Antikörper
An Dynabeads konjugiertes Kaninchen-IgG (Sigma) wurde gegen TAP-markierte Stämme verwendet, bei denen der TAP-Tag, der Protein A enthielt, das Ziel war. Der Antikörper Millipore 07-729 wurde gegen K562-Proben verwendet, die auf CTCF abzielten.
Tn5>
Ein benutzerdefiniertes Konstrukt von Tn5 E54K E110K P242A L372P14 in einem pET-45b (+) -Vektor wurde bestellt (GenScript), um hyperaktives Tn5 mit einem N-terminalen His6-Tag zu exprimieren. Das Plasmid ist bei Addgene erhältlich (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) -kompetente E. coli-Zellen (New England Biolabs) wurden transformiert und eine einzelne Kolonie wurde bei 37 °C zu einem OD600 von 0,4 in 500 ml LB + 50 µg/ml Ampicillin + 30 µg/ml Chloramphenicol gezüchtet. Die Zellen wurden in einen 25°C Inkubator überführt und mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-galactopyranosid für 4 h induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit ST-Puffer gewaschen und das Zellpellet in flüssigem Stickstoff blitzgefroren.
Tn5 wurde wie zuvor beschrieben10 mit wenigen Modifikationen gereinigt. Kurzzeitig wurden Zellen in 10 Volumina (ml/g) TEGX100 Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,1% Triton-X 100) enthaltend CPI und 100 µM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert und durch Inkubation mit Lysozym (Sigma; 1 mg/1 g Zellpellet) bei Raumtemperatur für 30 min lysiert. Das Lysat wurde bei 20.000 ×g für 20 min bei 4°C zentrifugiert, der Überstand mit 0,25% Polyethylenimin (Sigma) gefällt und bei 10.000×g für 15 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand mit 47% igem Ammoniumsulfat (0.28 g/ml) über eine Inkubation von 30 min und zentrifugierte anschließend 15 min bei 20.000 ×g.
Das Pellet wurde dann in 50 ml Nickel-Affinitäts-Beladungspuffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% Glycerin) resuspendiert und auf eine HisTrap HP Säule (GE Healthcare; 5 ml) mit 1,5 ml/min equilibriert mit dem gleichen Puffer beladen. Die Säule wurde nacheinander mit Waschpuffer I (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM Imidazol, 20% Glycerin), Waschpuffer II (50 mM Kaliumphosphat, pH 7) gewaschen.4, 500 mM KCl, 50 mM Imidazol, 20% Glycerin) und anschließend wurde Tn5 mit Nickel-Affinitäts-Elutionspuffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM Imidazol, 20% Glycerin) bei 2 ml/min eluiert. Das Eluat wurde mit Verdünnungspuffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 20% Glycerin) auf 300 mM KCl verdünnt und das Endvolumen mit TEGX300-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,1% Triton-X 100) auf 50 ml eingestellt.
Als nächstes wurde die Probe auf eine HiTrap Heparin HP Säule (GE Healthcare; 1 ml) geladen, die mit TEGX300 bei 1 ml/min äquilibriert wurde. Nach Waschen mit 5 Säulenvolumina Puffer wurde ein 10 ml linearer (300 mM bis 1,2 M) NaCl-Gradient eluiert. Tn 5 eluierte bei ca.600 mM NaCl aus der Säule. Fraktionen, die den Hauptelutionspeak enthielten, wurden vereinigt (3,5 ml) und über Nacht gegen TEGX300-Puffer mit 30% Glycerin dialysiert und dann bei -80°C gelagert.
Hefe-Chromatin-Präparation
TAP-markierte Saccharomyces cerevisiae-Stämme (Open Biosystems) wurden in 500 ml Hefe-Pepton-Dextrose-Medien auf einen OD600 = 0,8 bei 25 °C gezüchtet. Zellen wurden mit Formaldehyd bei einer Endkonzentration von 1% für 15 min bei Raumtemperatur vernetzt und mit einer Endkonzentration von 125 mM Glycin für 5 min gequencht. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 1 ml ST-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) bei 4°C gewaschen und in zwei Aliquots aufgeteilt. Die Zellen wurden erneut pelletiert, der Überstand entfernt und das Pellet blitzgefroren.
Ein 250 ml Kulturaliquot wurde in 750 µl FA-Lysepuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% Natriumdeoxycholat und CPI) und 1 ml Volumen von 0,5 mm Zirkonoxid / Silica-Perlen durch Beadbeating in einer Mini-Beadbeater-96-Maschine (Biospec) für drei Zyklen von 3 min on / 5 min Off-Zyklen (Proben wurden während des Off-Zyklus auf Eis gehalten). Das Lysat wurde in ein neues Röhrchen überführt und bei maximaler Geschwindigkeit für 3 min bei 4 ° C mikrozentrifugt, um das Chromatin zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 750 µl FA-Lysepuffer, ergänzt mit 0,1% SDS, resuspendiert und in ein 15 ml Polystyrol-Konusrohr überführt. Die Probe wurde dann in einem Bioruptor (Diagenode) für 15 Zyklen mit 30 s Ein / Aus-Intervallen beschallt, um DNA-Fragmente von 100 bis 500 bp Größe zu erhalten. Ein ChIP-Exo-Assay verarbeitete das Äquivalent von 50 ml Zellkultur (~ 6 × 108 Zellen). Dies stellt eher einen geeigneten als einen erforderlichen Mindestbetrag dar.
K562-Chromatinpräparation
Menschliche chronisch myeloische Leukämiezellen (K562, ATCC) wurden in DMEM-Medien, die mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C mit 5% CO2 ergänzt wurden, zwischen 1 × 105 und 1 × 106 Zellen / ml gehalten. Die Zellen wurden mit PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl und 2,7 mM KCl) gewaschen, dann mit Formaldehyd bei einer Endkonzentration von 1% für 10 min bei Raumtemperatur vernetzt und mit einer Endkonzentration von 125 mM Glycin für 5 min gequencht. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen in 1 ml PBS zum Waschen resuspendiert. Die Zellen wurden aliquotiert, um 100 Millionen Zellen zu enthalten, zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde blitzgefroren.
Ein 100 Millionen Zellen Aliquot (zur Verwendung in mehreren ChIPs) wurde in 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 und kompletter Proteaseinhibitor (CPI, Roche)) durch Inkubation auf Eis für 10 min. Das Lysat wurde 5 min bei 2500 rpm bei 4°C mikrozentrifugt. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet in 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS und CPI) resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert, um die Kerne zu lysieren. Die Probe wurde mit 600 µl Immunpräzipitationsverdünnungspuffer (IP-Verdünnungspuffer: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 und CPI) auf eine Endkonzentration von (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0) verdünnt.2% SDS und CPI) und mit einem Bioruptor (Diagenode) für 10 Zyklen mit 30 s Ein / Aus-Intervallen beschallt, um DNA-Fragmente von 100 bis 500 bp Größe zu erhalten.
Präparation von Mausgewebe
Gehirn-, Lungen-, Leber- und Nierengewebe von 16 Wochen alten erwachsenen männlichen Mäusen wurden großzügig von Dr. Yanming Wang zur Verfügung gestellt Mausgewebe wurden mit 100 mg verarbeitet und Chromatin wurde wie zuvor beschrieben21 mit geringfügigen Modifikationen erzeugt. Kurz gesagt, 100 mg Mausgewebe wurden auf Eis zerkleinert, 10 min mit 1% Formaldehyd fixiert und dann 5 min mit einer Endkonzentration von 125 mM Glycin abgeschreckt. Die Zellen wurden versponnen, mit PBS gewaschen und anschließend in 1 ml kaltem Farnham-Zelllysepuffer (20 mm Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 und CPI) resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf einem Rototorque für 20 min bei 4 C inkubiert. Isolierte Kerne wurden durch Abspinnen isoliert und in RIPA-Kernlysepuffer (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxycholat, 0,5% SDS und CPI) resuspendiert. Kerne wurden dann mit einem Bioruptor (Diagenode) für 10 Zyklen mit 30 s Ein / Aus-Intervallen beschallt, um DNA im Größenbereich von 100-500 bp zu erzeugen. Die Anzahl der Leberzellen wurde wie zuvor beschrieben22 geschätzt, wobei ein Umrechnungsfaktor von 1 mg verwendet wurde, dessen Gewicht ~ 250.000 Zellen entspricht.
Chromatinimmunpräzipitation
Ein 50 ml Kulturäquivalent Hefe oder 10 Millionen Zelläquivalent K562 Chromatin wurde mit IP-Verdünnungspuffer auf 200 µl verdünnt und über Nacht bei 4°C mit dem entsprechenden Antikörper inkubiert. Den Hefeproben wurde ein 10 µl Bettvolumen IgG-Dynabeads zugesetzt; und 3 µg Anti-CTCF-Antikörper mit einem 10 µl Slurry-Äquivalent Protein A Mag Sepharose (GE Healthcare) wurden zu den K562-Proben gegeben.
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1 wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt7,8,23. Kurz gesagt, die folgenden enzymatischen Schritte wurden mit immunpräzipitiertem Chromatin noch auf dem Harz mit mehreren Salzwäschen zwischen jedem Schritt durchgeführt: T4-DNA-Polymerase-Endoskopie, T4-Polynukleotidkinase, Klenow-Fragment-A-Tailing, T4-DNA-Ligase-vermittelte Read_29-Ligation, phi29-DNA-Polymerase-Fill-in, zweite T4-Polynukleotidkinase, Lambda-Exonuklease-Verdauung und RecJf-Exonuklease-Verdauung. Nach Reverse Crosslinking und Proteinase K-Behandlung über Nacht wurden folgende Schritte in Lösung durchgeführt: phi29 Primer Extension, zweites Klenow Fragment A-Tailing, T4 DNA Ligase-vermittelte Read_1 Adapter Ligation und PCR.
Chip-exo 3.0 und 3.1 (tagmentierungsbasierte Version)
Nach Immunpräzipitation wurden folgende Schritte am Harz durchgeführt. Zur Assemblierung der Transposase wurde Tn5 in einem 10× Transposase-Mix mit folgenden Komponenten inkubiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert: 12,5 µM Tn5, 50% Glycerin und 7,5 µM Adapter (NexA2/ME comp). Siehe ergänzende Tabelle 1 für Oligonukleotidsequenzen, die in dieser Studie verwendet wurden.
Das Chipmaterial auf Harz wurde sequentiell mit FA-Lysepuffer, NaCl-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0) gewaschen.1% Natriumdeoxycholat), LiCl-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Natriumdeoxycholat) und 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C
Die Tagmentierungsreaktion (30 µl) enthaltend: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% Dimethylformamid und 1× Tagmentierungslösung Mischung aus Schritt 1 (Endkonzentration: 1,25 µM Tn5, 5% Glycerin, 750 NMR) wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurde das Harz zweimal mit Guanidinhydrochlorid-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM Guanidinhydrochlorid, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0) gewaschen.1% Natriumdeoxycholat) für 5 min bei 37°C, dann einmal mit LiCl-Puffer und 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C
Die Fill-in-Reaktion (30 µl) enthaltend: 10 U phi29-Polymerase (NEB), 1 × phi29-Reaktionspuffer (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA und 165 µM dNTPs wurde für 20 min bei 30 °C inkubiert °C; dann gewaschen mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C. Die Kinase-Reaktion (30 µl) enthaltend: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA-Ligase-Puffer (NEB) und 2 × BSA wurde für 15 min bei 37°C inkubiert; dann gewaschen mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C. Der λ-Exonuklease-Aufschluss (100 µl) enthaltend:: 20 U λ-Exonuklease (NEB), 1 × λ-Exonuklease-Reaktionspuffer (NEB), 0,1% Triton-X 100 und 5% DMSO wurde 30 min bei 37°C inkubiert; anschließend mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Der RecJf-Exonuklease-Aufschluss (100 µl) enthaltend: 75 U RecJf-Exonuklease (NEB), 2× NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100, und 5% DMSO wurde für 30 min bei 37°C inkubiert; dann wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen.
DNA wurde aus dem Harz eluiert und eine Reverse-Cross-Linking- und Proteinase-K-Behandlung durchgeführt (40 µl) enthaltend: 30 µg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl und 0,5% SDS für 16 h bei 65°C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und mit Agencourt AMPure Magnetic Beads (Beckman Coulter) nach Herstellerangaben und unter Zugabe von 1,8 × Volumen AMPure Slurry zum DNA-Volumen (72 µl) gereinigt.Die Probe wurde von den AMPure Beads in 10 µl Wasser eluiert und die folgenden enzymatischen Schritte in Lösung durchgeführt.
Adapterligation (Version 3.0): für die Primerverlängerungsreaktion (Gesamtreaktionsvolumen 20 µl); zu der resuspendierten Probe wurde 1 × phi29-Reaktionspuffer, 2 × BSA, 100 µM dNTPs und 0,5 µM ME-Sequenz-Oligonukleotid (insgesamt 9 µl) gegeben und 5 min bei 95 ° C und dann 10 min bei 45 ° C inkubiert, damit die Oligozeit tempern konnte. Die Probe wurde vor Zugabe von 10 U phi29-Polymerase (1 µl) auf 30 °C verschoben und 20 min bei 30 ° C inkubiert; dann für 10 min bei 65 ° C zur Inaktivierung und auf 37 ° C verschoben.
Für die A-Tailing-Reaktion (Gesamtreaktionsvolumen 30 µl); zur Primerverlängerungsreaktion wurden 10 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (insgesamt 10 µl) zugegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert, dann für 20 min bei 75°C inaktiviert und auf 25°C verschoben. Für die zweite Adapterligationsreaktion (Gesamtreaktionsvolumen 40 µl); zur A-Tailing-Reaktion wurden 2.000 U T4 DNA Ligase (enzymatics), 1× NEBNext Quick Ligation Buffer (NEB), 375 nM Adapter (ExA1-58/13) und 1 h bei 25°C inkubiert
Schienenligatur (Version 3.1): für Adapterligatur (40 µl); zu der resuspendierten DNA wurden 1.200 U T4 DNA Ligase, 1× T4 DNA Ligase Puffer, 375 nM Adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) gegeben und für 1 h bei 25°C inkubiert.
Beide Versionen 3.0 und 3.1: Die Ligationsreaktion wurde dann mit AMPure Beads gereinigt und in 15 µl Wasser resuspendiert. Anschließend wurde die Probe mittels PCR amplifiziert. Zur PCR-Amplifikation (Gesamtreaktionsvolumen 40 µl); zur resuspendierten DNA wurden 2 U Phusion Hot Start Polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Puffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, je 500 nM Primer (P1.3 und NexA2-iNN) und amplifiziert für 18 Zyklen (20 s bei 98°C Denaturierung, 1 min bei 52°C Annealing und 1 min bei 72°C Extension). Ein Viertel der Reaktion wurde für weitere sechs Zyklen (insgesamt 24) amplifiziert und das Vorhandensein von Bibliotheken durch Elektrophorese an einem 2% igen Agarosegel bestimmt.
Größenauswahl: 200-500 bp PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aus einem 2%igen Agarosegel gelgereinigt.
ChIP-exo 4.0 und 4.1 (Einzelstrang-DNA-Ligationsversionen)
Nach Immunpräzipitation wurden die folgenden Schritte am Harz durchgeführt. Das Chipmaterial auf Harz wurde sequentiell mit FA-Lysepuffer, NaCl-Puffer, LiCl-Puffer und 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Die Endreparaturreaktion (50 µl) enthaltend: 7,5 U T4-DNA-Polymerase (NEB), 2,5 U DNA-Polymerase I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4-DNA-Ligase-Puffer und 390 µM dNTPs wurde 30 min bei 12°C inkubiert; anschließend wurde mit 10 mm Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C. Der λ-Exonuklease-Aufschluss (100 µl) enthaltend: 20 U λ-Exonuklease, 1 × λ-Exonuklease-Reaktionspuffer, 0,1% Triton-X 100 und 5% DMSO wurde 30 min bei 37°C inkubiert; anschließend mit 10 mM Tris-HCl, pH 8 gewaschen.0 bei 4°C. Der RecJf-Exonuklease-Aufschluss (100 µl) enthaltend: 75 U RecJf-Exonuklease, 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 und 5% DMSO swas wurde 30 min bei 37°C inkubiert; anschließend mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen.
Erste Adapterligation: ssDNA-Ligation (Version 4.0, 40 µl ): Zur Adapterion-Ligation wurden 1200 U T4-DNA-Ligase, 1 × T4-DNA-Ligase-Puffer und 375 nM Einzelstrang-Adapter (ExA1-58-N5) für 1 h bei 25°C inkubiert; anschließend mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen.
Splintligation (Version 4.1, 40 µl): 1200 U T4-DNA-Ligase, 1 × T4-DNA-Ligase-Puffer und 375 nM Adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) wurden 1 h bei 25°C inkubiert; dann mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen.
Beide Versionen 4.0 und 4.1: DNA wurde aus dem Harz eluiert und Reverse Cross-Linking und Proteinase-K-Behandlung durchgeführt (40 µl ) enthaltend: 30 µg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl und 0,5% SDS 16 h bei 65 °C inkubiert.
Anschließend wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und mit Agencourt AMPure Magnetic Beads (Beckman Coulter) nach Herstellerangaben gereinigt (1,8 × Volumen). Die Probe wurde von den AMPure Beads in 20 µl Wasser eluiert und die folgenden enzymatischen Schritte in Lösung durchgeführt.
Zweite Adapterligation: ssDNA-Ligation (Version 4.0, Gesamtreaktionsvolumen 40 µl): Zur resuspendierten DNA wurden 1200 U T4-DNA-Ligase, 1× T4-DNA-Ligase-Puffer, 375 nM Adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) zugegeben und 1 h bei 25°C inkubiert.
Splint Adapter Ligation (Version 4.1, Gesamtreaktionsvolumen 40 µl): Zur resuspendierten DNA wurden 1200 U T4 DNA Ligase, 1× T4 DNA Ligase Puffer, 375 nM Adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) zugegeben und für 1 h bei 25°C inkubiert.
Sowohl Version 4.0 als auch 4.1: Die Ligationsreaktion wurde anschließend gereinigt mit AMPure Perlen (1,8 × Volumen) und resuspendiert in 15 µl Wasser. Anschließend wurde die Probe mittels PCR amplifiziert. Zur PCR-Amplifikation (Gesamtreaktionsvolumen 40 µl); zu der resuspendierten DNA wurden 2 U Phusion Hot Start Polymerase (Thermo scientific), 1× Phusion HF Puffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, je 500 nM Primer (P1.3 und NexA2-iNN) gegeben und für 18 Zyklen amplifiziert (20 s bei 98°C Denaturierung, 1 min bei 52°C Annealing, 1 min bei 72°C Extension). Ein Viertel der Reaktion wurde für weitere sechs Zyklen (insgesamt 24) amplifiziert und das Vorhandensein von Bibliotheken durch Elektrophorese an einem 2% igen Agarosegel bestimmt. Größenauswahl: 200 bis 500 bp PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aus einem 2%igen Agarosegel gelgereinigt.
Hinweis: ChIP-exo 4.0 / 4.1 enthält einen universellen Read_2-Adapter, wobei der Barcode später während der PCR mit langen Primern hinzugefügt wird. Wann immer lange PCR-Primer in einer Bibliothekskonstruktion verwendet wurden, die Lambda-Exonuklease-Verdauung beinhaltete, litten die Bibliotheken unter geringer Ausbeute und hohen Adapterdimeren. Wir verwenden jetzt nur noch Adapter in voller Länge und PCR-Primer mit minimaler Länge.
ChIP-exo 5.0
Nach Immunpräzipitation wurden folgende Schritte am Harz durchgeführt. Das Chipmaterial auf Harz wurde sequentiell mit FA-Lysepuffer, NaCl-Puffer, LiCl-Puffer und 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Für die A-Tailing-Reaktion (50 µl) enthaltend: 15 U Klenow-Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2 und 100 µM dATP wurde 30 min bei 37°C inkubiert; anschließend wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Die erste Adapterligation und Kinasereaktionen (45 µl) enthaltend: 1200 U T4 DNA Ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Quick Ligation Buffer, und 375 nM Adapter (ExA2_iNN/ExA2B) wurde 1 h bei 25°C inkubiert; anschließend mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Die Fill-in-Reaktion (40 µl) enthaltend: 10 U phi29-Polymerase, 1 × phi29-Reaktionspuffer, 2 × BSA und 180 µM dNTPs wurde 20 min bei 30°C inkubiert; dann mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen. Der λ-Exonuklease-Aufschluss (50 µl) enthaltend: 10 U λ-Exonuklease, 1 × λ-Exonuklease-Reaktionspuffer, 0,1% Triton-X 100 und 5% DMSO wurde für 30 min bei 37°C inkubiert; dann wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 4°C gewaschen.
DNA wurde aus dem Harz eluiert und eine Reverse-Cross-Linking- und Proteinase-K-Behandlung durchgeführt (40 µl) enthaltend: 30 µg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl und 0,5% SDS wurden 16 h bei 65°C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und mit Agencourt AMPure Magnetic Beads (Beckman Coulter) nach Herstellerangaben gereinigt (1,8 × Volumen).Die Probe wurde von den AMPure Beads in 20 µl Wasser eluiert und die folgenden enzymatischen Schritte in Lösung durchgeführt. Zur zweiten Adapterligation (Gesamtreaktionsvolumen 40 µl): zu der resuspendierten DNA wurden 1200 U T4 DNA Ligase, 1× T4 DNA Ligase Puffer, 375 nM Adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) gegeben und für 1 h bei 25°C inkubiert. Die Ligationsreaktion wurde anschließend mit AMPure Beads (1,8× Volumen) gereinigt und in 15 µl Wasser resuspendiert.
Anschließend wurde die Probe mittels PCR amplifiziert. Zur PCR-Amplifikation (Gesamtreaktionsvolumen 40 µl); zur resuspendierten DNA wurden 2 U Phusion Hot Start Polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Puffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, je 500 nM Primer (P1.3 und P2.1) und amplifiziert für 18 Zyklen (20 s bei 98°C Denaturierung, 1 min bei 52°C Annealing, 1 min bei 72°C Extension). Ein Viertel der Reaktion wurde für weitere sechs Zyklen (insgesamt 24) amplifiziert und das Vorhandensein von Bibliotheken durch Elektrophorese an einem 2% igen Agarosegel bestimmt. Größenauswahl: 200 bis 500 bp PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aus einem 2%igen Agarosegel gelgereinigt.
Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die Verwendung einer anderen Methode als der Gelreinigung in diesem Stadium zu einem unannehmbar hohen Gehalt an Adapterdimeren in der endgültigen Probe führt. Gel reinigung kann effektiv trennen die adapter dimer (150 bp fragment) und kleinere fragmente der ChIP-exo bibliothek (200 bp fragment = 150 bp adapter + 50 bp einfügen).
DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz wurde mit einem NextSeq 500 im Paired-End-Modus durchgeführt, wobei 2 × 40 bp-Lesevorgänge durchgeführt wurden. Sequenzlesungen wurden anschließend mit bwa-mem (v0.7.9a) 24 auf die Genome der Hefe (sacCer3) und des Menschen (hg19) ausgerichtet. Aligned Reads wurden gefiltert, um nicht eindeutige Alignments und PCR-Duplikate zu entfernen. PCR-Duplikate wurden als Sequenzlesungen mit identischen Read_1- und Read_2-Sequenzen definiert.
Datenverfügbarkeit
Alle Sequenzierungsdateien und Peak-Dateien aus dieser Studie sind bei NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) unter den Zugangsnummern GSE110681 und GSE114606 verfügbar. Koordinatendateien, Skriptparameter und benutzerdefinierter Code zur Generierung der Zahlen für dieses Papier können heruntergeladen werden unter: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
Alle anderen Daten sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich.