Materialien und Methoden
Nach schriftlicher Einverständniserklärung von Patienten untersuchten wir die Steady-State-Pharmakokinetik von oral verabreichtem Clonidin im Plasma von 17 schwangeren Frauen, die Clonidin während der mittleren Schwangerschaft (22-26 Schwangerschaftswochen) oder der späten Schwangerschaft (34-38 Schwangerschaftswochen) erhielten. Sechs dieser Frauen nahmen zum Zeitpunkt der Entbindung an mütterlichen und Nabelschnurplasmaproben teil (arteriell und venös) zur Messung der Clonidinkonzentrationen. Das Gestationsalter basierte auf der letzten Regelblutung oder dem frühen Ultraschall Dating.
Themenauswahl. Diese Studie wurde vom Investigational Review Board der University of Washington genehmigt. Die Probanden waren teilnahmeberechtigt, wenn sie schwanger waren, 18 Jahre alt waren, einen Hämatokrit von ≥28% aufwiesen und orales Clonidin gegen mütterliche Hypertonie erhielten.
Dosierungsschema. Die orale Clonidin-Therapie wurde zu Studienzwecken nicht verändert. Dosierungen reichten von 0,15 bis 0,30 mg pro Tag, in geteilten Dosen gegeben. Die Dauer der pharmakokinetischen Studie war abhängig vom Dosierungsintervall des Probanden, das zwischen 6 und 12 h lag. Für 3 Tage vor der Studie wurden orale Clonidin-Tabletten aus der gleichen Charge bereitgestellt. Die Probanden zeichneten den Zeitpunkt jeder Dosis in einem Studienkalender auf. Die Probanden nahmen ihre morgendliche Clonidin-Dosis innerhalb von 30 Minuten nach 8:00 Uhr ein. Nachfolgende Dosen wurden innerhalb von 30 Minuten nach den geplanten Verabreichungszeiten eingenommen. Am Morgen der pharmakokinetischen Studie wurden die Probanden gebeten, mit Ausnahme klarer Flüssigkeiten 5 h vor der Verabreichung von Clonidin bis 1 h nach der Dosierung zu fasten.
Probensammlung. Serielle Plasmaproben wurden zu folgenden Zeiten gesammelt: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, und 12 h Nachdosierung oder abgeschnitten, um dem Dosierungsintervall des Probanden zu entsprechen. Der Urin wurde über ein Dosierungsintervall gesammelt, um die renale Clearance von Clonidin und die Kreatinin-Clearance zu bestimmen. Plasmaproben, Mutter- und Nabelschnur (arteriell und venös), wurden zum Zeitpunkt der Entbindung zur Quantifizierung der Clonidinkonzentrationen entnommen. Alle Proben wurden bis zur Probenanalyse bei -80°C gelagert.
Clonidin-Konzentrationen. Die Clonidin-Plasmakonzentrationen wurden unter Verwendung eines validierten Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) -Assays quantifiziert. Kurz gesagt, 250 µl Plasmaproben wurden mit 500 pg internem Standard (Clonidin-d4) in 500 µl Natriumcarbonat (0,1 M) (pH = 9,3) und 3 ml Heptan/Isoamylalkohol (98,5: 1,5) gemischt. Standards wurden hergestellt, indem Blankplasma mit 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, und 750 pg Clonidin. Die Proben wurden auf einem horizontalen Schüttler 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zentrifugation (1500g für 10 min) wurden die Proben auf Trockeneis eingefroren und die organische Schicht in ein sauberes Kulturröhrchen dekantiert. Zwei Milliliter Schwefelsäure-Aliquots (0,05 M) wurden zu der organischen Schicht gegeben und erneut 15 min geschüttelt. Nach Zentrifugation (1500g für 10 min) wurden die Proben auf Trockeneis eingefroren und die organische Schicht verworfen. Ein 200-µl-Aliquot von 29.Die wässrige Schicht wurde zusammen mit 3 ml Heptan/Isoamylalkohol (98,5:1,5) mit 29% igem wässrigem Ammoniumhydroxid versetzt und 15 min geschüttelt. Nach Zentrifugation (1500g für 10 min) wurden die Proben auf Trockeneis eingefroren und die organische Schicht in ein sauberes Kulturröhrchen dekantiert. Die organische Schicht wurde unter Stickstoffstrom bei 40°C eingedampft. Der Rückstand wurde mit 75 µl Ameisensäure (12 mM)/Methanol (60:40) rekonstituiert, wovon 10 µl auf das LC/MS-System injiziert wurden.
Urinproben von 250 µl wurden mit 250 µl Ameisensäure (12 mm) und 50 ng internem Standard (Clonidin-d4) gemischt. Standards wurden hergestellt, indem Blankourin mit 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, und 25 ng Clonidin. Die Proben wurden vortext und 1 µl auf das LC/MS injiziert.
Das LC/MS-System war ein Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), bestehend aus binärer Pumpe, Autosampler, Säulenkompartiment und Massenspektrometer. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule war eine Phenomenex Synergi Polar RP80A, 250 mm×2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). Die Säule wurde bei 40°C gehalten. Laufmittelkomponenten waren 12 mM Ameisensäure (A) und Methanol (B) mit einer anfänglichen Flussrate von 0,25 ml/min. Die anfängliche mobile Phase wurde 1 min lang aufrechterhalten und bestand aus 40% B für Plasmaproben und 35% B für Urinproben. Der Prozentsatz von B wurde linear über die nächsten 4 min auf 90% für Plasma und 60% für Urin erhöht und dann für 1 min konstant gehalten mit einem linearen Flussanstieg auf 0,3 ml / min für Urin und Plasma. Für den Rückkehrgradienten wurde der Anteil von B dann linear über 1 min auf 40% (Plasma) bzw. 35% (Urin) abgesenkt, der dann konstant gehalten wurde. Die Flussrate wurde 1 min lang bei 0,3 ml/min gehalten und dann linear über 1 min auf 0,25 ml/min abgesenkt und dann konstant gehalten. Die Gesamtlaufzeit betrug 12,5 min. Für Plasma- und Urin-Assays wurde das Massenspektrometer im positiven Elektrospray-Modus betrieben und für die selektive Ionenüberwachung von m/z 230 (Clonidin) und m/z 236 (Clonidin-d4) mit einer Verweilzeit von 289 msec für jedes Ion eingestellt.
Pharmakokinetische Parameter. Die pharmakokinetischen Steady-State-Parameter wurden unter Verwendung von nicht-kompartmentellen Standardtechniken bestimmt. Die Fläche unter der Plasma-Clonidin-Konzentrations-Zeit-Kurve über ein Dosierungsintervall (AUCt) wurde unter Verwendung der linearen Trapezregel berechnet. Die scheinbare orale Clearance (CL/F) wurde durch CL/F = Dosis/AUCt berechnet. Die renale Clearance von Clonidin (CLrenal) wurde durch CLrenal = Ae,τ/AUCt berechnet, wobei Ae,τ = die Menge an Clonidin ist, die über ein Dosierungsintervall unverändert im Urin ausgeschieden wird. Die Kreatinin-Clearance wurde durch CrCl = (Volumeurin × Kreatinin) / (Kreatininserum× τ) berechnet. Die um die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) bereinigte renale Clearance von Clonidin wurde durch CLrenal bereinigt um GFR = CLrenal – fu × CrCl berechnet, wobei die im Plasma ungebundene Fraktion (fu) mit 0,80 angenommen wurde (Hulter et al., 1979). Bei allen unseren Probanden erlaubte das relativ kurze Dosierungsintervall keine genaue Abschätzung der Clonidin-Halbwertszeit, die zuvor bei nicht schwangeren gesunden Erwachsenen 11,1 ± 3,3 und 10,8 ± 2,2 Stunden betrug (Cunningham et al., 1994; Fujimura et al., 1994).
Statistik. Unsere pharmakokinetischen Parameter von Clonidin in der Schwangerschaft wurden mit zuvor veröffentlichten Parametern bei gesunden, nicht schwangeren Probanden verglichen (CL / F, Porchet et al., 1992; Cunningham et al., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). Die lineare Regression wurde verwendet, um die Korrelation zwischen der Kreatinin-Clearance und der renalen Clonidin-Clearance zu bestimmen. Der ungepaarte Student’s t-Test wurde verwendet, um die schwangeren und nicht schwangeren Gruppen zu vergleichen. Ein p-Wert <0,05 wurde als signifikant angesehen. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D.
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