Mikroskopie ist standardmäßig eine Technik, die es uns ermöglicht, biologische Ereignisse zu beobachten, anstatt sie zu messen und Schlussfolgerungen auf der Grundlage dessen zu ziehen, was wir sehen, und nicht auf der Grundlage einiger Berechnungen. Das Thema dieses Artikels mag daher etwas überraschend erscheinen, da es sich um die Messungen der Kolokalisierung handelt. Während es Situationen gibt, in denen Sie die Proteinkolokalisierung visuell bestimmen können, ist häufig eine genauere Bestätigung einer gegenseitigen Verteilung zweier Sonden erforderlich.
Warum ist eine visuelle Bestimmung der Kolokalisation unzureichend?
Nur wenn Sie Bilder nach einem kontrollierten Protokoll für die Kolokalisierungsanalyse gesammelt haben (ausreichendes Signal in jedem Kanal, keine Autofluoreszenz oder Signaldurchblutung), können Sie mit Sicherheit sagen, dass die beiden Sonden ausschließlich auf der Grundlage von Beobachtungen kolokalisieren. Wenn in diesem Fall das grüne Signal mit dem roten Signal kolokalisiert und das Bild größtenteils gelb ist, ist keine statistische Messung erforderlich. Aber wenn Sie keine Überlappung sehen, bedeutet das nicht, dass es nicht da ist! Es kann sein, dass die Intensitäten der beiden Kanäle nicht gleich sind. Die Zwischenfarbe, die wir sehen, kann nämlich nur erscheinen, wenn beide Sonden die gleiche Intensität haben. Daher können Schlussfolgerungen, die auf visueller Bestimmung basieren, häufig zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Welche Methoden zur Überlappungsmessung gibt es?
Obwohl es in dieser Angelegenheit keinen Standardansatz gibt, gibt es zwei Methoden, die weit verbreitet und allgemein akzeptiert sind. Diese beinhalten entweder den Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCC) oder den Mander-Kolokalisierungskoeffizienten (MCC).
Diese beiden Methoden beziehen sich auf zwei verschiedene Aspekte der Kolokalisierung – Korrelation und Ko-Vorkommen. Der Pearson-Koeffizient hängt mit der Korrelation der Pixelintensitäten in den beiden Kanälen zusammen. Es misst die Beziehung zwischen Signalen – ob die Signalwerte in einem Kanal gleichzeitig mit dem anderen steigen oder ein Signal fällt, wenn das andere steigt. Korrelation unterscheidet sich vom Ko-Vorkommen, das mathematisch durch Manders Koeffizienten ausgedrückt wird. Dies stellt die Abdeckung eines Signals über das andere dar, was zeigt, inwieweit zwei Sonden denselben Platz einnehmen. Lassen Sie uns dies etwas weiter untersuchen.
Pearson’s Correlation Coefficient (PCC)
Definition: PCC spiegelt die lineare Beziehung zwischen Signalintensitäten wider. Die Werte können zwischen 1 (perfekte positive Korrelation) und -1 (perfekte negative Korrelation) liegen, während 0 bedeutet, dass keine Korrelation vorliegt. Es ist möglich, PCC visuell durch ein Streuprogramm zu untersuchen, wobei die Koordinaten auf dem Diagramm Pixelwerte (Signal) in beiden Kanälen darstellen. Je mehr Punkte sich um eine gerade Linie gruppieren, desto besser ist die Korrelation zwischen den beiden Signalen
Anforderungen: Der PCC sollte in der Region von Interesse (ROI) gemessen werden, um falsch positive oder negative Ergebnisse zu vermeiden. Wenn PCC über das gesamte Bild gemessen wird, korrelieren Pixel des Hintergrunds perfekt und blasen den PCC auf. Wenn die Messung dagegen in einer Region ohne Interesse durchgeführt wird, in der eine heterogene Verteilung beider Kanäle vorliegt, wird der PCC gedrückt.
Sie können den ROI manuell oder durch Schwellenwerte auswählen, um den Hintergrund auszuschließen. Wie auch immer Sie es tun, seien Sie vorsichtig, besonders beim Schwellenwert. Die Auswahl des ROI muss alle relevanten Regionen der Zelle (n) umfassen, d. H. Jeden Ort, an dem erwartet werden kann, dass sich eine Sonde verteilt. Wenn Sie eine intensitätsbasierte Methode zur Auswahl des ROI (Schwellenwert) verwenden, schließen Sie möglicherweise versehentlich relevante Ergebnisse aus. Wie kann das passieren? Sie könnten eine Region des gegenseitigen Ausschlusses haben, in der keine Markierung erscheint, und dies kann ein biologisch relevantes Ergebnis sein (beide Moleküle werden nicht an dieser Stelle in der Zelle exprimiert). Schwellenwerte beziehen diese Region jedoch nicht in den ROI ein, sodass Sie Gefahr laufen, relevante Ergebnisse zu verlieren.
Empfohlen für: PCC sollte auf Bildern verwendet werden, bei denen eine lineare Beziehung zwischen den Intensitäten besteht. Wenn die Daten zu einem komplexeren Modell passen, funktioniert PCC nicht gut. Eine andere Methode sollte auch gewählt werden, wenn eine ungleichmäßige Überlappung vorliegt, bei der sich die Sonden jedoch in unterschiedlichen Anteilen verteilen. Dies kann auftreten, wenn GFP als eine Sonde verwendet wird. Sein Expressionsniveau kann sich zwischen den Zellen unterscheiden und aufgrund der hohen interzellulären Variabilität möglicherweise eine Depression des PCC verursachen.
Manders Kolokalisierungskoeffizienten
Definition: MCC ist eine Metrik, die das gleichzeitige Auftreten beschreibt – den Anteil eines Proteins, der mit dem anderen kolokalisiert. MCC gibt Ihnen ein gutes Maß an Kolokalisierung, wenn Sie ein Protein in einem Vesikel markieren und sehen möchten, wie es sich mit einer bestimmten Struktur in einer Zelle, beispielsweise einem Mikrotubulus, kolokalisiert. Wenn wir davon ausgehen, dass alle Vesikel mit Mikrotubuli kolokalisieren, aber nur ein Teil der Mikrotubuli mit dem Vesikel kolokalisiert, können Sie MCC für jeden Kanal berechnen und eine Metrik erhalten, die diese fraktionierte Überlappung quantitativ beschreibt.
Anforderungen: Der Haken bei MCC ist, dass der Hintergrund entfernt werden muss. Der schwierigste Teil hier ist das Festlegen eines Grenzwerts für die Intensität, der die Hintergrundsubtraktion ermöglicht. MCC misst die vollständige Fluoreszenz einer Sonde in jedem Pixel über Null. Pixel über Null sind jedoch aufgrund von Faktoren wie: autofluoreszenz, Lichtleckage, unspezifische Markierung oder Fluoreszenz von unscharfen Bildquellen. Die Messung von MCC erfordert daher eine sorgfältige Auswahl der Schwelle (Cutoff).
Der erste Weg, dies zu tun, ist Global Thresholding, bei dem Sie von jedem Pixel einen Schwellenwert subtrahieren, so dass jede Ebene unter dem ausgewählten Grenzwert Hintergrund ist und jedes Pixel darüber in eine Region von Interesse fällt. Dies ist zwar sehr intuitiv, aber die globale Schwelleneinstellung ist eher grob und kann zu unerwünschten Situationen führen, z. B. zum Ausschluss der Pixel mit niedrigem Wert, die sich nahe am Hintergrund befinden, aber tatsächlich positiv sind.
Eine automatischere und weniger subjektive Option ist die Costes-Methode, bei der der Schwellenwert durch mehrfache Berechnung des PCC geschätzt wird. Dies dient dazu, den Bereich von Pixelwerten zu definieren, die positiv sind und daher nicht ausgeschlossen werden sollten. PCC wird für verschiedene Gruppen von Pixeln berechnet, und die Pixelwerte, für die PCC gleich oder nahe Null ist, werden als Schwellenwerte verwendet. Dennoch sollte es auch visuell überprüft werden, da es in Bildern mit geringerem Signal-Rausch-Verhältnis einen sehr niedrigen Schwellwertpegel identifizieren kann, so dass es markierte Strukturen nicht vom Hintergrund unterscheidet.
Empfohlen für: Wenn die biologische Frage Ihres Experiments das Ausmaß betrifft, in dem sich Protein / Strukturen überlappen, sollte MCC das Maß der Wahl sein. Diese Koeffizienten werden intuitiver interpretiert als PCC und sind unabhängig von der Signalproportionalität (den Unterschieden in der Anzahl der von jeder Sonde markierten Strukturen).
Bevor Sie mit der Analyse beginnen
Unabhängig davon, für welche Wahl Sie sich zur Messung der Kolokalisierung entscheiden, ist es sehr wichtig, dass die Bilderfassung korrekt durchgeführt wird. Versuchen Sie, so viele Faktoren wie möglich zu kontrollieren, und bereiten Sie eine Reihe von Kontrollproben vor, mit denen Sie so viele Variablen wie möglich überwachen können.
Denken Sie daran, dass die Bestimmung der visuellen Kolokalisierung von vielen Faktoren beeinflusst wird, einschließlich der Subjektivität des Beobachters, der Tatsache, dass das Gehirn jedes einzelnen Farben unterschiedlich sehen kann, einer möglichen Farbenblindheit des Beobachters und der räumlichen Auflösung, die die Pixelgröße bestimmt, unter anderem. Achten Sie darauf, die Bilder, die Sie analysieren möchten, einheitlich zu verarbeiten, und bedenken Sie, dass jede unkontrollierte Manipulation dazu führen kann, dass Sie relevante Informationen verlieren.
Und Last but Not Least
Diese Berechnungen sind in den meisten Bildanalyse-Softwarepaketen implementiert, z. B. ImageJ und Volocity. Aber da die Messung der Kolokalisierung immer noch ein etwas verwirrendes Feld ist, sind Verbesserungen erforderlich, also behalten Sie die neuen Versionen und Pakete für die Software im Auge.
Wie messen Sie die Kolokalisierung? Lassen Sie es uns wissen, indem Sie in den Kommentaren schreiben!
Literatur:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Ein praktischer Leitfaden zur Bewertung der Kolokalisierung in der biologischen Mikroskopie. American Journal of Physiology – Zellphysiologie (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokalisierungsanalyse in der Fluoreszenzmikroskopie. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (Hrsg.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, S. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistische Tests zur Messung der Kolokalisierung in der biologischen Mikroskopie. Zeitschrift für Mikroskopie. 2013; 252(3): 295-302
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