Ergebnisse und Diskussion
Am Tag der Inokulation lag der pH-Wert von sterilem ungepuffertem Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) bei 5,63, während der pH-Wert von steril gepuffertem PDA zwischen 3,51 und 9,35 lag. Nach vierwöchiger Inkubation bei Raumtemperatur (25 °C) sank der pH-Wert des sterilen Agars für das ungepufferte, Tris-gepufferte und Tris-Maleat-gepufferte PDA (bis zu 0,19) und stieg (bis zu 0,24) für das Citrat-Phosphat-gepufferte und Carbonat-Bicarbonat-gepufferte PDA (Tabelle 1).
Tabelle 1.
pH-Messungen von sterilem Kartoffel-Dextrose-Agar.
| Medium | Vorhergesagter pH-Wert des Puffers | Tatsächlicher pH-Wert | |
|---|---|---|---|
| Steriler Agar | |||
| Tag 0 | Tag 28 | ||
| Ungepufferter PDA | n/a | 5.63 | 5.47 |
| Tris gepufferter PDA | 7.20 | 6.61 | 6.50 |
| 8.00 | 7.61 | 7.59 | |
| 9.00 | 8.24 | 8.19 | |
| Citrat-Phosphat gepufferter PDA | 3.00 | 3.51 | 3.69 |
| 4.00 | 4.28 | 4.49 | |
| 5.00 | 5.17 | 5.40 | |
| 6.00 | 6.07 | 6.31 | |
| 7.00 | 7.01 | 7.23 | |
| Carbonat-Bicarbonat gepufferter PDA | 9.20 | 9.07 | 9.13 |
| 10.00 | 9.25 | 9.26 | |
| 10.70 | 9.35 | 9.39 | |
| Trismaleat gepufferter PDA | 5.20 | 5.21 | 5.02 |
| 6.00 | 5.84 | 5.75 | |
| 7.00 | 6.53 | 6.45 | |
| 8.00 | 7.37 | 7.30 | |
| 8.60 | 7.91 | 7.83 | |
es wird ein Durchschnitt von drei Stichproben angezeigt.
Die Kolonien auf ungepuffertem PDA (pH 5,63) erreichten nach vier Wochen einen Durchmesser von 60 mm. Wenn der pH-Wert des PDA mit dem Tris-Puffer erhöht wurde (pH 6,61, 7,61 und 8,24), waren die durchschnittlichen Koloniegrößen höher als bei ungepuffertem PDA (Abbildungen 1 und and2A).2A). Perithecia waren vier Wochen lang auf ungepuffertem PDA und allen Tris-gepufferten Medien vorhanden. Ascosporen wurden nach vier Wochen an ungepuffertem PDA und Tris-gepuffertem PDA bei pH 6,61 und 7,61 beobachtet, jedoch nicht bei pH 8,24. Bei Tris-gepuffertem PDA bei pH 8,24 wurden bis zu acht Wochen nach Inokulation keine Ascosporen beobachtet (Tabelle 2).
Vergleich der Kolonie Durchmesser von C. globosum auf gepuffertem und ungepuffertem Kartoffel-Dextrose-Agar. Der tatsächliche pH-Wert jedes Mediums am Tag der Impfung ist auf der x-Achse angegeben. Kolonie Durchmesser wurden jede Woche gemessen. Der maximale Durchmesser jeder Platte betrug 83 mm. Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts sind angegeben (n = 15 Platten).
Fotografien von C. globosum-Kolonien nach 4 Wochen auf Tris-gepuffertem und ungepuffertem Kartoffel-Dextrose-Agar (a), auf Citrat-Phosphat-gepuffertem Kartoffel-Dextrose-Agar (b) und auf Tris-Maleat-gepuffertem Kartoffel-Dextrose-Agar (c). Die Mitte jeder Agarplatte wurde mit 500 C. globosum Sporen in 20 µL Wasser suspendiert beimpft. Diese Fotografien zeigen die Vorder- und Rückseite von Agarplatten mit C. globosum-Kolonien nach vierwöchiger Inkubation bei Raumtemperatur.
Tabelle 2
Wirkung des pH-Wertes auf die Sporulation.
| Medium | Vorhergesagter pH-Wert des Puffers | Ergebnisse des Banddias | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Vorhandensein von perithecia | Vorhandensein von Ascosporen | ||||||
| Woche 4 | Woche 6 | Woche 8 | Woche 4 | Woche 6 | Woche 8 | ||
| Ungepufferter PDA | n/a | + | + | + | + | + | + |
| Tris gepuffert PDA | 7.2 | + | + | + | + | + | + |
| 8.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 9.0 | + | + | + | − | − | − | |
| Citrate-phosphate buffered PDA | 3.0 | − | NT | NT | − | NT | NT |
| 4.0 | − | + | + | − | − | + | |
| 5.0 | − | + | + | − | − | + | |
| 6.0 | − | − | + | − | − | − | |
| 7.0 | − | + | + | − | − | + | |
| Carbonat-Bicarbonat gepufferter PDA | 9.2 | − | − | − | − | − | − |
| 10.0 | − | − | − | − | − | − | |
| 10.7 | − | − | − | − | − | − | |
| Trismaleat gepufferter PDA | 5.2 | − | − | − | + | + | + |
| 6.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 7.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 8.0 | + | + | + | − | + | + | |
| 8.6 | + | + | + | + | + | + | |
von einer einzelnen Agarplatte wurden vier, sechs oder acht Wochen nach der Inokulation Bandträger entnommen. Das Vorhandensein oder Fehlen von Perithezien und Ascosporen wird mit einem „+“ bzw. Nicht entnommene Proben sind mit „NT“ gekennzeichnet.
Ein Citratphosphatpuffer wurde verwendet, um PDA im pH-Bereich von 3,51 bis 7,01 zu erhalten (Tabelle 1). Die bei einem pH-Wert von 7,01 kultivierten Kolonien bedeckten vier Wochen nach der Inokulation die gesamte Platte (83 mm Durchmesser) (Abbildung 2B). Da der pH-Wert auf jedem Medium abnahm, nahmen die Koloniegrößen ab. Nach vier Wochen wuchsen die Kolonien bei einem pH-Wert von 3.51 erreichten nur einen Durchmesser von durchschnittlich 11 mm (Abbildung 1) und es wurden keine Hyphenfilamente auf den Bandträgern beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bei einem pH-Wert von 4,28, 5,17, 6,07 und 7,01 wurden vier Wochen nach der Inokulation keine Perithezien gebildet, sondern bildeten sich schließlich acht Wochen nach der Inokulation. Nach acht Wochen lagen Ascosporen bei einem pH-Wert von 4,28, 5,17 und 7,01 vor (Tabelle 2).
Der Carbonat-Bicarbonat-Puffer erhöhte den pH-Wert von PDA höher als der Tris-Puffer (pH 9,07, 9,25 und 9,35) (Tabelle 1). Die durchschnittliche Koloniegröße auf jedem Carbonat-Bicarbonat-gepufferten Medium war im Vergleich zum Citrat-Phosphat-gepufferten PDA bei einem pH-Wert von 7,01 niedriger (Abbildung 1). 4, 6 oder 8 Wochen nach der Inokulation wurden keine Perithezien oder Ascosporen beobachtet (Tabelle 2).
Trismaleatpuffer ergab PDA im pH-Bereich von 5,21 bis 7,91 (Tabelle 1). Nach zwei Wochen wurden die größten Kolonien bei dem niedrigsten pH-Wert beobachtet. Nach drei und vier Wochen befanden sich die Kolonien mit dem größten Durchmesser auf PDA mit einem pH-Wert von 7,37 und 7,91 (Abbildungen 1 und 2C).2C). Nach vier Wochen wurden zahlreiche Ascosporen bei einem pH-Wert von 5 beobachtet.21 und 5.84, während auf dem anderen Trismaleat-gepufferten PDA nur wenige oder keine Ascosporen beobachtet wurden (Daten nicht gezeigt). Innerhalb von sechs Wochen wurden auf jedem Medium Ascosporen hergestellt (Tabelle 2).
Insgesamt wurden die größten Kolonien bei einem neutralen pH-Wert (7,01) erhalten (Abbildung 1). Nach zwei Wochen waren diese Kolonien im Vergleich zu jedem anderen Medium signifikant größer. Nach vier Wochen war die durchschnittliche Koloniegröße für jedes Medium signifikant kleiner, außer bei einem pH-Wert von 6,07, 7,37, 7,61 und 7,91 im Vergleich zu einem pH-Wert von 7,01 (Daten nicht gezeigt). Die Gesamtzahl der Sporen für jede Gruppe wurde wie zuvor beschrieben bestimmt . Nachweisbare Konzentrationen von Ascosporen wurden vier Wochen nach der Inokulation auf den folgenden drei von siebzehn Medien beobachtet: 4.240.000 Sporen pro Gruppe (d. h. Fünf Agarplatten) auf ungepuffertem PDA (pH 5,63); 13.500.000 und 2.960.000 Sporen pro Gruppe auf trismaleatgepuffertem PDA, pH 5,21 bzw. 6,53. Bandträger zeigten die Produktion von Ascosporen auf vier anderen gepufferten Medien (Tris-gepuffertes PDA bei pH 6,61 und 7,61; Tris-Maleat-gepuffertes PDA bei pH 8,84 und 7.91) (Tabelle 2), die unterhalb der Nachweisgrenze des Hämazytometers (10.000 Sporen/ml) lag. Die Produktion der Chaetoglobosine A und C wurde wie zuvor beschrieben mittels HPLC ausgewertet. Chaetoglobosin C wurde bei einem pH-Wert von 7,01 (durchschnittlich 203 µg pro fünf Agarplatten) nachgewiesen, jedoch nicht aus Medien bei einem anderen pH-Wert (Abbildung 3). In keiner der Proben wurde Chaetoglobosin A nachgewiesen (Daten nicht dargestellt).
HPLC-Chromatogramm mit UV-Spektren ausgewählter Peaks eingefügt. Das Chromatogramm zeigt das aus dem Methanolextrakt von C erhaltene Signal. globosum wurde vier Wochen lang auf fünf citratphosphatgepufferten Kartoffel-Dextrose-Agarplatten bei einem pH-Wert von 7,01 gezüchtet. Auf der x-Achse sind die Retentionszeiten (min) und auf der y-Achse die Peakgrößen (in Milli-Absorptionseinheiten) aufgetragen. Für das UV-Spektrum (Inset) werden Wellenlängen (in Nanometern) auf der x-Achse und Peakgrößen (in Milli-Absorptionseinheiten) auf der y-Achse aufgetragen.
Nur wenige Studien haben den Einfluss des pH-Werts der Umgebung auf das Wachstum von C. globosum untersucht. Der optimale pH-Bereich für das Wachstum von C. globosum wurde zuvor als 7,1 bis 10,4 beschrieben . Unsere Ergebnisse zeigen, dass dieser Pilz über einen Bereich von verschiedenen pH-Werten (etwa 4,3 bis 9,4) wachsen könnte. Obwohl C. globosum bei einem pH-Wert von 3,51 wuchs, waren diese Kolonien klein und hatten eine abnormale Morphologie (Abbildung 2). Das Wachstum von C. globosum ist bei einem neutralen pH-Wert optimal (Abbildung 1).
Nachweisbare Konzentrationen von Chaetoglobosin C wurden nur auf dem Medium mit den größten C. globosum-Kolonien beobachtet. Dieser Befund stimmt mit unseren Ergebnissen einer früheren Studie überein, die darauf hindeuten, dass die Produktion von Chaetoglobosinen direkt mit dem Wachstum zusammenhängt. Nach der Untersuchung des Wachstums von C. globosum Auf vier im Handel erhältlichen Medien fanden wir heraus, dass das Medium, das das beste Wachstum unterstützte, auch die höchste Produktion von Chaetoglobosinen A und C unterstützte.
Es wurde gezeigt, dass der Umgebungs-pH-Wert die Metabolitenproduktion in anderen filamentösen Pilzen beeinflusst. Das am besten untersuchte Regulationssystem ist Aspergillus nidulans, das durch einen Transkriptionsfaktor namens PacC gesteuert wird . Unter alkalischen Bedingungen aktiviert PacC alkalisch exprimierte Gene wie acvA und ipnA, die an der Penicillinsynthese beteiligt sind, und unterdrückt sauer exprimierte Gene wie stcU, die an der Sterigmatocystinsynthese beteiligt sind. Andere filamentöse Pilze mit PacC-Homologen umfassen Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum, Sclerotinia sclerotiorum und Fusarium verticillioides . Ein hypothetisches Protein, das PacC ähnlich ist, wurde innerhalb des C. globosum-Genoms lokalisiert . Angenommen, dieser Pilz hat ein ähnliches Regulierungssystem wie in A. nidulans, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Chaetoglobosinproduktion nicht unter ihrer Kontrolle steht.
Die Bildung von Perithezien und Ascosporen durch C. globosum scheint in saurer Umgebung begünstigt und unter basischen Bedingungen auf künstlichem Medium gehemmt zu sein. Nach vier Wochen waren Ascosporen in nachweisbaren Konzentrationen auf ungepuffertem PDA (pH 5,63) und trismaleatgepuffertem PDA (pH 5,21 und 6,53) vorhanden (Tabelle 2). C. globosum produzierte schließlich acht Wochen nach der Inokulation Perthecia und Ascosporen auf citratphosphatgepuffertem PDA. Auf Tris-gepuffertem PDA wurden bei pH 8 keine Ascosporen produziert.24 oder auf dem Carbonat-Bicarbonat-gepufferten PDA bei pH 9,07, 9,25 und 9,35 (Tabelle 2). Es ist auch möglich, dass diese Hemmung der Sporulation bei einem basischen pH-Wert auf das Vorhandensein einer der Komponenten des Puffers zurückzuführen ist, obwohl der Mechanismus zum gegenwärtigen Zeitpunkt unbekannt bleibt.