In diesem Video erfahren Sie, wie Sie den Chromfreisetzungstest durchführen und das zytotoxische Potenzial der Effektorzellen bestimmen.
Immunzellen sind dafür verantwortlich, potenziell schädliche Zellen wie Krebs oder virusinfizierte Zellen zu identifizieren und aus dem Körper zu entfernen, was ein wesentlicher Bestandteil der Immunantwort ist. Mehrere Immunzellen, wie T-Zellen und NK-Zellen, besitzen eine Eigenschaft, die als zytotoxisches Potenzial bekannt ist, dh die Fähigkeit, Zielzellen zu identifizieren und Proteine abzusondern, die den Proteinabbau, die Lyse und den Tod dieser Zielzellen induzieren. Die Quantifizierung des zytotoxischen Potentials ist entscheidend für die Messung der Aktivierung und Wirksamkeit von Immunzellen, und der Chromfreisetzungstest wird üblicherweise für diesen Zweck verwendet.
Mit dieser Methode können Benutzer die Zytoxizität vergleichen, die durch bestimmte Arten von Immunzellen unter verschiedenen Bedingungen induziert wird. Zu Beginn werden die Zielzellen wie Krebszellen mit einem radioaktiven Isotop, Chrom 51, inkubiert, das von den Zellen aufgenommen wird. Als nächstes werden diese radioaktiv markierten Zellen mit den isolierten Immunzellen von Interesse, auch Effektorzellen genannt, in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden kokultiviert, um die Interaktion zwischen den beiden Zelltypen zu erleichtern.
Der Gesamtaufbau des Assays beinhaltet die Inkubation einer bestimmten Anzahl von Zielzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Immunzellen zusammen mit geeigneten Kontrollen. Die Co-Kultur ermöglicht es den Effektorzellen, Apoptose und Lyse in den Zielzellen zu induzieren, was zur Freisetzung des intrazellulären Chroms 51 in den Überstand führt. Dann wird zu einem voroptimierten Zeitpunkt der Überstand, der das freigesetzte Chrom enthält, aus allen Vertiefungen geerntet. Das Chrom 51, radioaktiv sein, spontan erfährt radioaktiven Zerfall Gammastrahlung zu emittieren. Die Gammastrahlungswerte in den Überständen aus allen Vertiefungen in der Assayplatte stellen einen quantifizierbaren Output der Lyse der Zielzellen dar. Dies wird mit einem Gamma-Zähler gemessen, mit dem dann das zytotoxische Potential der Immunzellen bestimmt wird.
Zunächst werden die Zielzellen, in diesem Beispiel die humane Melanomzelllinie WM793, zu einer Einzelzellsuspension präpariert. Nehmen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS. Dekantieren Sie das PBS und geben Sie dann etwa zwei Minuten lang einen Milliliter Trypsin auf die Platte. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, und geben Sie dann fünf Milliliter RPMI-Medium in den Kolben. Pipettieren Sie die Medien auf und ab, um die Zellen zu sammeln, und geben Sie diese Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 1200 U /min in die Zentrifuge. Entfernen Sie als nächstes die Medien aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Streichen Sie vorsichtig über den Boden des Röhrchens, um das Zellpellet aufzubrechen, und geben Sie 10 Milliliter Medien in das Röhrchen. Pipettieren Sie dann die Medien vorsichtig auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen. Bestimmen Sie anschließend die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und überführen Sie zwei Milliliter der ursprünglichen Zellsuspension in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 120 U / min. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren die überschüssigen Medien aus dem Röhrchen in einen Abfallbehälter. Wirbeln Sie das Röhrchen kurz vor, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums zu resuspendieren.
Bereiten Sie sich als Nächstes auf die Verwendung von Chrom 51 vor, indem Sie in einen Laborraum gehen, der für diese bestimmte Radioaktivität vorgesehen ist. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des Chroms 51 während aller Schritte sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung vorhanden sein, um anzuzeigen, wo Proben mit Chrom 51 aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pancake-Sonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um im Raum für mögliche Kontaminationen zu dienen.
Einmal für die ordnungsgemäße Verwendung von Radioaktivität eingerichtet, fügen Sie 100 mikrocuries Chrom 51 direkt an die Zielzellsuspension. Fügen Sie dann ein kleines Stück radioaktives Klebeband zum Röhrchen hinzu, um anzuzeigen, dass die Probe und das Röhrchen jetzt radioaktiv sind. Legen Sie das Röhrchen in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie es eine Stunde lang, wobei Sie das Röhrchen alle 15 bis 20 Minuten umdrehen.
Während die Zielzellen markiert werden, bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von Effektorzellen vor. In diesem Beispiel wurden menschliche periphere blutmononukleäre Zellen oder PDMCs aus Vollblut durch Standarddichtegradientenzentrifugation auf eine Konzentration von 5 mal 10 bis 6 isoliert. Übertragen Sie diese Effektorzellensuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir und geben Sie dann 200 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung der Reihe B in einer 96-Well-Rundbodenplatte. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter RPMI zu jeder Vertiefung in den Reihen C bis G der Platte hinzu.
Beginnen Sie nun, serielle Verdünnungen der PBMCs durchzuführen, um einen Bereich von Effektorzellenzahlen zu erhalten, indem Sie zuerst 100 Mikroliter der Zellen in den Vertiefungen in Zeile B entfernen und diese zu Zeile C hinzufügen. Sobald die Reihe G erreicht ist, bewegen Sie 100 Mikroliter aus den Vertiefungen, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern in jeder Vertiefung in dieser Reihe zu belassen. Als nächstes werden 100 Mikroliter Gewebekulturmedium in die Vertiefungen in Reihe A gegeben, um als Kontrolle für die spontane Freisetzung von Chrom 51 aus den Zielzellen zu dienen, da dieser Reihe keine Effektorzellen hinzugefügt werden sollten. Legen Sie dann eine Platte in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator, bis die Zielzellen zum Hinzufügen bereit sind.
Entfernen Sie nach der Inkubationszeit die Zielzellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit 5 Millilitern FBS, um überschüssiges Chrom 51 zu entfernen. Legen Sie dann das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie es 5 Minuten lang bei 1200 U / min. Entfernen Sie die radioaktive FBS-Wäsche in einen geeigneten Abfallbehälter und wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in frischen 5 Millilitern FBS resuspendieren. Legen Sie das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie die Zellen erneut 5 Minuten lang bei 1200 U / min. Entfernen Sie die zweite Wäsche und überprüfen Sie das Pellet mit einem Geigerzähler auf Radioaktivität. Schließlich resuspendiert man das Pellet in 10 Milliliter vollständigem Medium und gießt die Chrom 51 markierte Zielzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir. Fügen Sie dann 100 Mikroliter dieser markierten Zielzellen zu jeder Vertiefung der 96-Well-Effektorzellplatte hinzu. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter 1% NP-40 in Wasser zu den Vertiefungen in Reihe H hinzu, um alle Zielzellen in jeder Reihe zu lysieren. Diese Bohrlöcher werden als Kontrolle verwendet, um die Gesamtanzahl pro Minute oder cpm zu bestimmen.
Nachdem die Platte vorbereitet ist, befestigen Sie den Deckel, indem Sie auf jeder Seite der Platte ein kleines Stück Klebeband anbringen und ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel legen, um anzuzeigen, dass es Chrom 51 enthält. Legen Sie dann die Platte in eine Zentrifuge, die für die Behandlung radioaktiver Proben markiert ist. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Stellen Sie die Zentrifuge auf 1200 U / min und bringen Sie die Platte auf Drehzahl. Sobald Sie die Geschwindigkeit erreicht haben, stoppen Sie die Maschine. Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit einem kleinen Stück Blei Abschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. 16 Stunden inkubieren, damit die Zielzellen lysieren können.
Entfernen Sie am Ende der Inkubationszeit vorsichtig das Klebeband um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel. Legen Sie als Nächstes den Ernterahmen auf die Platte und vergewissern Sie sich, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstopfen vorhanden sind. Drücken Sie nun langsam und vorsichtig die Baumwollpfropfen in die Vertiefungen. Nach etwa zehn sekunden, lassen sie den druck auf die baumwolle stecker, und dann transfer die baumwolle stecker zu rohr streifen. Legen Sie jedes dieser Röhrchen in ein sekundäres FACS-Röhrchen. Laden Sie schließlich die FACS-Röhrchen auf einen Gamma-Zähler und führen Sie die Proben aus, um die Menge an Chrom 51 zu quantifizieren, die in jedem Zustand freigesetzt wird. Notieren Sie sorgfältig die Reihenfolge, in der die Röhrchen in die Theke geladen wurden.
Hier wurden den ersten 3 Spuren unstimulierte PBMCs und den Spuren 4 bis 6 CPG-stimulierte PMBCs hinzugefügt. In diesem Beispiel wurden die Zählungen pro Minute in die Zellen einer Tabelle auf die gleiche Weise eingegeben, wie die Proben in der Originalplatte ausgelegt wurden, und die Mittelwerte der Triplikate wurden berechnet. Für die erste Bedingung wurden beispielsweise die Zellen A1, A2 und A3 in Zelle I3 gemittelt. Sobald die Mittelwerte bestimmt sind, kann der Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Bedingung unter Verwendung dieser Formel berechnet werden. Um beispielsweise die prozentuale spezifische Lyse für die unstimulierten Zellen zu berechnen, die ein Verhältnis von 50 zu 1 Effektorzellen zu Zielzellen aufwiesen, wurde die spontane CPM, die in diesem Beispiel 1164,67 beträgt, von der experimentellen CPM 1129 subtrahiert. 67. Diese Zahl kann dann durch die Differenz zwischen der maximalen CPM und der spontanen CPM geteilt und dann mit 100 multipliziert werden, um die prozentuale spezifische Lyse zu erhalten. Dies wird dann für jede Bedingung berechnet. Diese Daten können dann grafisch dargestellt werden, um einen Vergleich des E-zu-T-Verhältnisses mit der prozentualen spezifischen Lyse sowohl für die nicht stimulierten PBMCs als auch für die CPG-stimulierten PBMCs zu zeigen. In diesem Beispiel töteten Effektorzellen, die mit CPG stimuliert wurden, Zielzellen effektiver ab, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde in den unstimulierten PBMCs nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CPG-Stimulation für den beobachteten Anstieg der Zielzelllyse notwendig ist.