Vergleichende Messung von CNP und NT-proCNP in menschlichen Blutproben: eine methodische Bewertung

Einführung

Natriuretisches Peptid vom C-Typ (CNP), identifiziert 1990 von Sudoh et al., ist das älteste Mitglied der natriuretischen Peptidfamilie. CNP stimuliert selektiv den humanen natriuretischen Peptidrezeptor 2 (NPR2), der die cGMP-abhängige Kinase (cGK) aktiviert, indem er die intrazelluläre Konzentration von cGMP erhöht. Darüber hinaus bindet CNP NPR3 und deaktiviert wiederum die Proteinkinase A durch Gi-proteinabhängige Hemmung der Adenylatcyclase . CNP hat anti-proliferative und anti-migratorische Eigenschaften und wurde auch als Endothel-abgeleiteter Entspannungsfaktor identifiziert . Darüber hinaus hemmt CNP die neointimale Restenose, reduziert den vaskulären konstriktiven Umbau und die kardiale Ischämie-Reperfusionsverletzung . CNP spielt eine wichtige Rolle bei Knochenwachstum, Fortpflanzung, Nervenwachstum, Reendothelialisierung sowie Nieren-, Pankreas- und Herzfunktion . Darüber hinaus wurde kürzlich erkannt, dass CNP an der Entwicklung der atherosklerotischen Plaquebildung beteiligt ist .

Wegen der Fülle von CNP-Funktionen, hat dieses Peptid zunehmendes Interesse an der kardiovaskulären Forschung während der letzten Jahre erreicht. Studien zu CNP-Konzentrationen in Blutproben sind jedoch inkonsistent. Einige dieser Studien maßen Konzentrationen von CNP oder seinem aminoterminalen Pro-Peptid (NT-proCNP) in Serumproben und andere verwendeten Plasmaproben . Leider wurden Details zu möglichen Verzögerungen bei der Blutentnahme und der anschließenden Probenverarbeitung noch nicht gemeldet. In der bisher verfügbaren Literatur liegen keine Daten zum Unterschied der CNP / NT-proCNP-Konzentrationen zwischen Serum- und Plasmaproben vor. Auch der Einfluss der Verzögerung der Blutprobenverarbeitung bleibt unklar. Darüber hinaus variierte die CNP-Konzentration in Serum- und Plasmaproben deutlich (Tabelle 1). Ziel dieser Studie war es daher, die folgenden methodischen Fragen zu beantworten: (1) Verursacht eine verzögerte Verarbeitung der bei Raumtemperatur gelagerten Blutproben eine Verzerrung? (2) Gibt es einen Unterschied zwischen Serum- und Plasmakonzentrationen von CNP oder NT-proCNP? (3) Sind diese Unterschiede zeitabhängig?

Methoden

Wir untersuchten 12 männliche Freiwillige (Durchschnittsalter 29 ± 2 Jahre, Normalgewicht, keine medikamentöse Therapie, keine kardiovaskulären oder anderen Erkrankungen in der Vorgeschichte, 3 Raucher). Von allen untersuchten Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Drillinge von Nüchternblutproben wurden allen Freiwilligen um 8 Uhr morgens entnommen. Blutproben wurden mit dem 7,5 ml S-Monovette®-Entnahmesystem (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) entnommen, das entweder Gerinnungsaktivator (Kaolin) für Serumproben, Natriumcitrat für Plasmaproben oder Kalium–EDTA für Vollblutproben enthielt. Alle Proben für Baseline-Analysen wurden sofort bei 2.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand wurde bis zur Analyse bei -70°C gelagert. Für zwischenzeitliche Analysen (30 Minuten oder 2 Stunden) wurden Plasmaproben bei 2.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Überstand wurde entfernt und 30 min oder 2 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Nach der Blutgerinnung wurden Serumproben identisch mit Plasmaproben verarbeitet. Überstand wurde gespeichert und ebenfalls 30 min oder 2 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Vollblutproben wurden bei Raumtemperatur ohne Zentrifugation gelagert. Nach 30 min oder 2 Stunden wurden Vollblutproben bei 2.000 ×g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bis zur Analyse bei -70°C gelagert. Die CNP-Konzentration wurde mit dem CNP-22 EIA Kit (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Deutschland) gemäß Herstellerprotokoll gemessen. Die NT-proCNP-Konzentration wurde unter Verwendung des NT-proCNP-EIA-Kits (Biomedica, Wien, Österreich) gemäß dem Herstellerprotokoll gemessen. Zum Vergleich zwischen den Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. Für paarweise Vergleiche wurde der t-Test angewendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder 95% -Konfidenzintervall (95% -KI) angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde bei p < 0,05 angenommen. Die Daten wurden mit MedCalc® für Windows, Version 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgien) analysiert.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1a gezeigt, betrugen die CNP-Ausgangskonzentrationen in Serum-, Plasma- und Vollblutproben 0,997 ± 0,379 ng / ml, 1,933 ± 0,699 ng / ml bzw. 0,991 ± 0,489 ng / ml. Die Plasmakonzentrationen von CNP waren im Vergleich zu Serum- und Vollblutproben zu allen Zeitpunkten signifikant höher (ANOVA, p = 0,001 zu Studienbeginn, p < 0,001 bei 30 ‚min. und p = 0,003 bei 120‘ min.). Zu keinem Zeitpunkt wurde ein signifikanter Unterschied zwischen Serum- und Vollblutproben beobachtet (ANOVA, p > 0,05). Die Ausgangskonzentrationen von NT-proCNP in Serum-, Plasma- und Vollblutproben betrugen 58,5 ± 28,3 pg / ml, 60,3 ± 23,9 pg / ml bzw. 50,7 ± 21,4 pg /ml (Abbildung 1b). Zu keinem Zeitpunkt wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt (ANOVA, p > 0,05). In Vollblutproben stieg die Laktatkonzentration nach 2 Stunden im Vergleich zum Ausgangswert signifikant an (3,2 ± 0,8 mM vs. 2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). Zusätzlich sank der pH-Wert von 7,34 ± 0.03 zu Studienbeginn auf 7,29 ± 0,03 nach 2 Stunden (p < 0,001).

Diskussion

Unsere Studie ergab, dass CNP und NT-proCNP im Serum und in Vollblutproben für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur stabil sind. Folglich wird die Stabilität des CNP-Peptids höchstwahrscheinlich nicht durch eine Verzögerung der Probenverarbeitung um mindestens zwei Stunden beeinträchtigt. Es wurde bereits berichtet, dass ProCNP (Herstellerprotokoll, unbekannte Lagerbedingungen von Blutproben) für mindestens 2,5 Stunden stabil ist. Dementsprechend bestätigten unsere Experimente die Stabilität von NT-proCNP auch bei Raumtemperatur. Die Konzentration von NT-proCNP in allen Probentypen blieb während des Zeitverlaufs bis zu 2 Stunden konstant, was auf eine lang anhaltende Stabilität dieses Proteins hinweist. Wie in Tabelle 1 aufgeführt, ist die mittlere Konzentration von NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg / ml), die in dieser Studie gemessen wurden, lag innerhalb des gemeldeten Bereichs (siehe Tabelle 1) gesunder Personen (3,7-432 pg / ml).

Im Gegensatz zu NT-proCNP war die Konzentration von CNP in Plasmaproben im Vergleich zu Serum- und Vollblutproben signifikant höher (Abbildung 1). Bisher fanden weder unsere Gruppe noch der technische Dienst des Herstellers Hinweise auf den Einfluss des Probentyps auf den in dieser Studie verwendeten ELISA-Assay. Zu Studienbeginn waren jedoch Plasma- und Vollblutproben mit Ausnahme der Art des verwendeten Blutgerinnungshemmers identisch. Dieser Inhibitor war Natriumcitrat in der Plasmagruppe und EDTA in der Vollblutprobengruppe. Vollblutproben zeigten vergleichbare Ergebnisse wie Serumproben (p = 0,98). Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass Natriumcitrat die gemessene CNP-Konzentration im Plasma signifikant beeinflusst und folglich die mit dieser Technik erzielten Ergebnisse verfälscht.

Unerwarteterweise waren die CNP-Ausgangskonzentrationen sowohl in Plasma- als auch in Serumproben etwa tausendfach höher als in anderen Berichten (Tabelle 1) . In allen diesen Studien wurde der Radioimmunoassay (RIA-Kit) zur Bestimmung der CNP-Konzentrationen verwendet. Im Gegensatz dazu waren in zwei anderen Studien die gemessenen CNP-Konzentrationen in Serum- und Plasmaproben in Bezug auf die Größe der Dimension mit unseren Ergebnissen vergleichbar . Interessanterweise wurde in den letzteren Studien das gleiche ELISA-Kit verwendet wie in unserer Untersuchung. Auch nach umfangreicher Auswertung verschiedener interner und externer Faktoren konnte keine zufriedenstellende Erklärung für diese Diskrepanz gefunden werden. Kontrollmessungen mit exogenem CNP im Humanserum ergaben einen nicht signifikanten Messfehler von +7,8% (95%-KI: –). Das für die Referenzkurve verwendete CNP-Peptid wurde vom Hersteller selbst synthetisiert (Phoenix). Im Gegensatz dazu wurde das als „exogene“ Kontrolle verwendete CNP-Peptid von Bachem bereitgestellt. Wie von beiden Herstellern versichert, waren die Aminosäuresequenzen identisch und in beiden Peptiden wurden Disulfidbindungen gebildet.

Die Ergebnisse der internen Kontrollmessungen lassen sich jedoch wie folgt zusammenfassen: Erstens zeigten die Kontrollmessungen, die in unserer Studie durchgeführt wurden, dass die ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers ordnungsgemäß verwendet wurden. Zweitens bestätigten Messungen mit Kontrollproben die Eignung der angewendeten Standardkurve. Drittens zeigten Kontrollserumproben, die exogenes CNP enthielten, eine akzeptable Genauigkeit und die Ergebnisse lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung. Viertens ist eine höhere Konzentration von CNP in Plasmaproben höchstwahrscheinlich ein Artefakt, das durch Natriumcitrat verursacht wird.

Wie von Clerico und Mitarbeitern berichtet, sind auch vergleichbar große Unterschiede in den Ergebnissen zwischen verschiedenen RIA- und EIA-Methoden bekannt, z. B. ANP und BNP . Clerico und seine Mitarbeiter kamen zu dem Schluss, dass die großen Unterschiede in diesen Ergebnissen höchstwahrscheinlich auf die Spezifität der verwendeten monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, das Design des Immunoassay-Systems (kompetitiver vs. nicht kompetitiver Assay), die verwendete analytische Matrix (Serum vs. EDTA vs. heparinisiertes Plasma) und die Vielzahl zirkulierender Formen natriuretischer Peptide zurückzuführen sind, wie zuvor für ANP- und BNP-Immunoassays berichtet . Diese methodischen Biasquellen können auch für CNP- und NT-proCNP-Assays denkbar sein und erklären damit den großen Unterschied in den Ergebnissen der zitierten Studien (Tabelle 1).

Einschränkungen der Studie

Wir erkennen an, dass eine Stichprobengröße von 12 zu klein ist, um zu dem Schluss zu kommen, dass es überhaupt keinen Unterschied gibt. Aus statistischer Sicht wäre es jedoch wichtig zu spezifizieren, wie groß der Unterschied sein muss, um medizinisch relevant zu sein. Letzteres ist unseres Wissens noch nicht klar definiert. Daher wurden in der Abbildung die Mittelwerte und 95% -Konfidenzintervalle aller Messungen angegeben, damit jeder Leser auch seine eigene Interpretation aus den Daten ziehen kann.

In Bezug auf die Serum- und Plasmakonzentrationen ist zu erwähnen, dass die in Tabelle 1 angegebenen Werte mit unterschiedlichen Methoden (RIA, ELISA) bei Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen gemessen wurden. Es wäre sehr hilfreich gewesen, CNP-RIA mit CNP-ELISA-Assays direkt mit denselben Proben zu vergleichen, da ein tausendfacher Unterschied in der Größenordnung spürbar bleibt. Leider waren RIA-Assays-Messungen in unserem Labor nicht verfügbar. Für die NT-proCNP-Konzentration wurde der letztgenannte Vergleich von Olney und Mitarbeitern untersucht, die zeigten, dass der kommerzielle ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wien, Österreich) Werte ergab, die durchschnittlich 21% (Bereich 11-52%) der RIA-Werte betrugen. Die Kreuzvalidierung des Referenzstandards des ELISA-Kits unter Verwendung des RIA-Assays zeigte eine Meinungsverschiedenheit von 15% .

Zusammenfassung

Messungen von CNP und NT-proCNP waren höchstwahrscheinlich nicht von der Verzögerung der Probenprozession oder der Art der Blutprobe betroffen (mit Ausnahme von CNP in Plasmaproben). Für Plasmaproben waren nur EDTA-antikoagulierte Blutproben für den in dieser Studie verwendeten CNP-ELISA-Assay geeignet. Folglich könnte die Konzentration von CNP und NT-proCNP in klinischen Anwendungen verwendet werden, um CNP-Effekte zu bestimmen. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass die Konzentration von NT-proCNP, die nur ein Nebenprodukt des aktiven Peptids ist, die wahre Natur von CNP verbergen kann. Die Diskrepanz bei den gemessenen CNP-Konzentrationen, die entweder durch RIA-Assays oder durch ELISA-Assays bestimmt wurden, bleibt jedoch weiterhin ungeklärt, scheint jedoch höchstwahrscheinlich auf methodische Probleme zurückzuführen zu sein. Daher müssen, wie für ANP und BNP empfohlen, Immunoassays für CNP auch in Zukunft standardisiert oder harmonisiert werden.