Wie man DNA-Extraktion aus getrockneten Blutflecken mit Chelex-Harz durchführt

Jeder Biowissenschaftler, der DNA analysieren möchte, weiß, dass der Prozess mit der Extraktion von DNA aus Zellen von Interesse beginnt. Diese Zellen könnten Erythrozyten, Parasiten oder Bakterien sein, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus stehen je nach Probentyp, Downstream-Analyse usw. verschiedene DNA-Extraktionsmethoden1 zur Auswahl. Viele Wissenschaftler beginnen mit getrockneten Blutflecken (DBS), und daher ist es von besonderem Interesse, DNA aus solchen Proben zu extrahieren. Ein DBS wird üblicherweise hergestellt, indem Blut auf eine Whatman FTA card2 oder Whatman chromatographisches 3 mm Filterpapier gesammelt und vor der Verarbeitung für einen Zeitraum (~ 4 Stunden) trocknen gelassen wird. Diese Methode der Bioprobenahme wird seit Jahrzehnten angewendet.

Ein brauchbares Verfahren zur Isolierung von DNA aus solchen Proben unter Verwendung von BT Chelex 100 Resin3 wird im Folgenden beschrieben.

Erster Schritt: Erythrozytenlyse

• Schneiden Sie einen trockenen Blutfleck aus und legen Sie ihn mit einem Locher in ein Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml). Vergessen Sie nicht, das Röhrchen zu beschriften, insbesondere wenn Sie an mehreren Proben arbeiten. Zu Qualitätskontrollzwecken auch einen positiven Kontrollblutfleck einschließen.
• 1 ml 0,5% Saponin in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Blutfleck geben. Schließen, Vortex, und inkubieren bei 4 0C für mindestens 4 Stunden, oder noch besser, über Nacht. In diesem Schritt Saponin-Komplexe mit Cholesterin in der Erythrozytenmembran zur Bildung von Poren in der Membran führt und damit Hämolyse.4 Saponin ist ein häufig verwendetes Lysereagens zur Befreiung von Parasiten (z. B. Malariaparasiten) von roten Blutkörperchen.
• Einige Sekunden bei 4.000 U / min drehen, um Tropfen aus dem Innendeckel zu entfernen, und das Saponin mit einer nicht barrierearmen Pipettenspitze, die an einer Pasteur-Pipette auf einer Vakuum-Montagemaschine befestigt ist, aus dem Röhrchen absaugen. Eine Kunststoff-Pasteur-Pipette kann ebenfalls verwendet werden. Lassen Sie die Stelle im Mikrozentrifugenröhrchen.

Schritt zwei: Waschen

• 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung in die Mikrozentrifuge geben, schließen, vortextieren und 20-30 Minuten bei 4 0C inkubieren. Das Inkubieren über Nacht verursacht keinen Schaden. Dieser Schritt stellt sicher, dass Saponin aus dem Röhrchen entfernt wird.
• Einige Sekunden bei 4.000 U / min drehen und dann die PBS entfernen, so wie Sie das Saponin entfernt haben. Lassen Sie die Stelle im Mikrozentrifugenröhrchen.

Schritt drei: DNA-Extraktion mit Chelex-Harz

Prinzip: Chelex-Harz verhindert den DNA-Abbau durch abbauende Enzyme (DNasen) und durch potenzielle Verunreinigungen, die nachgelagerte Analysen hemmen könnten. Im Allgemeinen fängt das Chelex-Harz solche Verunreinigungen ein und hinterlässt DNA in Lösung. Das Chelex-Harz hemmt Kationen wie Mg2 +, einen wichtigen Cofaktor für die DNase-Wirkung, und schützt so die DNA vor dem Abbau.5,6

• Pipettieren und 150 µl 6,7% ige Chelexharzlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen geben, das den Fleck enthält. Schließen Sie die Röhre. Eine wichtige Erinnerung: Verwenden Sie bei der Herstellung der 6,7% igen Chelex-Lösung Wasser, das frei von DNasen, Nukleasen (oder allem, was die DNA schädigen und abbauen könnte) ist.
• 10 Minuten bei 95 0C mit einem Wärmeblock / Schüttler inkubieren. Es ist wichtig, das Röhrchen zweimal alle 2 Minuten zu öffnen, um den Druck abzulassen, und danach einige Sekunden lang zu schütteln. Dadurch wird DNA in Lösung gebracht.

Vierter Schritt: Chelex-Harzperlen im endgültigen Extrakt vermeiden

• 5 Minuten bei 4.000 U / min schleudern
• Pipettieren Sie so viel Extrakt wie möglich in ein kleineres Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml) mit einer Aerosolbarrierespitze, während Sie den Transfer von Chelex-Perlen vermeiden.
• Zentrifugieren Sie die 0,6ml Mikrozentrifuge 10 Minuten lang bei 4.000 U/min. Die Idee des zweiten Dralls ist es, alle verbleibenden Chelex-Perlen zu entfernen, die in den endgültigen Extrakt übergehen könnten. Warum ist das wichtig? Zwei Hauptgründe: 1) Chelex bindet an Magnesiumionen (wesentlicher Cofaktor für die in der PCR verwendete Taq-Polymerase) und 2) Chelex fluoresziert. Wenn Fluoreszenz Ihre Art ist, ein Ergebnis zu visualisieren, kann dies zu einem falsch positiven Ergebnis führen.
• Etwa 100 µl pipettieren und den fertigen Extrakt in eine neue Mikrozentrifuge überführen. Etikettieren und im Kühlschrank aufbewahren.

Ein paar Tipps bei DNA-Extraktionen

• Arbeiten Sie in einer sauberen Umgebung ohne Verunreinigungen
• Verwenden Sie nukleasefreie Pipettenspitzen
• Behandeln Sie alle Proben mit Handschuhen
• Vermeiden Sie Chelexperlen in Ihrem endgültigen Extrakt

Fazit

Chelex resin7, bietet eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode aus DBS, für den Einsatz in verschiedenen molekularen analytischen Anwendungen. Diese Methode erfordert keine teure Ausrüstung und ist zuverlässig, wenn sie mit anderen Methoden getestet wird.

1. GE Healthcare (2010). Zuverlässige Extraktion von DNA aus Whatman FTA-Karten. Anwendungshinweis 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Vereinigtes Königreich: GE Healthcare.
2. Whatman (n.d.). Vorbereitung einer FTA-Disc für die DNA-Analyse. Whatman FTA-Protokoll BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 und Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin Bedienungsanleitung. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C. und Linss, W. (2000). Hämolyse von menschlichen Erythrozyten mit Saponin beeinflusst die Membranstruktur. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Extraktionsprotokoll: Chelex. In: IBRC website. Abgerufen von http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, CS, Boissaye, R., Stewart, J. und Staton, P. (n.d.). Entwicklung und interne Validierung eines Chelex ® DNA-Extraktionsprotokolls für orale Referenztupfer.
7. Walsh, P.S., Metzger, D.A. und Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 als Medium zur einfachen Extraktion von DNA für die PCR-basierte Typisierung aus forensischem Material. Biotechniques, 54(3), 134-139.