Pflanzen und der Erreger
Die gewöhnliche Eispflanze (Mesembryanthemum crystallinum L.) wurde in einem Gewächshaus gezüchtet, wie von den Forschern beschrieben Kuźniak et al. . Nach dem Erscheinen des 3. Blattpaares wurde ein Pflanzensatz mit 0,4 M NaCl bewässert, um den Crassulacean-Säurestoffwechsel zu induzieren (CAM-Pflanzen), während ein anderer mit Leitungswasser weiter bewässert wurde (C3-Pflanzen). Nach 12 Tagen wurde die Induktion von CAM in den NaCl- behandelten Pflanzen durch Messung des täglichen ∆ Malats im Blattzellsaft bestätigt. Danach wurden Blätter der 2. Blattpaare von C3- und CAM-Pflanzen mit Botrytis cinerea nach Kuźniak et al. .
Chlorophyll a fluorescence imaging
Die Mini-Version eines Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometers der M-Serie (Walz, Effeltrich, Deutschland) mit einem Blatthalter wurde zur Aufnahme von Fluoreszenzbildern verwendet (Imaging-PAM M-series Chlorophyll Fluorometer) . Das Fluorometer ist ein Blattclip-Modell für Feldanwendungen. Der Blatthalter stellt sicher, dass das Blatt horizontal zur Lichtquelle gehalten wird, um eine heterogene Beleuchtung über verschiedene Bereiche der Blattprobe zu vermeiden. Die Probenahmepositionen wurden so gewählt, dass sie entlang der Mittelrippe gleichmäßig beabstandet waren, Sie unterschieden sich jedoch für jedes Blatt aufgrund seiner Größe und Morphologie geringfügig, und die Technik, Blätter in den Halter zu legen. Um nur die Auswirkungen von biotischem Stress zu identifizieren und die Einführung von Artefakten im Chlorophyllfluoreszenzmessverfahren zu vermeiden, wurden keine Referenzmarken, die eine Blattbildreferenzierung ermöglichen, auf die Blätter aufgebracht. Die Chlorophyllfluoreszenz aus gewöhnlichen Eispflanzenblättern wurde durch Definieren des Interessengebiets (AOI-Tool) unter Verwendung der Imaging Win 2.41a-Software erhalten.
Mit dem Imaging-PAM wurde die aktuelle Fluoreszenzausbeute (Ft) kontinuierlich überwacht. Pflanzen wurden für 20 min dunkel angepasst. Bei Anlegen eines Sättigungsimpulses wurden die Dunkelfluoreszenzausbeute (Ft = F0) und die maximale Fluoreszenzausbeute (Fm) bestimmt. Die maximale PSII-Quantenausbeute, Fv/Fm, und die Quantenausbeuten der geregelten und nicht geregelten Energiedissipation in PSII, Y (NPQ) und Y (NO) wurden abgebildet. Fv / Fm wurde nach der Gleichung berechnet: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y(NPQ) wurde nach Kramer et al. durch die Formel: 1 – Y(II) – 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0 – 1)). Y(NO) wurde nach Kramer et al. durch die Gleichung: Y(NEIN) = 1 /. Das Verfahren der Bildgebung liefert Pseudofarbbilder (indexierter Farbmodus) von biologischem Material mit einer Auflösung von 640 × 480 Pixel entsprechend dem Sichtfeld der physikalischen Abmessungen 32 × 24 mm.
Die infizierten Blätter der C3- und CAM-Pflanzen wurden zum Zeitpunkt der Inokulation zur chl a-Fluoreszenzanalyse entnommen und 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 und 72 h nach Inokulation. Chl eine Fluoreszenz wurde für die Blätter des 2. Blattpaares von drei C3- und CAM-Pflanzen gemessen, die aus zwei unabhängigen Wiederholungen der Pflanzenkultivierung stammten. Jedes zur Analyse entnommene Blatt wurde zu allen Zeitpunkten separat gescreent (Abb. 1). Repräsentative Serien von neun Bildern (eines für jeden Zeitpunkt) von Y (NO), Y (NPQ) und Fv / Fm für C3- und CAM-Eispflanzen wurden verarbeitet, um Änderungen dieser Parameter in einem ausgewählten Bereich der Blattspreite im Laufe der Zeit zu messen. Zum Vergleich wurden Y(NO), Y(NPQ) und Fv/Fm gemittelte Daten aus den gesamten in Fig. 2 erhalten wurden. Die Ergebnisse der Bildausrichtung und der Messung der räumlich-zeitlichen Strukturierung der biotischen Stressausbreitung in Blättern mit dem vorgeschlagenen Verfahren wurden an Y (NO) -Bildern veranschaulicht.
Beispielbilder der Quantenausbeute der unregulierten Energiedissipation in gewöhnlichen Eispflanzenblättern. Gilt für PSII Y (NO) der Fluoreszenzparameter C3 (a–d) und CAM (e–h). Das Blattfragment enthält die Stelle der Pathogenimpfung und Symptome der Stressvermehrung
Beispielbild von C3 gemeinsamen Eispflanzenblatt mit ausgewählten Regionen von Interesse. Manuell getroffene Auswahlen im Firmware-Editor decken die infizierten (1), symptomlosen (2) sowie die Mittelrippenbereiche ab (3)
Bildausrichtung
Der Mechanismus der PAM-Bilddatenerfassung in zeitlicher Abfolge führt zu einer Bewegung des Blattfragments im Sichtfeld zwischen einzelnen Zeitpunkten (Abb. 1). Aufgrund der Änderung der Blattposition haben solche Eigenschaften wie die Mittelrippe und die Impfstellen sowohl unterschiedliche Lage als auch Orientierung. Darüber hinaus kann der Effekt der Neuskalierung beobachtet werden. Um die Spannungsausbreitung richtig beurteilen zu können, sollten die Ansichtsfelder gegenseitig synchronisiert werden, wobei angenommen wird, dass eines von ihnen als Referenzbild (fest) und der Rest der Bilder mit dem festen Bild ausgerichtet ist. Dieser Ansatz ist in der medizinischen Bildgebung als Bildregistrierung bekannt . Die grundlegende Registrierungsaufgabe für die Fluoreszenzbilder besteht darin, die Ähnlichkeitstransformation zu finden, die aus geeigneter Rotation, Translation und Skalierung besteht. Die Blattoberflächenbeugung und -faltung von Blättern durch Beanspruchung treten nur in lokalen Bereichen von Einzelbildern auf und sind für die globale Bildausrichtung von untergeordneter Bedeutung. Sie können in der Phase der Registernachbearbeitung durch nichtlineare Transformationen wie z. B. Dünnplatten-, Oberflächen-Splines und Demon-Mappings kompensiert werden.
Die Fluoreszenzbilder werden als Serie von Aufnahmen in vordefinierten Zeitintervallen von etwa derselben Blattregion aufgenommen. Die charakteristischen Elemente des Bildstapels stellen hauptsächlich Blattadern dar. Sie sind jedoch aufgrund des begrenzten Kontrasts und der begrenzten Farbqualität der PAM-Bildgebung schlecht vom Bildinhalt zu unterscheiden. Die Bereiche mit Stresssymptomen, die den Inhalt visuell dominieren, können sich zwischen Bildern in einer einzelnen Serie ändern. In einem solchen Fall würde die automatische Registrierung fehlschlagen.
Die gängigsten, automatischen Methoden des Standes der Technik basieren auf dem Vergleich der Bildintensität mit einigen Korrelationsmetriken (intensitätsbasierte Methoden) oder beruhen auf der Suche in den festen und bewegten Bildern nach der Übereinstimmung zwischen ausgewählten Bildmerkmalen wie Punkten, Linien und Konturen (merkmalsbasierte Methoden) . Keiner dieser Ansätze ermöglicht eine ordnungsgemäße Registrierung von PAM-Fluoreszenzbildern gewöhnlicher Eispflanzen, was in den Beispielen in den ergänzenden Materialien (Zusätzliche Datei 1) verifiziert und gezeigt wurde. Die dort vorgestellten Ergebnisse bestätigen, dass der Grund für erfolglose automatische Registrierungen die starke Verdunkelung von Bildbereichen mit erhaltenen Merkmalen durch dynamische Veränderungen des Bildinhalts durch Infektion des Blattgewebes ist. Tests der gängigen Methoden wurden sowohl vom Registrierungsschätzer in Matlab als auch in der Testumgebung durchgeführt .
Der Algorithmus der PAM-Bildregistrierung wurde in der Matlab-Umgebung basierend auf dem Satz von Kontrollpunkten entwickelt, die von einem Experten manuell ausgewählt wurden. Um die entsprechenden Kontrollpunkte in jedem Bild zu setzen, wurde die Funktion cpselect des Kontrollpunkt-Auswahlwerkzeugs aus der Image Processing Toolbox verwendet. Die Bilder wurden paarweise bearbeitet, darunter ein festes Bild und ein bewegtes Bild. Das erste Bild, das unmittelbar nach der Erregerinokulation aufgenommen wurde, wurde als festes (Referenz-) Bild angenommen. Durch interaktives Point-Mapping kann der Benutzer nicht nur die sichtbaren Umrisse von Nerven zeigen, sondern auch andere charakteristische Elemente wie den Injektionspunkt, Stellen entlang der Pathogenausbreitung sowie die auffälligsten epidermalen Blasenzellen (Abb. 3).
Vom Experten ausgewählte Kontrollpunkte. Beispiel Y (KEINE) Bilder eines Blattfragments einer Kameleispflanze: ein festes (Referenz-) Bild, b bewegtes Bild, das mit dem festen ausgerichtet werden soll
Mehrere Paare von Kontrollpunktpositionen, die so weit wie möglich über die Blattbildfläche verteilt sind, reichen aus, um die Bilder desselben Blattes, das grob als starrer Körper betrachtet wird, richtig auszurichten. Eine breitere Verteilung von Kontrollpunkten verbessert die Empfindlichkeit der Bildanpassung, ist jedoch durch das nach der Ausrichtungstransformation zugeschnittene Bildansichtsfeld und durch die Möglichkeit einer genauen Position des ausgewählten Punktes auf der Blattspreite begrenzt. Bei einer solchen Bildausrichtung wurde die affine Transformation mit der in der Image Processing Toolbox enthaltenen Funktion fitgeotrans durchgeführt. Diese Transformation wurde auf die Ähnlichkeitsversion (bestehend nur aus Translation, Rotation und Ähnlichkeit) beschränkt, da die Szene im PAM-Fluorometer nicht gekippt erschien. Bewegte Bilder wurden mit der Funktion imwarp an das feste Bild angepasst. Eine grafische Darstellung des Registrierungsalgorithmus ist in Fig. 4.
Das Blockdiagramm der affinen und optionalen B-Spline-Registrierung wurde auf Fluoreszenz-PAM-Bilder angewendet. \(\left\)- der Vektor der Kontrollpunkte im festen Bild, \(\left^{\left( k \right)}\)— der Vektor der Kontrollpunkte im k-ten bewegten Bild, \(\left^{{\left( {k^{\prime } } \right)}}\) – der Vektor der Kontrollpunkte im k-ten bewegten Bild nach der B-Spline-Registrierung
Blätter in verschiedenen Stadien der Infektion können eine Oberfläche haben, die lokal gewellt oder faltig ist, wie in der Region, die in analysierten PAM-Fluorometer-Bildern markiert ist (Abb. 5a, b), welche Form potentiell die richtige Analyse des Pathogenvermehrungsphänomens beeinflussen kann. Dies bedeutet, dass die affine Registrierungsmethode, die auf geometrischer Transformation basiert, möglicherweise nicht ausreicht, um Fluoreszenz-PAM-Bilder in einigen Fällen von Blättern mit scheinbar sichtbarer nichtlinearer Verformung abzugleichen. Daher schlagen die Autoren eine zweistufige Registrierungsmethode vor, bei der auf die affine starre Registrierung eine B-Spline-Registrierung folgt, die nichtlineare Verformungen reduziert.
Beispiel für affine und B-Spline-Registrierungen für C3 common Ice Plant leaf image. a Das Y (NO) -Bild nach der PAM-Erfassung, b das Bild nach der starren affinen Transformation mit den Pfeilen, die interaktiv eingestellte Verschiebungsvektoren darstellen, die in der zweiten Stufe der Registrierung verwendet werden, und c die endgültige Form nach der kontrollpunktbasierten B-Spline-Registrierung
Die Auswahl des nicht starren Registrierungstyps nutzt die Tatsache aus, dass gewöhnliche Eispflanzenblätter ein wenig flexibles Material darstellen und kleine Biegekräfte reibungslose Änderungen in einem Blattoberflächenprofil aufrechterhalten. Die Besonderheit dieser Registrierungsmodifikation besteht darin, dass die Vektoren des Bilddeformationsfeldes interaktiv auferlegt werden müssen. Zu diesem Zweck wurde dem Algorithmus ein dedizierter Vektorfeldeditor beigefügt. Es müssen nur wenige Verschiebungsvektoren im bewegten Bild angegeben werden, um lokale und glatte Verformungen einer Blattoberfläche wie in Fig. 5b.
Für die zweite Stufe der Registrierung wurde der B-Spline-Rückert-Algorithmus ausgewählt. Die Implementierung ist in Matlab Central File Exchange als Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox verfügbar.
Das B-Spline-Registrierungsverfahren besteht aus zwei grundlegenden Schritten:
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Initialisierung eines Gitters G von gleichmäßig über die Bildoberfläche verteilten Bildpunkten, wobei alle Verformungsfeldvektoren auf Null gesetzt sind, und anschließende Berechnung eines dichten Vektorfeldes T von Verformungen im Gitter G durch kubische B-Spline-Interpolation von manuell eingestellten Steuerpunktverschiebungsvektoren \(\left^{\left(k\right)}\). Sowohl das Gitter als auch das zugehörige Transformationsfeld T werden dann iterativ in 4 Schritten verfeinert, um den Gitterknotenabstand zu reduzieren. Die Transformation T wird durch die Funktion point_registration aus der Spline Registration Toolbox vorbereitet.
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B-Spline-Transformation aller Pixelpositionen und bikubische Interpolationen von Farbkomponenten im bewegten (affin registrierten) Bild \(I_{M}\) entsprechend dem Spline geglätteten Verformungsfeld.
Bildregistrierungsgenauigkeit
Die Genauigkeit der vorgeschlagenen Bildausrichtung wurde durch das Root Mean Square (RMS) bei Abweichungen von N = 15 Kontrollpunkten durchgeführt, die in Fig. 3. Die in einem bewegten Bild für den Fall mit und ohne Ausrichtung ausgewerteten Verschiebungen jedes festen Bildkontrollpunktes \(P_{i}\) wurden in Fig. 6 als die Vektoren \(R_{i} P_{i} = \Delta r_{i}\) bzw. \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\) dargestellt. Die RMS-Verschiebungsfehler aller Kontrollpunkte in einem einzigen Bild für die beiden Fälle werden in Gl. (1) als \(\Delta r_{\text{rms}}\) und \(\Delta q_{\text{rms}}\).
Darstellung der Fehlerbewertung bei der affinen Registrierung von PAM-Bildern. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—Kontrollpunkt im festen Bild \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—Abbildung des Kontrollpunkts \(P_{i}\) im bewegten Bild \(I_{M}\), \(R_{i}\)—Abbildung des Kontrollpunkts \(P_{\text{i}}\) nach Registrierung, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—Verschiebungsfehler des Kontrollpunkts \(P_{ \(P_{\text{i}}\) nach der Registrierung
Der prozentuale Anteil der Restverdrängung \(\delta_{rms}\) nach affiner Typregistrierung kann pro Bild nach Gl. (2).
Die ausgewerteten affinen Registrierungsfehler sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die ursprünglichen Verschiebungen \(\Delta q_{\text{rms}}\) von 3,01 bis 7,09 mm werden nach der ‚Ähnlichkeitsregistrierung‘ auf den Bereich von 0,45 bis 1,71 mm \(\Delta r_{\text{rms}}\) für die getestete C3-Anlage reduziert. Die gleichen Parameter für die Anlage sind \(1.90 \div 5.69\;{\text{mm}}\) für \(\Delta q_{\text{rms}}\) und \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) für \(\Delta r_{\text{rms}}\). Wenn \(\delta_{rms}\) sowohl für C3- als auch für CAM-Bildserien gemittelt wird, entspricht dies etwa 21% bzw. 23%. Die Werte der Fluoreszenzparameter Y (NO), Fv / Fm und NPQ, die aus Eispflanzenblattbildern ohne Registrierung erhalten wurden, werden aus inkompatiblen Teilen des Blattes abgerufen und können nicht berücksichtigt werden (siehe zusätzliche Datei 2).
Für die zusätzliche B-Spline-Registrierung wird der Transformationsfehler durch zwei Komponenten definiert. Die erste davon ist die Nachregistrierungsverschiebung \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\), die in Fig. 7a, wobei \(R_{i}\) in Gl. (3) als Schwerpunkt \(\bar{p}\) der Region \(A_{i}\).
wobei \(I_{R} \ left( p \right) \in \left\) die Intensität des registrierten Kontrollpunktbildes am Pixel p bezeichnet, \(\left | {A_{i} } \right |\) — der Bereich des Unschärfebereichs. Die zweite Fehlerkomponente ist definiert durch den Standardabweichungsradius \(\rho_{i}\) der Intensitätsspreizung um jeden Kontrollpunkt \(R_{i}\), wie in Gl. (4).
wobei \(\left\/ \cdot \right\/\) die euklidische Norm des Vektors zwischen den Punkten p und \(\bar{p}\) in der Bildebene bezeichnet. Die Unschärfe des ausgerichteten Kontrollpunkts \(R_{i}\) tritt aufgrund der Tatsache auf, dass die nichtlineare Registrierung eine bikubische Interpolation im endlichen Auflösungsgitter G verwendet. Tabelle 2 enthält die Größen \(\Delta q_{i}\) von N = 9 beispielhaften Verschiebungsfeldvektoren gemäß Fig. 5b. Die Größen \(\Delta r_{i}\) der Vektorabbildungsfehler nach der Spline-Registrierung werden zwischen den gewünschten festen Kontrollpunkten\(P_{i}\) gemessen und die Schwerpunkte der registrierten Punkte\(R_{i}\) im Bereich \(A_{i}\) ausgewertet. Alle getesteten \(\Delta r_{i}\)-Werte liegen unterhalb der Pixelauflösung von \(50\;\upmu{\text{m}}\) und können auf 0 vorgerundet werden. Dies bedeutet eine präzise Positionierung der Kontrollpunkte durch die Spline-Transformation. Die Standardabweichung \(\rho_{i}\) der in Tabelle 2 gezeigten Unschärferegion nach Verdoppelung kann ein Maß für die Kontrollpunktunschärfe sein. Dann variiert es ungefähr von \(24\;{\text{to}}\;63 \;\upmu {\text{m}}\) Was ist das Äquivalent von Ein-Pixel-Unschärfe. Somit ermöglicht diese Transformation, die richtige Form von Y (NO) -Änderungen in einem Fluoreszenzbild lokal wiederherzustellen.
Erläuterung des Fehlers bei der B-Spline-Bildregistrierung von PAM-Bildern. a Die Nichtübereinstimmung der Kontrollpunktpositionszuordnung während der Registrierung, b Bildintensitätsverteilung des registrierten Spline-Kontrollpunkts, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—Kontrollpunkt im festen Bild \(I_{F}\), \(Q_{i}\)— das Äquivalent des Kontrollpunkts \(P_{i}\) im bewegten Bild \(I_{M}\), \(R_{i}\)—Abbildung des Kontrollpunkts \(P_{i}\) nach der Registrierung, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—Verschiebungsfehlermaß für die Abbildung des Kontrollpunkts \(I_{ P_{i}\), \(A_{i}\)—unscharfer Bereich um \(R_{i}\) entsprechend dem Kontrollpunkt \(P_{i}\), \(\a_{i}\)—der Standardabweichungsradius von \(R_{i}\) Unschärfe
Die Messung der Spannungsausbreitung
Die Datenanalyse wendet ein spezielles Editor-Tool an, um einen Stapel von PAM-Bildern nach ihrer Registrierung zu manipulieren. Die Haupteditor-Funktion erlaubt das Zeichnen von zwei gleich langen Messlinienabschnitten \(L_{1} \;{\text{and}}\;L_{2}\) (Abb. 8), die auf jedem Bild aus dem Stapel beobachtet und verfügbar sein kann. In dem betrachteten Experiment beginnt die erste Zeile \(L_{1}\) an der Stelle der Inokulation \(s_{1}\), wo der Spannungsfaktor zum Zeitpunkt t auf das Blattgewebe angewendet wird, und sollte ungefähr in Richtung der Spannungsausdehnung eingestellt werden. Die zweite Linie \(L_{2}\) wird entlang der Mittelrippe platziert, wo der beobachtete Spannungseinfluss zeitlich immer begrenzt war und Fluoreszenzparameter minimale Änderungen aufweisen. Die Linien sollten vollständig in den Kontext des Bildes passen.
Messbereiche in Y (NO) -Bildern von gewöhnlichen Eispflanzenblättern nach der Computerausrichtung. Die Messpunkte zeigen an: (1) Mesophyll an der Impfstelle, (2) Mesophyll ohne Verletzung, (3) Mittelrippe in der Nähe der Impfstelle. Die Messlinie (L1) ist in Richtung der Spannungsausbreitung innerhalb des Mesophylls ausgerichtet und die Linie (L2) befindet sich entlang der Mittelrippe. Linien begannen an den Punkten (S1) bzw. (S2)
Eine zusätzliche Option der punktweisen Messung ist möglich, wenn drei kleine verschiedene kreisförmige Bereiche des Radius von 10 Pixeln interaktiv im Sichtfeld platziert werden (Abb. 8). Sie sollten zu den Blattregionen mit unterschiedlichen Fluoreszenzparametern gehören, die im Laufe der Zeit prasseln. Alle registrierten Pixelwerte werden innerhalb dieser Regionen gemittelt.