Y-Chromosom-Mikrodeletion bei einem Vater und seinen vier unfruchtbaren Söhnen

Zusammenfassung

Mikrodeletionen von Yq sind mit Azoospermie und schwerer Oligozoospermie assoziiert. Im Allgemeinen sind Männer mit Deletionen unfruchtbar und daher werden Deletionen nicht auf Söhne übertragen, es sei denn, eine In-vitro-Fertilisation (IVF) und eine intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) werden durchgeführt. Wir berichten von einer ungewöhnlichen Familie, die durch mehrere Mitglieder mit Unfruchtbarkeit und Yq-Mikrodeletion gekennzeichnet ist. Vollständige reproduktive Geschichte, Samenanalysen und Blutproben wurden von relevanten Familienmitgliedern entnommen. DNA-Präparation und -Quantifizierung wurden unter Verwendung kommerzieller Kits durchgeführt. Insgesamt 27 Paare von sequenzmarkierten Stellen, die auf Primersätzen basieren, die für die Loci der Y-Mikrodeletionsregion spezifisch sind, wurden für das Screening verwendet. Southern Blots mit deleted in azoospermia (DAZ) und Ribosomal Binding motif (RBM) cDNAs wurden dann zur Bestätigung analysiert. Der Proband, Seine drei Brüder und sein Vater wurden alle für DAZ gelöscht, aber nicht für RBM. Zum Zeitpunkt der Analyse war der Vater des Probanden azoospermisch, während seine vier Söhne entweder stark oligozoospermisch oder azoospermisch waren. Im Gegensatz zu ihrem Vater sind die vier Söhne unfruchtbar und haben keine Nachkommen, mit Ausnahme eines von ihnen, der erst nach einer IVF / ICSI-Behandlung wegen Unfruchtbarkeit eine Tochter bekam. Mikrodeletionen von Yq, an denen das DAZ-Gen beteiligt ist, sind mit einer variablen phänotypischen Expression verbunden, die offensichtlich eine normale Fertilität umfassen kann.

Einleitung

Unfruchtbarkeit tritt bei ~ 14% der Paare auf (Mosher, 1985), und Anomalien beim männlichen Partner treten schätzungsweise in bis zur Hälfte der Fälle auf (Swerdloff et al., 1985). Bemühungen, die Ursachen der Azoospermie zu bewerten, haben gezeigt, dass nach Ausschluss traditionell erkennbarer Ursachen (d. H. abnormaler Karyotyp, Obstruktion, Varikozele, hormoneller Defekt usw.), sind die meisten Fälle (50-75%) ungeklärt und werden als idiopathisch bezeichnet (Pryor et al., 1997). Kürzlich wurde berichtet, dass bis zu 30% der Männer mit idiopathischer Azoospermie Mikrodeletionen des Y-Chromosoms aufweisen (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Wie genau und ob diese Mikrodeletionen Azoo- / Oligozoospermie verursachen oder nicht, ist Gegenstand intensiver Untersuchungen und Debatten.

Wesentlich für das Argument, dass Y-Mikrodeletionen Unfruchtbarkeit verursachen, ist die Beobachtung, dass fruchtbare Männer selten Y-Mikrodeletionen manifestieren. Mikrodeletionen bei vier von 200 untersuchten fruchtbaren Männern wurden berichtet (Pryor et al., 1997). Die Deletionen bei diesen Männern waren jedoch sehr gering und stellten höchstwahrscheinlich einen unbedeutenden Polymorphismus dar. Relativ große Deletionen der mit männlicher Unfruchtbarkeit verbundenen Art wurden bei Männern mit normaler Fruchtbarkeit nicht berichtet. Obwohl allgemein angenommen wird, dass diese Deletionen de novo auftreten und dass eine Übertragung der Y-Mikrodeletion von Vater zu Sohn nicht zu erwarten ist, wurden einige seltene Fälle einer Übertragung der Y-Chromosom-Mikrodeletion von Vater zu Sohn berichtet (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Die vertikale Übertragung einer Mikrodeletion des deletierten Azoospermie-Locus (DAZ) vom Vater auf einen Sohn wurde jedoch nur in drei Fällen berichtet (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Wir beschreiben nun eine Familie mit vier Generationen, in der ein azoospermischer Vater und seine vier unfruchtbaren Söhne alle eine scheinbar identische Mikrodeletion teilen, die den DAZ-Locus einschließt. Diese Familie stellt den ersten und einzigen Bericht über eine spontane vertikale Übertragung der DAZ-Deletion auf mehrere Nachkommen dar. Es liefert Hinweise darauf, dass eine einzelne Yq-Mikrodeletion zu einer unterschiedlichen phänotypischen Expression bei verschiedenen Individuen führen kann. Es ist klinisch signifikant, da das Vorhandensein einer Mikrodeletion kein absoluter Marker für Unfruchtbarkeit ist und mit einer scheinbar normalen Fruchtbarkeit in Verbindung gebracht werden kann.

Materialien und Methoden

Das Screening auf Yq-Mikrodeletion wurde routinemäßig bei männlicher Unfruchtbarkeit unter Verwendung eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Review Board des College of Physicians & Surgeons, Columbia University, überprüft und genehmigt wurde. Die Proben wurden den Patienten nach Einverständniserklärung entnommen.

Samenanalyse

Die Ergebnisse wurden nach WHO-Kriterien mit einem Phasenkontrastmikroskop von Nikon analysiert.

Serumhormonkonzentrationen

Follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH) und Testosteron wurden durch Festphasen-Chemilumineszenz-enzymimmunometrischen Assay an zwei Stellen (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA) gemessen. Normale Bereiche für Männer sind FSH < 10 mIU / ml; LH < 10 mIU / ml; und Testosteron 270-1070 ng / dl.

Genomische DNA

Die Extraktion von genomischer DNA aus Vollblut wurde durch Lyse von roten Blutkörperchen durchgeführt, gefolgt von Lyse von weißen Blutkörperchen und ihren Kernen. Zelluläre Proteine wurden durch Salzfällung entfernt und genomische DNA wurde mit Isopropanol unter Verwendung von Puregene DNA extraction Kit (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; Katalog-Nr. D-5004).

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Primer wurden als getrocknete Oligonukleotide auf einem automatisierten DNA-Synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Insgesamt 27 Y-Chromosom-spezifische sequenzmarkierte Stellen (STS) (Abbildung 1) wurden aus einer STS-Karte ausgewählt (Vollrath et al., 1992). Sie umfassen die drei vorgeschlagenen Spermatogenese-Loci AZFa, AZFb und AZFc (gemäß Vogt et al., 1996) spanning Yq Intervalle 5, 6 und 7. Als Schnellscreening-Protokoll wurde in insgesamt sechs Multiplexreaktionen ein PCR-Multiplexsystem aus zwei bis sechs verschiedenen Primerpaaren eingesetzt (Tabelle I). Bei jedem PCR-Lauf wurden eine weibliche Kontrolle und eine normale männliche Kontrolle eingeschlossen. Alle PCR-Reaktionen wurden in Polycarbonat (Techne®)-Platten in einer MJ Research®-Maschine durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Henegariu et al., 1993). Kurz gesagt wurden in einer 14 µl Gesamtvolumenreaktion 50 ng genomische DNA als Template verwendet, 1 µl Primer-Standardlösung (Mix I oder II oder III oder IV oder V oder VI bestehend aus 10 pmol pro Primer), 12 µl `PCR cold Mix‘ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l von jedem dNTP, 5% DMSO, 1× Taq-Polymerase-Reaktionspuffer ohne Mg2+), 1,25 IE Taq-DNA-Polymerase (Promega) und 1 Tropfen öl. Die kompletten Mischungen wurden direkt in einen auf 94°C vorgeheizten Thermocycler gegeben. Zyklusbedingungen für 27 Zyklen wurden: 94 °C, 30 s (Schmelzen); 55 °C, 45 s (Glühen); und 72 °C, 60 s (Verlängerung). Die letzte Verlängerungszeit betrug 5 min. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden anschließend auf 3%igen Agarosegelen (Bio-Rad, ultra-pure grade) durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. PCR-Produkte wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und durch Einwirkung von ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. STS, die keine Amplifikation in Multiplexreaktionen zeigten, wurden durch Einzelreaktions-PCR mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen bestätigt. Ein STS wurde nach drei Verstärkungsfehlern als nicht vorhanden angesehen.

Southern hybridization

Southern Blotting wurde nach etabliertem Protokoll durchgeführt (Sambrook et al., 1989). Kurz gesagt, 5 µg genomische DNA wurde mit HindIII oder TaqI verdaut, auf einem 0,7% igen Agarosegel in Standard-TBE-Puffer ausgeführt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit 32P-markierten Sonden hybridisiert. Die DAZ-Sonde war der gereinigte Einsatz eines Plasmids (pDP1577), das die cDNA voller Länge enthielt (Reijo et al., 1995). In ähnlicher Weise war die RBM-Sonde der Plasmideinsatz eines RBM-cDNA-Klons (MK5) (Ma et al., 1993).

Vaterschaftsbestimmung

Die Vaterschaft aller vier Söhne wurde bestätigt, indem die erwartete Segregation von vier hochpolymorphen autosomalen Markern gezeigt wurde (Weber und May, 1989). Diese waren D21S156, D21S270, D13S132 und D13S159 mit Heterozygositäten von 0,83, 0,86, 0,84 bzw. 0,90.

Fluoreszierende in-situ Hybridisierung (FISH)

FISH für DAZ wurde mit Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), unter Verwendung etablierter Methoden (Yu et al., 1996).

Ergebnisse

Der Proband (Einzelperson III 8 in Abbildung 2) und sein Ehepartner (III-9) wurden der Klinik für reproduktive Endokrinologie und Unfruchtbarkeit im Columbia-Presbyterian Medical Center vorgestellt mit Beschwerde über primäre Unfruchtbarkeit für 3 Jahre. Die Tests ergaben einen normalen Karyotyp und normale Serumhormonspiegel, während Samenanalysen eine schwere Oligozoospermie zeigten (Tabelle II). Das Mikrodeletionsscreening mittels STS-basierter PCR ergab das Vorhandensein einer Mikrodeletion im Subinterval 6D-6F des langen Arms des Y-Chromosoms (Abbildung 1). Während der Diskussion berichtete der Proband, dass seine beiden älteren Brüder (III-4 und III-6) als azoospermisch und unfruchtbar bekannt waren. Die anschließende Aufarbeitung ergab, dass alle drei Brüder eine scheinbar identische Mikrodeletion hatten. Eine Hodenbiopsie, die an einem von ihnen (III-6) durchgeführt wurde, zeigte ein `Sertoli-Zell-only‘ -Syndrom.

Der Befund einer Mikrodeletion bei drei unfruchtbaren Brüdern deutete darauf hin, dass ihr Vater wahrscheinlich die gleiche Deletion trug. Eine detaillierte Studie wurde über den Rest der Familie durchgeführt, die alle in einer kleinen Stadt in der Dominikanischen Republik lebten. Eine vollständige reproduktive Geschichte wurde von den erwachsenen Familienmitgliedern entlockt. Die im Stammbaum dargestellten familiären Beziehungen (Abbildung 2) wurden bestätigt, indem die erwartete Segregation mehrerer autosomal polymorpher Marker (Daten nicht gezeigt) für die relevanten Familienmitglieder (I-1, I-2, II-1, II-8 und II-1) gezeigt wurde, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Es gab keine Hinweise auf Nicht-Vaterschaft. Gründliche zytogenetische Studien an relevanten Familienmitgliedern (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 und IV-1) ergaben normale Karyotypen. Bei sieben der 16 Männer wurde eine Samenanalyse durchgeführt, und von den meisten Familienmitgliedern wurden Blutproben entnommen.

Tabelle II fasst die Ergebnisse der Samenanalyse und der endokrinen Aufarbeitung relevanter Familienmitglieder zusammen. Der Proband (III-8), sein Vater (II-1) und zwei seiner drei Brüder (III-4, III-6) waren entweder azoospermisch oder stark oligozoospermisch. Der älteste Bruder des Probanden (III-1) lehnte die Samenanalyse ab. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Onkel des Probanden (II-8) Azoospermie und erhöhtes FSH mit niedrigem Testosteron hatte. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde bei dem Probanden, seinem Vater und drei Brüdern durch STS-PCR-Analyse eine Mikrodeletion von Yq festgestellt. Southern-Blotting mit den Sonden DAZ (Abbildung 3) und RBM (Daten nicht gezeigt) bestätigte, dass die Deletion den DAZ-Locus, aber nicht den RNA-Bindemotiv-Locus (RBM) umfasste. Fischanalyse mit dem DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) der Leukozyten des Vaters des Probanden (II-1) zeigten eine gleichmäßige Abwesenheit des DAZ-Locus (Abbildung 4).

Der Befund, dass das Individuum II-8 im Stammbaum azoospermisch war, aber keine Mikrodeletion aufwies, war eine Überraschung. Der DAZ-Locus in diesem Individuum wurde weiter durch Southern-Analyse unter Verwendung der DAZ-cDNA und eines anderen Restriktionsenzyms (TaqI) getestet. Es zeigte keine Abnormalität des DAZ-Locus. Darüber hinaus zeigten FISCHE mit dem DAZ Cosmid 63C9 eine normale Intensität (Daten nicht gezeigt).

Der Proband (III-8) und sein älterer Bruder (III-6) suchten eine Unfruchtbarkeitsbehandlung. Nach eingehender Beratung entschieden sie sich für In-vitro-Fertilisation (IVF) und intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI). Der Proband (III-8) und seine Frau (III-9) unterzogen sich zwei IVF-ICSI-Zyklen, die aufgrund einer schlechten Reaktion der Eierstöcke keine Schwangerschaft hervorriefen. Der Bruder des Probanden (III-6) und seine Frau (III-7) durchliefen einen Zyklus kontrollierter ovarieller Überstimulation und neun Eizellen wurden entnommen. Elf reife Spermatozoen wurden am Tag der Entnahme in drei Ejakulaten gefunden und für die ICSI verwendet. Drei Eizellen befruchtet, die anschließend gespalten und übertragen wurden. Sie brachte ein gesundes weibliches Baby zur Welt (IV-2).

Diskussion

Wir berichten von einer außergewöhnlichen Familie, in der ein azoospermischer Vater und seine vier unfruchtbaren Söhne eine scheinbar identische Yq-Mikrodeletion mit dem DAZ-Locus teilen. Die De-Novo-Mutation, die zur Mikrodeletion von DAZ führte, scheint ihren Ursprung im Vater des Probanden zu haben (II-1). Es wird erwartet, dass diese Deletion Azoo / Oligozoospermie und männliche Unfruchtbarkeit verursacht, und dennoch empfing er spontan fünf Kinder und war sich keines Fruchtbarkeitsproblems bewusst. Interessanterweise sind jedoch alle vier Söhne unfruchtbar und entweder azoospermisch oder stark oligozoospermisch.

Diese Familie wirft mehrere Probleme in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Yq-Mikrodeletion und Unfruchtbarkeit auf. Erstens bestätigt es, dass eine vertikale Übertragung der Yq-Mikrodeletion möglich ist und zu nachfolgender Unfruchtbarkeit bei den männlichen Nachkommen führen kann. Zweitens ist es offensichtlich, dass dieselbe Deletion bei verschiedenen Individuen zu unterschiedlichen Phänotypen führen kann. Obwohl der Vater (II-1) der vier Jungen in dieser Familie zum Zeitpunkt der Analyse azoospermisch war, zeugte er sein erstes Kind im Alter von 25 Jahren und sein letztes im Alter von 38 Jahren. So besaß er über einen langen Zeitraum ein gewisses Maß an Fruchtbarkeit. Ebenso impliziert die Mikrodeletion des Y-Chromosoms, insbesondere der DAZ, nicht unbedingt eine lebenslange Vorgeschichte von Azoospermie und schließt auch nicht die Bildung einer großen Familie aus. Seine vier Söhne hingegen sind unfruchtbar und entweder azoospermisch oder stark oligozoospermisch.

Das DAZ-Gen wurde als Azoospermiefaktor auf dem Y-Chromosom vorgeschlagen. Diese Familie zeigt deutlich, dass DAZ zwar eine entscheidende Rolle bei der Spermatogenese spielen kann, für die Fruchtbarkeit jedoch nicht wesentlich ist. Darüber hinaus kann der Totalverlust des DAZ-Genclusters mit einem histologischen Bild von `Nur Sertoli-Zellen‘ sowie einem Spermienreifungsstillstand in Verbindung gebracht werden (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Mehrere Autoren haben eine schlechte Korrelation zwischen dem Ort der Y-Mikrodeletionen (einschließlich DAZ-Deletionen) und dem klinischen und histologischen Phänotyp der Patienten festgestellt (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Die Ergebnisse in dieser Familie stimmen darin überein, dass sich eine solche Korrelation als ziemlich problematisch herausstellen kann. Die Hodenbiopsie des Bruders des Probanden (III-6) zeigte ein Bild von `nur Sertoli-Zelle‘, während vom Probanden (III-8 mit Spermienzahl 0,5 × 106 / ml) eindeutig ein gewisses Maß an Spermienreifung bei der Biopsie erwartet würde. Darüber hinaus ist die Hodenbiopsie möglicherweise nicht repräsentativ für den gesamten Hoden, da die Spermatogenese geografisch heterogen sein kann, wie bei einzelnen III-6, deren Ejakulate reife Spermatozoen enthielten.

Über die Grundlage phänotypischer Unterschiede zwischen Familienmitgliedern mit gleicher Deletion können wir nur spekulieren. Es ist bekannt, dass identische Deletionen innerhalb von Autosomen zu unterschiedlichen Phänotypen führen können (Schinzel, 1994). Man kann postulieren, dass solche Unterschiede Folgen der Exposition jedes Einzelnen gegenüber seiner Umwelt oder der Expression verschiedener modifizierender Gene sind. Ein fruchtbarer Vater wurde mit einer Mikrodeletion beschrieben, die sich bei der Übertragung auf seinen unfruchtbaren Sohn ausweitete (Stuppia et al., 1996). Obwohl variable Erweiterungen an den Grenzen der Deletion zwischen unseren verschiedenen Familienmitgliedern existieren können, können diese molekularen Erweiterungen nicht durch Intervallzuordnung unterschieden werden. Durch PCR-Analyse konnte dasselbe STSs bei unseren fünf Individuen nicht amplifiziert werden, und die Hybridisierung mit der DAZ-Sonde bestätigte eine vollständige Deletion dieses Genclusters. Obwohl es möglich ist, dass die beobachteten Deletionen tatsächlich nicht identisch sind und benachbarte Bereiche wichtige Gene enthalten können, die den Grad der phänotypischen Expression modulieren, weisen diese Ergebnisse immer noch auf eine große Überlappung der deletierten Y-DNA (einschließlich des Verlusts von DAZ) hin Gencluster) in jedem Individuum dieser einzigartigen Familie.

Wir waren fasziniert von der Tatsache, dass der Onkel des Probanden (II-8) Unfruchtbarkeit und Azoospermie hat, aber keine offensichtliche Mikrodeletion durch STS-Tests. Da die Southern-Blot-Analyse sowohl mit den RBM- als auch mit den DAZ-Sonden sowie die Fischanalysen mit einem DAZ-Cosmid völlig normal waren, Wir müssen zu dem Schluss kommen, dass seiner Unfruchtbarkeit eine andere Ätiologie zugrunde liegt. Zugegebenermaßen ist es möglich, dass er eine kleinere oder Punktmutation / Störung oder proximale / distale Umlagerung aufweist, die mit aktuellen Methoden nicht nachweisbar ist. Er gab keine Geschichte der Exposition gegenüber Gonadotoxinen oder anderen definierbaren Faktoren, die wahrscheinlich die Spermatogenese beeinflussen.

Bis vor kurzem hatte die Y-Mikrodeletion wenig klinische Bedeutung, da sich ein Mann mit einer Deletion im Allgemeinen nicht reproduzieren wird. Durch die Verwendung von ICSI und testikulärer Spermienaspiration (TESA) in Kombination mit IVF ist es oligo / azoospermischen Männern mit Y-Mikrodeletion nun möglich, Schwangerschaften zu erreichen (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998 und Kapitel III-6). Dies hat zu Bedenken geführt, dass solche Schwangerschaften männliche Nachkommen mit ähnlichen Mikrodeletionen und anschließender Unfruchtbarkeit hervorbringen können (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Tatsächlich kann die Yq-Mikrodeletion über ICSI auf männliche Nachkommen übertragen werden (Kent-First et al., 1996). Die Familie, über die wir berichten, legt nahe, dass Männer mit Yq-Mikrodeletionen (wie Individuum II-1), die schwanger werden, dieselbe Mikrodeletion und das Risiko einer Unfruchtbarkeit auf ihre Söhne übertragen (Individuen III-1, III-4, III-6, III-8). Daher sollte den Patienten vor der ICSI ein Y-Mikrodeletions-Screening angeboten werden, und sie sollten über die Sicherheit der Übertragung der Yq-Mikrodeletion und möglicherweise der Unfruchtbarkeit auf ihre Söhne beraten werden. Da sich mehr Forschung auf genetische Ätiologien der männlichen Unfruchtbarkeit konzentriert, sollte die Identifizierung von Genen, die an der Spermatogenese beteiligt sind, einen Einblick in die Pathophysiologie der männlichen Unfruchtbarkeit und eine rationalere Grundlage für die Einleitung einer Therapie bieten.

Wir danken den Familien für ihre Mitarbeit an der Studie; Dr. David C.Page für die Bereitstellung der DAZ-cDNA-Sonde und seine unschätzbare Hilfe bei diesem Manuskript; Dr. Kun Ma für die Bereitstellung der MK5 (RBM1) cDNA-Sonde; Dr. Peter Vogt für die DNA von Yq-mikrodelettierten Individuen, die zur Validierung unserer STS-PCR-Methodik verwendet wurden; und C.C.Yu und Patricia Lanzano für ihre unschätzbare technische Unterstützung.

Diese Studie wurde teilweise von der Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards finanziert.