an der Johns Hopkins University beschrieben. Safe-Seq verringert die Fehlerrate der massiv parallelen Sequenzierung, um die Empfindlichkeit gegenüber seltenen Mutanten zu erhöhen. Dies wird durch Hinzufügen einer eindeutigen Identifikatorsequenz (UID) zu jeder DNA-Vorlage erreicht. Die DNA wird dann unter Verwendung der hinzugefügten UIDs amplifiziert und sequenziert. Alle DNA-Moleküle mit derselben UID (eine UID-Familie) sollten dieselbe gemeldete DNA-Sequenz aufweisen, da sie aus einem Molekül amplifiziert wurden. Mutationen können jedoch durch Amplifikation eingeführt werden, oder es können falsche Basenzuordnungen in den Sequenzierungs- und Analyseschritten aufgerufen werden. Das Vorhandensein der UID ermöglicht es, diese methodischen Fehler von echten Mutationen der ctDNA zu trennen. Eine Mutation gilt als ‚Supermutant‘, wenn 95% der sequenzierten Lesevorgänge übereinstimmen. Die Sensitivität dieses Ansatzes beträgt 9 zu 1 Million.

Duplex sequencingEdit

Diese Methode ist eine Verbesserung der einzelnen UIDs, die in der Safe-Seq-Technik hinzugefügt wurden. Bei der Duplexsequenzierung fungiert randomisierte doppelsträngige DNA als eindeutige Tags und ist an einen invarianten Spacer gebunden. Tags werden an beiden Enden eines DNA-Fragments (α- und β-Tags) angebracht, was zu zwei eindeutigen Vorlagen für die PCR führt – einem Strang mit einem α-Tag am 5′-Ende und einem β-Tag am 3′-Ende und dem anderen Strang mit einem β-Tag am 5′-Ende und einem α-Tag am 3′-Ende. Diese DNA-Fragmente werden dann mit Primern gegen die invarianten Sequenzen der Tags amplifiziert. Die amplifizierte DNA wird sequenziert und analysiert. DNA mit den Duplexadaptern wird verglichen und Mutationen werden nur akzeptiert, wenn ein Konsens zwischen beiden Strängen besteht. Diese Methode berücksichtigt sowohl Fehler aus der Sequenzierung als auch Fehler aus der PCR-Amplifikation im Frühstadium. Die Empfindlichkeit des Ansatzes zur Entdeckung von Mutanten beträgt 1 zu 10 ^ 7.

Integrated Digital Error Suppression (IDEs)-enhanced CAPP-SeqEdit

IDEs verbessert die CAPP-Seq-Analyse von ctDNA, um Fehler zu verringern und damit die Detektionsempfindlichkeit zu erhöhen. Im Jahr 2016 berichtet, kombiniert IDEs CAPP-Seq mit Duplex-Barcoding-Sequenzierungstechnologie und mit einem Rechenalgorithmus, der stereotype Fehler im Zusammenhang mit dem CAPP-Seq-Hybridisierungsschritt entfernt. Die Methode integriert auch die Duplexsequenzierung, wo möglich, und umfasst Methoden zur effizienteren Duplexwiederherstellung aus zellfreier DNA. Die Empfindlichkeit dieser verbesserten Version von CAPP-Seq ist 4 in 100.000 Exemplaren.