Diskussion
Adulte C. sinensis-Würmer, die in Brühmedien inkubiert wurden, produzierten zu Beginn mehr als 4.000 Eier / Wurm / Tag. Danach sank die Anzahl der Eier an Tag 7 auf knapp über 1.000 und an Tag 14 auf 300-400. Die Zählungen wurden am 28-Tag in den sozialen Medien niedriger als 100. Die Zählungen waren einander unter 30 Medien ähnlich. Im Gegensatz dazu waren die Zählungen in der Locke’s Soultion 220 ± 44 und 1023 ± 64 an Tag 1 bzw. 3. Diese Zahlen waren zu Beginn niedriger als in den Brühmedien, aber die Würmer produzierten am Tag 21 und später mehr Eier. Die Würmer in den Brühmedien produzierten ihre Eier in der frühen Phase der Inkubation kräftiger, während die Würmer in der Locke-Lösung täglich, aber über einen längeren Zeitraum, weniger Eier produzierten. Die täglichen Eizahlen von 4.000 von einem erwachsenen Wurm waren kompatibel mit der geschätzten mittleren Anzahl von 3.770 Eiern von einem infizierten Menschen .
Basierend auf den Eizahlen wurden die gesamten Eier, die von einem inkubierten erwachsenen Wurm produziert wurden, der nach 8 Wochen Infektion von Kaninchen gewonnen wurde, im Durchschnitt auf 37.274 ± 2.988 geschätzt. Diese Gesamteierzahlen waren unabhängig von der Kultivierungslösung oder dem Medium ähnlich. Die täglichen Eizellzahlen nahmen rasch ab und die Gebärmutter wurde während der Kultivierung leer. Daher stellten die vorliegenden täglichen Eizählungen dar, dass die in vitro kultivierten Würmer nur die intrauterinen Eier produzierten, die in ihrem Uterus vorgeformt wurden, während sie vor der Kultivierung in Kaninchen lebten. Basierend auf den Daten wird geschätzt, dass ein gravider C. sinensis etwa 37.000 Eier in seiner Gebärmutter enthält und täglich etwa 4.000 Eier produziert. Dementsprechend können die Eier für die intrauterine Reifung etwa 10 Tage in der Gebärmutter bleiben. Die meisten Eier in der Gebärmutter wurden als reif befunden und das Miracidium entwickelte sich bereits, aber einige von ihnen waren hauptsächlich im proximalen Uterus unreif. Diese unreifen Eier konnten sich während der Kultivierung nicht weiter entwickeln. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die kultivierten Würmer nicht in der Lage sind, neue lebensfähige Eier zu formulieren, und die Reifung vorgeformter unreifer Eier durch In-vitro-Kultivierung ebenfalls unmöglich ist.
C. sinensis-Eier sind 28-31 × 13-16 µm groß und haben an ihrem konischen Ende ein Operculum und einen kleinen aboperkulären Knopf . In der vorliegenden Studie zeigten die ausgestoßenen Eier eine abnormale Kontur, da der Wurm länger überlebte. Die durchschnittliche Länge des Eies wurde in der Locke-Lösung (27,49 ± 0,48 µm) und allen Brühenmedien allmählich und signifikant reduziert. Die Längenreduzierung führte zu einer Verringerung des FMI-Wertes. Der FMI wurde als Parameter für die biometrische Analyse vorgeschlagen, um das Volumen der Eier für Heterophyid- und Opisthorchiid-Fluken zu approximieren . In der vorliegenden Untersuchung verringerten sich die FMI-Werte am Tag 60 in der Locke-Lösung und am Tag 90 in den Medien. Die verringerten FMI-Werte deuten auf eine Verringerung des Eivolumens durch Schrumpfung der Länge und Degeneration des Inhalts hin. Die meisten Eier, die nach 60 Tagen In-vitro-Kultivierung produziert wurden, waren deformiert, und ihr Längen- / Breitenverhältnis betrug weniger als 1,7 und der FMI-Wert weniger als 7.000. Die meisten dieser Eier wurden als nicht lebensfähig eingestuft, wenn sie mit Trypanblau gefärbt wurden. Die Kultivierung für 60 Tage könnte die maximale Lebensfähigkeit der Eier sein.
Die lichtmikroskopische Beobachtung ergab eine Ansammlung von Vakuolen und dunklen Massen in der Eierschale, da die Kultivierung länger als 60 Tage dauerte. Die Vakuolen und dunklen Massen schienen deformierte Vitellin-Zellen zu sein, wie in O. viverrini gezeigt. Diese Materialien in den Eiern deuteten darauf hin, dass Vitellinzellen oder andere eibildende Materialien degeneriert waren und die Eier abortiv waren. Die reifen Eier, die das Miracidium bilden, können lange überleben, aber abgebrochene nicht. Die Degeneration der inneren Materialien könnte zu einer Deformierung und Verringerung des Eivolumens geführt haben. Eine Studie fand deformierte Eier, wenn reife Echinostoma caproni gravide Erwachsene in Lockes Lösung bis zu 4 Monate bei 4 ° C gelagert wurden. Eine mögliche Erklärung für die obigen Veränderungen kann eine unsachgemäße Chinongerbung sein, die mit dem Prozess der Eierschalenbildung verbunden ist . Eine langfristige In-vitro-Kultivierung könnte diesen Phenol-Oxydase-vermittelten enzymatischen Prozess beeinflusst haben, der zu einer deformierten Eierschale führte . So kann eine längere In-vitro-Kultivierung von C. sinensis die Eier sowie ihre Lebensfähigkeit verformen.
Reife Eier von C. sinensis enthalten einen sehr unauffälligen aboperkulären Knauf. O. viverrini, ein eng verwandter Leberegel, zeigt ebenfalls sehr kleine bis leicht entwickelte aboperkuläre Knoten der Eier . In der vorliegenden Studie wurde einoperkulärer Knopf der Eierschale in den meisten Eiern nach 60 Tagen Inkubation stärker ausgeprägt. Das Auftreten eines solchen prominenten abopercular Knopf war offensichtlich in den meisten degenerierten Eiern. Krejci und Fried zeigten, dass bei Echinostoma caproni bzw. Infolding von abopercular Knopf umgebenden Schale wurde in der vorliegenden Studie nicht beobachtet. Der prominente aboperkuläre Knopf kann eine Erweiterung des normalen unauffälligen Knopfes als Reaktion auf die sich ändernde Physiologie sterbender Würmer sein. Zusammengenommen ist es für die Würmer schwierig, durch In-vitro-Kultivierung normale lebensfähige Eier zu produzieren.
Die von SEM beobachtete Oberflächenstruktur von Eiern schien ein geeignetes morphologisches Merkmal zum Verständnis des Zustands der Eierschale zu sein. Unter Opisthorchiiden, C. sinensis Eioberfläche ist extrem geformt, um verschachtelte Falten unterschiedlicher Höhe zu bilden, die die Fähigkeit unterstützen, natürliche Wasserfasern anzusammeln und die Möglichkeit des Kontakts mit Weichtierwirten zu erhöhen , . In der vorliegenden Studie wurde eine verminderte Oberflächenfalte durch SEM der abgetriebenen Eier beobachtet. Diese verminderte Faltenbildung mit dem prominenten abopercular Knopf kann ein Ergebnis des Degenerationsprozesses der Eierschale sein.
Die vorliegende Studie hatte einige Einschränkungen. Es gab keine direkten Daten zur Lebensfähigkeit der Eier, die mit morphologischen Veränderungen verglichen werden konnten. Das In-vitro-Schlüpfen von Eiern kann genaue Informationen über die Lebensfähigkeit der Eier liefern, aber das von C. sinensis-Eiern ist immer noch nicht möglich. Auch Daten der Morphologie und Physiologie der inkubierten Würmer waren begrenzt.
Abschließend wird das kultivierte C. sinensis Würmer in Brühe Medien passieren lebensfähige Eier für 60 Tage, die in ihrer Gebärmutter während ihres Überlebens in Kaninchen vorgeformt werden. Die vorgeformten unreifen Eier sind nicht in der Lage, Miracidium durch In-vitro-Kultivierung zu entwickeln. Ein reifer C. sinensis Erwachsener enthält ungefähr 37.000 Eier in der Gebärmutter und produziert ungefähr 4.000 Eier täglich. Die deformierten Eier mit einem FMI-Wert von weniger als 7.000 und einem Längen- / Breitenverhältnis von weniger als 1,7 sind nicht lebensfähig.