Der Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Assay ist eine wichtige Methode zur Überwachung der Transkriptionsregulation mit umfassender Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen spezifischen Proteinen und einer genomischen DNA-Region. Angesichts der Tatsache, dass DNA-bindende Proteine (einschließlich Transkriptionsfaktoren und Histone) in lebenden Zellen mit der DNA, die sie binden, vernetzt werden können, wird ChIP verwendet, um den Protein-DNA–Komplex aus zellulären Lysaten durch einen geeigneten Antikörper immunpräzipitieren. Die immunpräzipitierten Komplexe werden durch Zentrifugation gesammelt und Proteine werden für weitere Analysen wie Western Blot und LC /MS eluiert. Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Verfahren, um einen erfolgreichen ChIP-Assay auf schnelle und effiziente Weise zu erreichen.
Reagenzien:
- 37% formaldehyd
- 1 M Glycin
- Zelllysepuffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, mit 1× Proteaseinhibitorcocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Fügen Sie 27 µL 37% Formaldehyd pro 1 ml Kulturmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 1% zu erhalten, inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur, während Sie langsam auf einem Schaukelgerät oder Schüttelgerät schütteln.
2. Quench-Vernetzung durch Zugabe von 141 µL 1 M Glycin pro 1 ml Kulturmedium, um eine Endkonzentration bei 125 mm zu erhalten, inkubieren die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Für schwimmende Zellen: Spannzangenzellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen füllen, 5 min bei 2.000 × g bei 4 ° C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS.
Weiter zu Schritt 5.
4. Für adhäsive Zellen: Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS. Kratzen Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen zu PBS ab und zentrifugieren Sie sie 5 min lang bei 2.000 × g bei 4 ° C.
Lyse und Beschallung
5. Überstand verwerfen, 1 ml Kaltzelllysepuffer pro 1 × 107 Zellen zugeben. Resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mehrmals auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
6. Beschallen Sie, um das Chromatin in 0.5~1 kb Fragment zu scheren. Vermeiden Sie Schaum und halten Sie die Probe auf Eis.
Anmerkungen:
- Die Beschallungsbedingungen sollten je nach Probe und Sonicatormodell optimiert werden. Typischerweise haben sich sechs 15-sec-Impulse gefolgt von 45-Sec-Ruhezeiten am Ausgang 6.0 als wirksam erwiesen. Zur Analyse der Fragmentgröße extrahieren Sie ein kleines Volumen der Gesamt-DNA aus einem Aliquot von geschorenem Chromatin und analysieren Sie dann auf einem Agarosegel (1 ~ 2%).
- Das Volumen sollte ≤ 1 ml betragen, um die Beschallungseffizienz aufrechtzuerhalten.
7. 10 min bei 12.000 × g bei 4°C zentrifugieren und den Überstand zurückhalten.
8. 0,5 ml Überstand in ein frisches Gefäß überführen.5 ml Röhrchen für die DNA-Fragmentanalyse.
Immunpräzipitation
9. Fügen Sie relevante Antikörper oder normales IgG der Probe hinzu und inkubieren Sie für 15 min in einem Ultraschallwasserbad bei Raumtemperatur.
Anmerkungen:
- Wählen Sie IgG aus derselben Spezies, in der die Antikörper produziert wurden.
- Die Inkubationszeit sollte je nach Antikörper und Antigen optimiert werden. Bei Antigenen mit geringer Expression konnte die Inkubation bei 4°C über Nacht auf einer rotierenden Plattform durchgeführt werden.
10. Bereiten Sie Protein A-Agarose-Perlen vor: die Kügelchen dreimal mit 1 ml Lysepuffer (ohne Proteaseinhibitor) waschen, bei 2000×g einige Sekunden bei 4°C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
11. Perlen 1:1 mit Lysepuffer verdünnen und 50 µL zur Probe geben.
12. Inkubieren bei 4 ° C für 30 ~ 45 min in einer rotierenden Plattform.
13. Bei 2000 × g 1 min bei 4°C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
14. Die Beads viermal mit 1 ml Lysepuffer (ohne Proteaseinhibitor) waschen, Überstand verwerfen.
DNA-Reinigung und -analyse
15. Die gewaschenen Beads werden mit 100 µL 10% Chelex 100 resuspendiert.
16. Pipettieren Sie einige Sekunden lang auf und ab und kochen Sie die Probe dann 10 Minuten lang.
17. Bei 12.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand in ein frisches 1,5 ml Röhrchen überführen.
18. Reinigen Sie DNA mit einem DNA-Reinigungskit oder mit dem Standard-Phenol: Chloroform-Extraktionsprotokoll.
19. Lösen DNA mit 50 µL ddH2O, und verwenden 2 ~ 10 µL der DNA probe (25% der reaktion volumen) in die PCR reaktionen
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