Was ist extrachromosomale zirkuläre DNA und was macht sie?

Es ist bekannt, dass DNA im Zellkern in Form von linearen Chromosomen gepackt ist. Seit vielen Jahren beobachten Forscher kleinere DNA-Längen neben den Chromosomen, die in kreisförmigen Formen organisiert sind. Einige dieser Partikel, die als extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNAs) oder mikroDNAs bezeichnet wurden, sind typischerweise klein (< 1 kb), gen-spärlich und nicht amplifiziert. Die gesamte eccDNA-Häufigkeit in Zellen kann bis zu einigen hundert pro Zelle betragen. eccDNA-Moleküle liegen auch in zellfreier Form im Kreislauf vor und bieten die Möglichkeit, als blutbasierte Biomarker zu dienen. In Tumoren kann eine andere Art von extrachromosomaler zirkulärer DNA nachgewiesen werden, die exklusiv für Krebszellen zu sein scheint. Diese ecDNA-Partikel, die früher als doppelsträngige DNA bezeichnet wurden, jetzt aber als extrachromosomale DNA (ecDNA) bezeichnet werden, da sie normalerweise keine Dubletten sind, sind oft sehr groß (mittlere Größe 1.3 Mb), stark amplifiziert mit vielen Kopien pro Zelle und enthalten viele Gene und regulatorische Regionen mit einer deutlichen Anreicherung für Onkogene. Wichtig ist, dass ecDNAs in Krebszellen transkriptionell aktiver zu sein scheinen als ihre chromosomalen Gegenstücke und im Verdacht stehen, Krebszellen Wachstums- und Überlebensvorteile zu verleihen. Gegenwärtig ist die Beziehung zwischen eccDNA in normalen Zellen und ecDNA in Krebs, falls vorhanden, nicht verstanden. Da es sich um eine so rätselhafte Form von genetischem Material handelt, haben wir einer Expertengruppe auf diesem Gebiet Fragen zu eccDNAs und ecDNAs gestellt, die Facetten von eccDNAs und ecDNAs untersucht haben, von ihren biophysikalischen Eigenschaften über Produktionsmechanismen bis hin zu physiologischen Rollen, Rollen in der Krebsbiologie und diagnostisches Potenzial.

Was machen eccDNAs? Was war für Sie bisher die größte Überraschung an eccDNA?

Anton Hensson: ecDNA ist ein Vehikel für Proto-Onkogen-Amplifikationen bei Krebs. Dies ist seit einiger Zeit bekannt. Überraschend war die Häufigkeit von ecDNA bei Krebs und die Fähigkeit von ecDNA, sehr komplexe Strukturen zu bilden, einschließlich Teilen aus verschiedenen Chromosomen, sowie ihre Fähigkeit, sich erneut in das Genom einzufügen.

Paul Mischel: Ich werde mich auf mein Forschungsgebiet ecDNA bei Krebs konzentrieren. Die größte Überraschung für mich ist, welche entscheidende Rolle ecDNA bei menschlichem Krebs spielt. Unsere Daten legen nahe, dass ecDNA eine entscheidende Rolle bei der Förderung des aggressiven Verhaltens einiger der bösartigsten Krebsformen durch mindestens drei Interlacing-Mechanismen spielt: 1) da ecDNAs keine Zentromere haben, unterliegen sie einer nicht-mendelschen (d. H. nichtchromosomalen) Vererbung, die es Tumoren ermöglicht, eine sehr hohe Anzahl von Onkogenkopien zu erreichen, während die intratumorale genetische Heterogenität erhalten bleibt; 2) Die intratumorale genetische Heterogenität, die durch diesen Vererbungsmechanismus erzeugt wird, ermöglicht es Tumoren, sich als Reaktion auf sich ändernde Bedingungen, einschließlich Behandlungen, schnell zu entwickeln, was die bemerkenswerte Fähigkeit einiger Krebsarten erklärt, ihre Genome mit Raten zu verändern, die nicht durch chromosomale Vererbung erklärt; 3) das hohe DNA-Template-Niveau, das durch nicht-Mendelsche Vererbung und Selektion erreicht wird, gepaart mit der veränderten Chromatinorganisation, die durch die von uns demonstrierte zirkuläre Architektur erzeugt wird (identifiziert in enger Zusammenarbeit mit Dr. Howard Chang), führt zu einer massiven Transkription von Onkogenen. Zusammengenommen beginnen diese Merkmale zu erklären, warum einige Krebsarten genomisch zu explodieren und sich zu verändern scheinen, warum sie keine reinen selektiven Sweeps durchlaufen und warum jede Zelle im Tumor in der Lage zu sein scheint, den gesamten Tumor mit seinem gesamten Spektrum an Heterogenität bei einigen Krebsarten zu rekapitulieren. Es gibt auch einen Einblick, warum gezielte Therapien gegen auf ecDNA amplifizierte Onkogene nicht so erfolgreich waren wie erwartet.

Anindya Dutta: Es ist bekannt, dass lange eccDNAs, die bei Krebserkrankungen durch Karyotypisierung sichtbar sind, auch Doppelminuten oder ecDNAs genannt, Onkogene tragen, die amplifiziert werden, um Krebs zu fördern. Jüngste Ergebnisse legen nahe, dass es eine große Population kleinerer eccDNAs mit einer Länge von < 1000 bp gibt, die 90% der eccDNA in normalen Zellen und Krebszelllinien ausmachen. Krebszellen enthalten auch längere ecDNAs, die durch Karyotypisierung nicht immer sichtbar sind und deren Größe von 1 kb bis zu 5 Minuten reicht. Die Kreise, die lang genug sind, um volle Gene zu enthalten, können die Gene überexprimieren und verstärken. Dies ist sehr wichtig für Krebserkrankungen, die die langen ecDNAs enthalten. Die Funktion der kleinen Kreise ist unklar, aber wir haben gezeigt, dass sie RNAs in einer deregulierten Weise exprimieren können und dass die RNAs zu mikroRNAs und kleinen interferierenden RNAs verarbeitet werden, um zelluläre Gene zu unterdrücken.

Für mich bleibt die größte Überraschung unsere ursprüngliche Entdeckung, wie allgegenwärtig die eccDNAs sind, selbst in normalen Geweben und die Tatsache, dass die meisten von ihnen somatisch mosaikartig sind (unterschiedlich zwischen verschiedenen Zellen), selbst bei Krebs. Nur wenn sie Zellen einen selektiven Vorteil verschaffen, wie es eccDNAs, die Onkogene tragen, bei Krebserkrankungen tun, wird dieselbe eccDNA in vielen Zellen eines Krebses gesehen.

Birgitte Regenberg: Das zu finden: 1) eccDNA ist ein häufiges genetisches Element in eukaryotischen Zellen, 2) eccDNA kann aus allen Teilen eukaryotischer Genome entstehen, 3) Selektion kann zur Co-Amplifikation von Enhancern und Onkogenen auf komplexen eccDNA in Tumoren führen, 4) Bestimmte Loci scheinen eccDNA in Hefe (CUP1 und HXT6 HXT7) rezidivierend und mit hoher Rate zu bilden. Das letztere Ergebnis ist wirklich interessant, da es darauf hindeutet, dass eccDNA eine wichtige Rolle in der Evolution spielen kann, indem sie sich schnell an Veränderungen in der Umwelt anpasst (hohe Cupper, CUP1 und niedrige Glucose, HXT6 HXT7).

Dennis Lo: Meine Gruppe interessierte sich zum ersten Mal für eccDNA, als wir nach zirkulären DNA-Molekülen im menschlichen Plasma suchten. Unsere Reise begann mit der Untersuchung der mitochondrialen DNA (mtDNA), die in einem Mitochondrium als kreisförmiges Stück DNA-Molekül von ungefähr 16 kb existiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl zirkuläre als auch lineare mtDNA-Moleküle im menschlichen Plasma existieren. Eine Überraschung dieser Arbeit ist unsere Demonstration, dass die zirkulären mtDNA-Moleküle und die linearen mtDNA-Moleküle unterschiedliche Ursprungsgewebe haben. Daher stammen die zirkulären mtDNA-Moleküle überwiegend aus dem hämatopoetischen System, während die linearen mtDNA-Moleküle überwiegend aus der Leber stammen.

Seitdem haben wir unsere Arbeit auf die Suche nach eccDNA im Plasma ausgeweitet. Insbesondere haben wir gezeigt, dass fetale eccDNA-Moleküle im Plasma schwangerer Frauen nachweisbar sind. Unsere Gruppe interessiert sich seit vielen Jahren für die Größenverteilung zirkulierender DNA. Es ist interessant festzustellen, dass eccDNA-Moleküle im mütterlichen Plasma (mit markanten Größenpeaks bei 202 bp und 338 bp) eine längere Größenverteilung aufweisen als lineare DNA-Moleküle (modale Größe bei 166 bp). Unsere früheren Arbeiten an linearen DNA-Molekülen im Plasma zeigten, dass lineare fetale DNA-Moleküle im mütterlichen Plasma eine etwas kürzere Größenverteilung aufweisen als die linearen DNA-Moleküle mütterlichen Ursprungs. Eine weitere Überraschung unserer Arbeit ist, dass wir eine ähnliche Kurzatmigkeit der zirkulierenden fetalen eccDNA-Moleküle im Vergleich zu denen mütterlichen Ursprungs beobachtet haben.

Was ist Ihre bevorzugte Hypothese bezüglich des Produktionsmechanismus von eccDNAs in Zellen? Welche Beweise gibt es, um diese Hypothese zu stützen?

Anindya Dutta: Ich denke, die eccDNAs werden als Nebenprodukt der DNA-Reparatur produziert. Der Hauptbeweis dafür ist, dass sie durch Agenten erhöht werden, die DNA-Schäden erhöhen, und wir haben berichtet, dass bestimmte DNA-Reparaturgene wie MSH3 (beteiligt an der Mismatch-Reparatur) erforderlich sind, um eccDNAs zu produzieren.

Birgitte Regenberg: Ich bevorzuge ein Modell, bei dem jede Form von DNA-Schädigung durch die bekannten DNA-Reparaturmechanismen potenziell zur DNA-Zirkularisierung führen kann. Dies beinhaltet ihre Bildung durch homologe Rekombination, Mikrohomologie und nichthomologe Endverbindung zusammen mit anderen DNA-Reparaturwegen. Die meisten unserer Beweise basieren auf der Homologie um den chromosomalen Haltepunkt, der zu eccDNA führte, und ich denke, dass Mutantenstudien immer noch erforderlich sind, um die Kausalität festzustellen. Re-Replikation könnte auch zirkuläre DNA produzieren, wie im Origin-Dependent Inverted-Repeat Amplification Model (von Maitreya Dunham) erklärt, aber wir müssen noch untersuchen, wie wichtig dieser Mechanismus ist. Neben den Zufallsprozessen bilden sich einige Kreise durch gerichtete Rekombination (die T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreise) und Retrotransposition, wenn lange terminale Repeat-eccDNA aus der Zirkularisierung extrachromosomaler linearer DNA während des Transpositionslebenszyklus von Retrotransposons entstehen.

Anton Henssen: Basierend auf veröffentlichter Literatur und unseren eigenen Beobachtungen glaube ich, dass es viele verschiedene Mechanismen geben könnte, die zur eccDNA-Generierung beitragen. EccDNA kann durch katastrophale Genomumlagerungsprozesse wie Chromothripsis erzeugt werden, aber es gibt auch andere Prozesse der genomischen Instabilität, die zu ihrer Bildung beitragen können.

Paul Mischel: Auch hier werde ich meine Antworten auf ecDNA bei Krebs konzentrieren. Es gibt eine historische Ansicht der ecDNA-Bildung, oder zu dieser Zeit Doppelminutenbildung genannt, in dem etwas passiert, das zur Entfernung eines DNA-Abschnitts von seinem nativen chromosomalen Ort führt, gefolgt von Replikation und Amplifikation als ecDNA. Forscher, darunter Robert Schimke, Geoff Wahl, Nicholas Vogt und Bernard Malfoy, trugen zu diesem Wissen bei. Die genauen molekularen Mechanismen, ihre Beziehung zu möglichen Anomalien im DNA-Schädigungs- und Reaktionssystem, sind noch unvollständig verstanden. Es ist ein Bereich der aktiven Forschung, auch in unserem Labor. Darüber hinaus hatten David Pellman und andere vorgeschlagen, dass Chromothripsis, die auftritt, wenn ein nacheilendes Chromosom „stecken bleibt“, in einen Mikronukleus gelegt und effektiv zerhackt wird, möglicherweise ecDNA bilden könnte. Jüngste experimentelle Arbeiten von Peter Ly und Don Cleveland, in denen sie ein chromothriptisches Y-Chromosom entwickelten, legen nahe, dass Chromothripsis zur ecDNA-Bildung als Mechanismus der Genamplifikation führen kann. Daher ist es durchaus möglich, dass mehrere Mechanismen zur ecDNA-Bildung führen, die dann durch Selektion beeinflusst wird. Es wird wichtig sein, ein tieferes mechanistisches Verständnis der Prozesse zu entwickeln, die zur ecDNA-Bildung beitragen.

Dennis Lo: In unserer Größenverteilungsanalyse mit eccDNA-Molekülen im mütterlichen Plasma haben wir eine Reihe verräterischer Hinweise auf nukleosomale Signaturen beobachtet. Zum Beispiel haben wir eine Periodizität von 10 bp in der Größenverteilung in der Nähe der markanten Größenpeaks von 202 bp und 338 bp beobachtet. Unsere Vermutung ist, dass die Größe von 202 bp ungefähr der eines Nukleosomenkerns plus zwei Linker entspricht, während die Größe von 338 bp ungefähr der von zwei Nukleosomenkernen plus zwei Linkern entspricht. Eine weitere bemerkenswerte Beobachtung ist, dass wir unter den am häufigsten beobachteten eccDNA-Molekülen im mütterlichen Plasma vier Sätze von Trinukleotidmotiven an der Verbindungsstelle eines eccDNA-Moleküls beobachtet haben. An einer solchen Stelle sind das erste und das dritte Motiv direkte Wiederholungen, während das zweite und vierte ein weiterer Satz direkter Wiederholungen sind. Wir hoffen, dass diese Beobachtungen zu einem besseren Verständnis des Produktionsmechanismus von eccDNA beitragen werden. Wir verstehen voll und ganz, dass wir nicht alle Informationen haben, um ein vollständiges Modell zu erstellen, aber wir glauben, dass das Feld als Ganzes in diese Richtung voranschreitet.

Was ist über eccDNAs und Krebs bekannt? Auf welche Weise tragen eccDNAs zu den malignen Eigenschaften von Krebszellen bei?

Paul Mischel: Wir haben Folgendes gelernt: 1) ecDNAs scheinen exklusiv für Krebs zu sein, oder zumindest haben wir es noch nicht in normalen Zellen gesehen, 2) ecDNAs treiben eine hohe Onkogen-Kopienzahl an und erhalten die intratumorale genetische Heterogenität durch ihren Mechanismus der nicht-mendelschen, nichtchromosomalen Vererbung aufrecht; 3) ecDNAs können aufgrund dieses Vererbungsmechanismus ihre Genome schnell verändern, auch um Therapien zu umgehen; 4) Das hohe DNA-Template-Niveau von ecDNA, gekoppelt mit der veränderten Chromatin-Architektur, treibt die massive Onkogen-Transkription an und kann das Epigenom wege, die zur Tumorgenese beitragen.

Anton Henssen: ecDNA ist nicht nur ein Vehikel für die Onkogenamplifikation, sondern kann durch ihre Reintegration in das lineare Genom auch zur Genomumgestaltung beitragen. Wir haben gezeigt, dass die zirkuläre DNA-Reintegration zu einer Störung funktionell wichtiger genomischer Regionen führt und dass diese Störung zu vielen bösartigen Merkmalen von Krebszellen beitragen kann.

Birgitte Regenberg: Wir wissen, dass die Amplifikation einer Reihe von Onkogenen auf eccDNA mit Krebs korreliert und Krebspatienten mit bestimmten eccDNA-Amplifikationen eine schlechte Prognose haben. Eine Überexpression von Onkogenen wie MYC und EGFR auf eccDNA wird wahrscheinlich Zellen umprogrammieren und den tumorigenen Zustand induzieren.

Anindya Dutta: Die Kreise in Krebs sind länger als die in normalen Zellen, und es wurde vorgeschlagen, dass sie einen anderen Namen bekommen: ecDNAs. Wir wissen jetzt, dass sie in fast allen Krebsarten vorhanden sind, aber nicht groß genug sind, um durch Zytogenetik als Doppelblind nachweisbar zu sein. Die langen ecDNAs tragen komplette Gene, und wenn diese Gene Onkogene oder Krebstreiber-Gene sind, ermöglichen die ecDNAs ihre Überexpression und Verstärkung. Zum Beispiel tragen ecDNAs die folgenden Onkogene: Das MDM2-Onkogen (ursprünglich in einer Doppelminute entdeckt) inaktiviert den p53-Tumorsuppressor, während das EGFR-Onkogen Gliom- und Glioblastomzellen hyperreagierend auf EGF macht. Da ecDNAs nicht gleichmäßig zwischen Tochterzellen getrennt sind, erleichtert die zufällige Verteilung der Kreise zwischen Tochterzellen einigen Töchtern, mehr Kopien der Kreise zu erhalten und somit einen Wachstumsvorteil zu erzielen, indem sie mehr von einem codierten Onkogen exprimieren. Somit erleichtert die nicht-mendelsche Vererbung der DNA-Kreise der Krebszelle die Amplifikation von Kreisen, die dem Krebs einen Wachstumsvorteil verschaffen.

Glauben Sie, dass eccDNAs als Biomarker für die Beurteilung von Krankheiten dienen könnten, auf welche Weise und wie?

Dennis Lo: Ich denke, dass eccDNA-Moleküle im Plasma eine interessante Richtung für die Biomarkerforschung wären. Eine Herausforderung besteht darin, dass ihre Gesamtkonzentration wesentlich niedriger zu sein scheint als die linearer DNA-Moleküle im Plasma. Die große Größenverteilung von eccDNA-Molekülen im Plasma hat den Vorteil, dass längere Moleküle potenziell mehr genetische und epigenetische Informationen aus dem Ursprungsgewebe tragen würden.

Anindya Dutta: Wir haben bereits gezeigt, dass eccDNAs 1) von Tumoren und vom Fötus ins Blut freigesetzt werden und 2) im Pool zellfrei zirkulierender DNA nachgewiesen und quantifiziert werden können. Weil sie länger sind (Mittelwert: 250 Basen) als lineare zellfrei zirkulierende DNA (Mittelwert: 150 Basen) und stabilere, zirkulierende zellfreie eccDNAs könnten zum Nachweis von Mutationen in Onkogenen (bei Krebserkrankungen) oder zum Nachweis von Mutationen in entwicklungsrelevanten Genen (für nicht-invasive pränatale Tests) nützlich sein. Die längere Größe der Kreise, die bei Krebserkrankungen im Vergleich zu normalem Gewebe beobachtet werden, kann auch als Screening-Tool bei der Flüssigbiopsie von Krebs nützlich sein.

Birgitte Regenberg: Ja, ich denke, dass eccDNA potenziell als Biomarker für eine Reihe von Krankheiten dienen kann, die mit Mutation und genomischer Neuordnung zusammenhängen. EccDNA aus dem T-Zell-Rezeptor-Gen wird bereits zum Nachweis einer schweren kombinierten Immunschwächekrankheit verwendet, und neuere Daten haben gezeigt, dass eccDNA aus einem Fötus im Plasma der Mutter nachgewiesen werden kann. Es scheint wahrscheinlich, dass andere eccDNA im Plasma als Marker für die Überwachung von Krebs dienen können, obwohl die Konzentration von eccDNA im Plasma wahrscheinlich begrenzt ist.

Anton Henssen: In der pädiatrischen Onkologie ist ecDNA in Form von MYCN-haltigen Doppelminutenchromosomen bereits ein etablierter Biomarker für die klinische Risikobewertung bei Patienten mit Neuroblastom. Ich glaube, dass in ähnlicher Weise andere ecDNAs als Biomarker für verschiedene Krankheitseigenschaften in vielen Tumorentitäten dienen könnten.

Paul Mischel: Ja, es gibt beträchtliche Daten, die darauf hindeuten, dass ecDNA ein Biomarker für aggressivere Krebsarten sein könnte und neue Erkenntnisse über die Fähigkeit einiger Krebsarten liefern könnte, sich so schnell zu entwickeln, auch als Reaktion auf Therapien. Es gibt auch zwingende Gründe zu der Annahme, dass Patienten, deren Krebserkrankungen durch ecDNA verursacht werden, möglicherweise anders behandelt werden müssen.

Was ist Ihr bevorzugter Ansatz zur Analyse von eccDNA und was sind die Vorteile?

Birgitte Regenberg: Die meiste eccDNA existiert in niedrigen Kopienzahlen und wird nicht durch Sequenzierung des gesamten Genoms erfasst. Um sowohl eccDNA mit hoher als auch mit niedriger Kopie zu messen, hat mein Labor Methoden zur Isolierung, Sequenzierung und Assemblierung von eccDNA entwickelt (Circle-Seq und Circle-Map, in Zusammenarbeit mit L. Maretty, D. Botstein und M. Mohiyuddin). Diese Methoden ermöglichen es uns, eccDNA genomübergreifend in jeder Zelle und jedem Zustand zu profilieren. Wir können dadurch Einblicke gewinnen, wie eccDNA mit Alter und Krankheit korreliert (Kollaborationen mit J.S. Johansen und Y. Lou), und auf der grundlegenden Ebene zu verstehen, wie sie sich bilden, entwickeln und in einer Population von Zellen zugrunde gehen.

Anindya Dutta: Mein Labor hat hauptsächlich die Amplifikation von Exonuklease-resistenten Kreisen mit zufälligen Hexameren verwendet, gefolgt von einer Sequenzierung des gepaarten Endes (Kreissucher), um die für Kreise charakteristischen Übergänge zu identifizieren. Da die meisten Genomik-Experimente keine Rolling-Circle-Amplifikation beinhalten, können wir die von anderen Gruppen generierten Genomik-Daten nicht erneut analysieren, um Kreise zu identifizieren. Kürzlich haben wir jedoch gezeigt, dass ein Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung einer Sequenzierung (billiger) oder einer Sequenzierung des gesamten Genoms (viel teurer) DNA-Kreise nachweisen kann. Wir hoffen, dass diese weiter verbreiteten Techniken die Identifizierung von Kreisen in bereits vorhandenen Datensätzen ermöglichen. Darüber hinaus zeigt ein kürzlich erschienenes Papier von Dennis Lo und Mitarbeitern, dass Kreise durch Verdauung mit üblichen Schneidrestriktionsenzymen und Sequenzierung der Fragmente für Übergänge nachgewiesen werden können.

Dennis Lo: Wir würden zuerst Plasma-DNA mit einer Exonuklease behandeln, die einen Großteil der linearen DNA-Moleküle in der Probe entfernen würde. Dann würden wir die Kreise entweder mit Restriktionsenzymen oder einer Transposase aufschneiden, um lineare DNA-Moleküle für die weitere Analyse (z. B. DNA-Sequenzierung) zu bilden. Wir denken, dass die Transposase-basierte Methode den Vorteil hat, dass die Transposase-Methode im Gegensatz zum Restriktionsenzym-basierten Ansatz, der die Existenz einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle innerhalb des eccDNA-Moleküls erfordert, potenziell auf jedes eccDNA-Molekül einwirken kann.

Paul Mischel: Mein Kollege Vineet Bafna hat ein leistungsfähiges Toolkit entwickelt, einschließlich Amplicon Architect und Amplicon Reconstructor zur Analyse der ecDNA-Struktur. Tatsächlich werden laufende Arbeiten mit Dr. Bafna und Dr. Verhaak durchgeführt, um ecDNA in öffentlich zugänglichen Datenbanken zur Sequenzierung des gesamten Genoms besser zu analysieren. In enger Zusammenarbeit mit den Kollegen Dr. Howard Chang und Bing Ren verwenden wir Aspekte des „epigenetischen“ Toolkits, um ecDNA bei Krebs zu charakterisieren.

Anton Henssen: Wir isolieren und sequenzieren ecDNA gerne spezifisch mit Long-Read-Sequenzierung, was die Möglichkeit bietet, die Struktur von ecDNA genau abzubilden.

Was sind die Forschungsfragen im Zusammenhang mit eccDNA, die Sie am meisten erforschen möchten?

Paul Mischel: Wir sind sehr daran interessiert, eine Reihe kritischer Fragen im Zusammenhang mit ecDNA zu verstehen, die nicht in der Reihenfolge ihrer Wichtigkeit aufgelistet sind. Erstens, wie entsteht ecDNA und was sind die wichtigsten molekularen „Akteure“, die an ihrer Bildung beteiligt sind? Zweitens, was sind die molekularen Mechanismen, die an der Aufrechterhaltung und Funktion der ecDNA beteiligt sind? Werden unterschiedliche Komponenten verwendet? Werden die gleichen Komponenten unterschiedlich verwendet? Drittens, was sind die klinischen Auswirkungen für Patienten? Kann ecDNA verwendet werden, um uns etwas Wichtiges über den klinischen Verlauf zu erzählen? Viertens können wir Interventionspunkte finden, mit denen neue Behandlungen entwickelt werden können, die Patienten helfen, deren Krebserkrankungen durch ecDNA verursacht werden?

Anton Henssen: Als Physician Scientist bin ich sehr daran interessiert, die Möglichkeiten zu erforschen, unser Verständnis von ecDNA zu nutzen, um neue diagnostische und therapeutische Ansätze für Patienten mit ecDNA-gesteuerten Krebserkrankungen zu finden.

Dennis Lo: Ich möchte die Fähigkeit von eccDNA im mütterlichen Plasma zur Erkennung oder Überwachung von schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen (z. B. Präeklampsie) untersuchen. Ich bin auch daran interessiert, neuere und möglicherweise umfassendere Ansätze für die eccDNA-Analyse zu entwickeln. Mir ist bewusst, dass derzeit verfügbare Methoden in ausgewählten Teilmengen zirkulierender eccDNA-Moleküle eine gewisse Verzerrung aufweisen können.

Anindya Dutta: Ich möchte die Funktionen der eccDNAs finden, die in normalen Zellen vorhanden sind. Weil sie so allgegenwärtig und somatisch mosaikartig sind, wird es sehr aufregend sein, wenn sie zur interzellulären Heterogenität in normalen Geweben beitragen oder zu irgendeiner Form von Pathologie beitragen. Ich möchte auch beschreiben, welche Wege an der Bildung der Kreise in normalen und Krebszellen beteiligt sind, in der Hoffnung, dass die Störung dieser Wege bei Krebserkrankungen es uns ermöglichen wird, Krebserkrankungen von potenziellen Loci der Genamplifikation zu befreien und somit in der Therapie zu helfen. Schließlich möchte ich die Einführung der eccDNA-Sequenzierung in den flüssigen Biopsien von Krebs und in nicht-invasiven pränatalen Tests von genetischen Krankheiten im Fötus sehen.

Birgitte Regenberg: Neben dem Verständnis, wie eccDNA zur genetischen Variation und Evolution eukaryotischer Genome beitragen kann, möchte ich auch verstehen, wie eccDNA in einem Genom gebildet und erhalten wird. Vier Faktoren bestimmen wahrscheinlich den Umsatz einer zirkulären DNA in einer Zelllinie: die Geschwindigkeit, mit der es aus seinem Chromosomenlocus gebildet wird, seine Replikationsfähigkeit, seine Art der Segregation sowie der Wachstumsvorteil oder -nachteil, den es seiner Wirtszelle bietet. Darüber hinaus können eukaryotische Zellen möglicherweise Mechanismen zum Abbau oder zur Sekretion von eccDNA aufweisen. Dies ist besonders wichtig für meiotische Zellen in mehrzelligen Organismen, da eccDNA in der Keimbahn in der nächsten Generation große negative Auswirkungen haben könnte. Jüngste Daten aus Hefe legen nahe, dass meiotische Zellen tatsächlich Mechanismen entwickelt haben, um eine Teilmenge von eccDNA (aus Ünals Labor in Berkley) zu sequestrieren, und es scheint wahrscheinlich, dass dies auch für Keimbahnzellen in mehrzelligen Organismen wie dem Menschen gilt.

Autorenbeiträge

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Bei der Einreichung des Manuskripts haben alle Autoren das Formular zur Offenlegung des Autors ausgefüllt. Angaben und/oder potenzielle Interessenkonflikte:

Beschäftigung oder Führung

R.W.K. Chiu, Klinische Chemie, AACC; YMD Lo, Klinische Chemie, AACC, DRA Limited, Take2 Holdings.

Berater oder beratende Rolle

R.W.K. Chiu, Gral; Y.M.D. Lo, Gral, Decheng Capital; P. Mischel, Boundless Bio, Inc.

Aktienbesitz

R.W.K. Chiu, Grail, DRA Limited, Take2 Holdings; Y.M.D. Lo, Grail, DRA Limited, Take2 Holdings; P. Mischel, Grenzenlose Bio, Inc.

Honorare

Keine deklariert.

Forschungsförderung

R.W.K. Chiu, Gral; A. Dutta, Nationale Gesundheitsinstitute; Y.M.D. Lo, Grail, Hong Kong Research Grants Council Themenbasiertes Forschungsschema T12-403 / 15N und T12-401 / 16W.

Expertenzeugnis

Keine deklariert.

Patente

R.W.K. Chiu, PCT/CN2020/081066; A. Dutta, USA PPA 62832443; Y.M.D. Lo, Multiple patents and patent applications in diagnostic applications of cell-free DNA; P. Mischel, SD-2019-149-1 , SD-2019-149-2 , SD-2019-149-3.

Andere>

A. Dutta, Gordon Research Conference, Cold Spring Harbor Lab, BIH Akademie, Shenzhen Medical School.

Nicht standardisierte Abkürzungen

• eccDNA

  extrachromosomale zirkuläre DNA

• ecDNA

  extrachromosomale DNA

• mtDNA

  mitochondriale DNA