1.4.1 Homogenisierungsmedium
Der Zellaufschluss wird normalerweise entweder in einem leicht hypo-osmotischen oder einem iso-osmotischen Medium durchgeführt, um die morphologische Integrität zu erhalten. Saccharose wird üblicherweise als osmotisches Lösungsmittel verwendet, um zu verhindern, dass subzelluläre Organellen oder Vesikel anschwellen oder schrumpfen. Mannitol und Sorbitol wurden auch verwendet, wenn festgestellt wurde, dass Saccharose die biochemische Analyse der subzellulären Komponente stört. Saccharose wird Salzlösungen vorgezogen, da letztere dazu neigen, subzelluläre Organellen zu aggregieren. Hypo-osmotische Medien werden häufig bei der Isolierung von Plasmamembranfraktionen verwendet, da unter diesen Bedingungen gestörte Zellen Plasmamembranen in Form von großen Geistern oder Blättern ergeben. Dadurch wird die hohe Variation der Größe dieser Fragmente vor der Zentrifugation deutlich reduziert. Obwohl das Homogenisierungsmedium normalerweise wässriger Natur ist, wurden nicht-wässrige Medien wie Ether / Chloroform verwendet, um subzelluläre Organellen zu isolieren. Nichtwässrige Medien können jedoch einige Enzyme inaktivieren und die morphologische Integrität einiger Gewebe verringern.
Chelatbildner (EDTA oder EGTA) können dem Homogenisierungsmedium zugesetzt werden, um zweiwertige Kationen, wie Mg2+ oder Ca2+, die von Membranproteasen benötigt werden, zu entfernen. Es ist wichtig zu beachten, dass Proteaseinhibitoren immer noch im Medium enthalten sein sollten, da EDTA- und Thiolreagenzien einige proteolytische Enzyme aktivieren können. Viele Membranmarkerenzyme benötigen jedoch diese Kationen für die Aktivität und können gehemmt werden, nachdem die Kationen aus dem Extrakt entfernt wurden. Die Zugabe von Mg2 + oder Ca2 + zum Homogenisierungsmedium erhält die nukleare Integrität. Diese Ionen können jedoch eine Membranaggregation verursachen und die Atmungskontrolle in Mitochondrien verringern.
Bei der Zellzerstörung von Pflanzengewebe werden häufig Phenole freigesetzt, die mehrere schädliche Auswirkungen auf Pflanzenenzyme haben können. Pflanzenphenolische Verbindungen umfassen im Wesentlichen zwei Gruppen: Phenylpropanoidverbindungen (z.B. hydrolysierbare Tannine) und die Flavonoide (z.B. kondensierte Tannine). Die Phenole können Wasserstoffbrücken mit Peptidbindungen von Proteinen bilden oder durch Phenoloxidase zu Chinonen oxidiert werden. Chinone sind starke Oxidationsmittel, die auch dazu neigen, mit reaktiven Proteingruppen zu polymerisieren und zu kondensieren, um ein dunkles Pigment namens Melanin zu bilden, das die Grundlage für die Bräunung von Pflanzengewebe bildet. Die Bindung von Melanin an Proteine kann viele Enzyme inaktivieren. Phenolische Hydroxylgruppen können ionische Wechselwirkungen mit basischen Aminosäuren von Proteinen bilden oder hydrophob mit hydrophoben Bereichen von Proteinen interagieren. Daher ist es wichtig, die phenolischen Verbindungen so schnell wie möglich zu entfernen, und dies wird am besten erreicht, indem Adsorbentien verwendet werden, die an die Phenole oder Chinone binden, oder indem Schutzmittel wie Borat, Germanat, Sulfite und Mercaptobenzothiazol verwendet werden, die die Phenoloxidaseaktivität hemmen. Das Phenoladsorptionsmittel Polyvinylpyrrolidon kann entweder in wasserlöslicher Form oder als hochvernetztes unlösliches Produkt Polyclar dem Isolationsmedium zugesetzt werden. Polyvinylpyrrolidon bindet jene phenolischen Verbindungen, die starke Wasserstoffbrückenbindungen mit Proteinen bilden. Es wurde auch berichtet, dass Rinderserumalbumin mit pflanzlichen Phenolen reagiert und auch ein wirksamer Chinonfänger ist.
Die Zell- oder Gewebefraktionierung wird ausnahmslos bei +4 ° C durchgeführt, um die Aktivität von Membranproteasen zu reduzieren. Proteasen können in Endopeptidasen und Exopeptidasen unterteilt werden. Endopeptidasen, die Enzyme sind, die interne Peptidbindungen spalten, umfassen: Säureproteasen, die ein pH–Optima von pH 2,5-3,8 haben und durch den Übergangszustandsinhibitor Pepstatin inhibiert werden können; serinproteasen, die durch Diisopropylfluorphosphat und Phenylmethylsulfonylfluorid inhibiert sein können; und Sulfhydrylproteasen, die durch N-Ethylmaleinimid oder E-64 (l-trans-Epoxysuccinyl-leucylamid-Butan) inhibiert sind. Beispiele für Exopeptidasen umfassen Carboxypeptidasen, die in den meisten Pflanzengeweben vorhanden sind und die meisten C-terminalen Aminosäuren leicht hydrolysieren. Alle bisher untersuchten pflanzlichen Carboxypeptidasen werden durch Diisopropylfluorphosphat inhibiert. Aminopeptidasen, Dipeptidasen und Tripeptidasen wurden auch in Pflanzen identifiziert. Andere Verbindungen, die in Homogenisierungsmedien verwendet werden, umfassen Disulfid-Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Dithioerythrit, reduziertes Glutathion oder Cystein. Dies liegt daran, dass viele Enzyme eine essentielle aktive Sulfhydrylgruppe enthalten, die reduziert bleiben muss, um die Enzymaktivität aufrechtzuerhalten. Viele der Probleme der Organellenisolierung sind mit dem Aufbrechen der fragilen Membranen verbunden, beispielsweise des Tonoplasten, der die Vakuole umgibt. Abgesehen von der physischen Zerstörung dieser Membranen enthalten Pflanzengewebe aktive lipolytische Enzyme, die die Lipidkomponenten von Membranen direkt angreifen und Organellen stören können. Freie Fettsäuren, die durch die hydrolytische Wirkung von Acylhydrolasen freigesetzt werden, können die ATPase-Aktivitäten von Mitochondrien, Chloroplasten und Plasmamembranen hemmen. Andere schädliche Wirkungen von Fettsäuren sind ebenfalls gut bekannt. Es gibt bestimmte Bedingungen, die den Lipidabbau durch Lipasen und lipolytische Acylhydrolasen in Pflanzen verringern können. Dazu gehört die Verwendung (1) eines Isolationsmediums mit einem pH-Wert von 7.5-8, bei denen die meisten lipolytischen Enzyme und Lipooxygenasen wenig Aktivität zeigen, (2) Chelatbildner wie EDTA, da viele Phospholipasen Ca2 + -abhängig sind; Viele lipolytische Enzyme sind jedoch von Chelatbildnern nicht betroffen und (3) andere Zusatzstoffe wie Antioxidantien zur Verhinderung des oxidativen Abbaus von Fettsäurehydroperoxiden, Disulfidreduktionsmittel, spezifische Enzyminhibitoren und die Verwendung von fettsäurefreiem Rinderserumalbumin, das freie Fettsäuren bindet. Jedes einzelne Homogenisierungsmedium ist unterschiedlich und kann spezifische Inhibitoren für Enzyme wie Phospholipasen oder Phosphophatasen enthalten. Beispielsweise wird dem Isolationsmedium häufig Glycerin zugesetzt, um die Phosphatidsäurephosphatase zu inhibieren. Ethanolamin und Cholinchlorid werden üblicherweise zur Hemmung der Phospholipase D verwendet.
Die Pufferkapazität des Homogenisierungsmediums für die Pflanzenzellfraktionierung muss hoch sein, um die Freisetzung organischer Säuren durch die gestörte Vakuole, die ein erhebliches Volumen der Zelle darstellt, auszugleichen. Das Homogenisierungsmedium kann entweder durch empirische Auswertung oder durch rationale Analyse formuliert werden. Um beispielsweise sicherzustellen, dass das relevante gereinigte Protein intakt bleibt, können dem Homogenisierungsmedium alle wichtigen Inhibitoren von Proteasen zugesetzt oder alternativ physiologische Lösungen kopiert werden. Da der cytoplasmatische pH-Wert der Pflanzenzelle bei etwa 7,5-8,0 liegt, sollte das Homogenisierungsmedium den physiologischen Zustand der Zelle widerspiegeln und ist daher schwach auf den cytoplasmatischen pH-Wert gepuffert.