Oncology Letters

Einleitung

Lungenkrebs ist die häufigste Krebsart nach Brust- und Darmkrebs, weltweit (1). Die Inzidenz von Lungenkrebs ähnelt den Sterblichkeitsraten für diese Krankheit aufgrund der hohen Sterblichkeit von Lungenkrebs. Nach den verfügbaren Daten der Internationalen Agentur für Krebsforschung wird erwartet, dass die Zahl der Todesfälle durch Lungenkrebs bis 2030 auf etwa 10 Millionen ansteigen wird (2).Die histologisch häufigste Form von Lungenkrebs ist das Adenokarzinom, das fast 50% aller Lungenkrebserkrankungen ausmacht(3).

Histologisch gibt es zwei Haupttypen von Lungenkrebs, das kleinzellige Lungenkarzinom (SCLC) und das Nicht-SCLC (NSCLC). SCLC macht ungefähr 20% aller Lungenkrebsfälle aus, während SCLC fast 80% der Lungenkrebsfälle ausmacht (4). Es gibt drei histologische Subtypen von NSCLC: i) Plattenepithelkarzinom (SCC), ii) Adenokarzinom, undiii) großzelliges Lungenkarzinom, auf die jeweils 25, 40 und 15% der gesamten NSCLC-Fälle entfallen (5).

Trotz der Anerkennung von Lungenkrebs als eine der aggressivsten Krebsarten gibt es nur langsame Fortschritte bei den klinischen Ergebnissen, obwohl eine große Anzahl neuer Arzneimittel verfügbar ist. Der wichtigste Grund für diesen Nachteil bei der klinischen Behandlung von Lungenkrebs ist die Nichtverfügbarkeit validierter Serumtumormarker, die sowohl für die Diagnose als auch für die Diagnose der Krankheit nützlich sind (6). Viele Arten von Malignität verursachen Pleuraergüsse, und Krebsarten, die am häufigsten in die Pleura metastasieren, sind Lungen- und Brustkarzinome und Lymphome. Obwohl die zytologische Untersuchung des Pleuraergusses als Standardansatz für die Diagnose angesehen wird, beträgt seine Empfindlichkeit typischerweise nur 50-70% (7,8).

Eine Reihe von Tumormarkern, einschließlichkarzinoembryonales Antigen (CEA), Kohlenhydratantigen 125 (CA125) und CYFRA21-1, ein Fragment von Cytokeratin 19 (CK19), wurden in vielen Studien als bessere und genauere Tumormarker sowohl im Serum als auch in der Pleuraflüssigkeit bewertet (7,8). Es wurde auch beobachtet, dass eine Kombination von zwei oder mehr Markern wirksamer ist als ein einzelner Marker. Die tatsächliche diagnostische Vorhersagbarkeit dieser Marker wurde jedoch in vielen dieser Studien nicht beurteilt, da das zytologische Vorhandensein von Tumorzellen in den Pleuraergüssen der Patienten nachgewiesen wurde (9-11). Es wurde festgestellt, dass viele der oben genannten Marker in den Pleuraeffusionen von Krebspatienten im Vergleich zu den gutartigen Pleuraeffusionen erhöht waren (7). Pleuraerguss-abgeleitete menschliche Lungenkrebszellen wurden gefunden, um mehr invasiv und metastasierend zu sein als Krebszellen aus primären Läsionen undDieser Unterschied kann mit dem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) zusammenhängen.

EMT, das normalerweise eine wichtige Rolle in der embryonalen Gewebemorphogenese und in der Fibrose nach Verletzungen spielt (12,13), wird während des Erwachsenwerdens unter bestimmten pathologischen Bedingungen wie Krebs unangemessen reaktiviert und trägt zur Tumormetastasierung bei (13). Es ist bekannt, dass EMT die vielen Veränderungen und die daraus resultierende Phänotypmodulation in der Tumorarchitektur vermittelt. EMT ist gekennzeichnet durch die Störung der interzellulären Adhäsion, erhöhte Tumorzellmotilität, Verringertsuszeptibilität für Anoikis und Apoptose und in der Freisetzung von Zellenaus Epithelgewebe (9-11). Die freigesetzten Tumorzellen, die gegen Anoikis resistent sind, nehmen einen mesenchymähnlichen Phänotyp an, der für Migration, Invasion und Verbreitung geeignet ist und zur metastatischen Progression beiträgt. In vielen Fällen bestimmt der Grad der EMT von Krebszellen die Schwere von Krebs (14). Es wurde auch gezeigt, dass EMT an der Resistenz gegen Anoikis beteiligt ist, was für die Hemmung der Krebsmetastasierung bei verschiedenen soliden Tumoren von entscheidender Bedeutung ist (15).

Zytokeratine (CK) sind häufige Tumormarker und sinddie wichtigsten strukturellen Elemente des Zytoskeletts in Epithelzellen, und auf der Grundlage der strukturellen Eigenschaften CKSES gibt 20subtypen. Von diesen ist CK19 ein lösliches und saures Typ-I-CK und wird in der Epithelauskleidung des Bronchialbaums exprimiert und ist bekanntermaßen in Lungenkrebsgeweben überexprimiert (16). Es gibt erhöhten CK19-Abbau inneoplastisch transformierte Epithelzellen aufgrund der erhöhten Caspase-3-Aktivität, und die proteolytischen Fragmente, insbesondere CYFRA21-1, werden in das Blut freigesetzt. CK19 gilt als eng mit Lungenkrebs assoziiert; Einige Studien berichteten jedoch, dass die CK19-Expression bei bestimmten Lungenkrebsarten negativ ist (9-11). CK19expression in einigen Lungenkrebszelllinien wurde folgende reduzierttransformierender Wachstumsfaktor (TGF) -β-induzierte EMT (17). Die zirkulierenden Spiegel von CK19-Fragmenten, einschließlich CYFRA21-1, spiegeln wahrscheinlich das Ausmaß der Zytoskelettbildung in Krebszellen wider und können auch mit dem Grad der Tumordifferenzierung in Richtung Plattenepithel in Verbindung gebracht werden (16).

In der vorliegenden Studie wurden Tumorproben von 111 Lungenkrebspatienten eingesetzt und die Inzidenz von CK19-negativen Expressoren bei verschiedenen Arten von Lungenkrebs untersucht, sowie ob die Induktion von EMT in den primären Fokuszellen die Expression von CK19 beeinflusst. Wir untersuchten auch, ob CK19-negative Lungenkarzinome invasiver und metastasierter waren.

Patienten und Methoden

Allgemein

Alle 111 Patienten wurden nach dem 7. Standard-TNM-Staging ausgewählt, das 2007 vom American Joint Committee onCancer und der Union for International Cancer Control (9-11) beschrieben wurde. Lungenkrebspatienten, bei denen im Stadium IV verschiedene Arten von Lungenkrebs diagnostiziert wurden und die mit Tyrosinkinasehemmern oder Platin (75 mg /m2) und Docetaxel (75 mg /m2)-basierter Chemotherapie behandelt wurden, wurden in die vorliegende Studie aufgenommen. Die Patienten wurden zwischen Januar 2013 und Dezember 2014 in das Subei People’s Hospital eingeliefert.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Subei People’s Hospital genehmigt. Von jedem Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Diese Studie entspricht dem ‚Ethikkodex der Weltärztekammer‘ (Erklärung von Helsinki, 1964).Die 111 Patienten umfassten 90 Männer (44-82 Jahre) und 21 Frauen (40-75 Jahre). Insgesamt wurden 56 Adenokarzinom-, 21SCC-, 32 SCLC- und 2 adenosquamöse Karzinomfälle identifiziert.Die eingeschlossenen Patienten entsprachen den folgenden Kriterien: Karnofskys hatte eine > 60-jährige Lebenserwartung von > 3 Monaten, keine Erkrankungen des Immunsystems, normales Elektrokardiogramm, normale Leber- und Nierenfunktion und erhielt innerhalb eines Monats vor der Studie keine Antitumortherapie. Mit Tyrosinkinase-Inhibitoren behandelte Fälle waren vom Typ des Adenokarzinoms.

Blutproben wurden von allen Patienten gesammeltund Seren wurden getrennt und bis zur anschließenden Analyse eingefroren.Pleuraergussproben wurden nach den genehmigten Verfahren entnommen und zytologisch untersucht und für die Immunhistochemie aufbereitet.

Immunhistochemie

Tumorgewebeproben (Primärherde) wurden für die Immunhistochemie zum Nachweis von CK19, E-Cadherin und Vimentin verarbeitet. Primärfokus-Gewebeproben wurden in Formalin fixiert und in Paraffinblöcke eingebettet. Mehrere Schnitte (4 µm) aus jeder Probe wurden für die immunhistochemische Analyse verwendet. Die Proben wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Anti-CK19-, Anti-E-Cadherin- und Anti-Vimentin-Antikörper wurden von TIYO BiotechnologyCorporation (Shanghai, China) gekauft. Polyklonaler Anti-CK19-Kaninchen-Antikörper (Katalog-Nr. Z98123) wurde in einer Verdünnung von 1:50 verwendet;anti-E-Cadherin CK19 rabbit polyclonal (Katalog-Nr. Z86603) Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet; und Anti-Vimentin CK19rabbit polyklonaler Antikörper (Katalog-Nr. Z40651) wurde in einer Verdünnung von 1:500 verwendet, gefolgt von Inkubation mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-IgG (Beijing CellChip Biotechnology Co.,Ltd., Peking, China) in einer Verdünnung von 1:100. Die Farbentwicklung wurde unter Verwendung von 3,3′-Diaminobenzidinsubstrat durchgeführt.

Das Auftreten von Tan-Partikeln in der Zellmembran und im Zytoplasma wurde als positiv für CKl9, E-Cadherin bzw. Immunhistochemische Ergebnisse wurden bestätigtvon zwei Pathologen mit einer doppelblinden Methode.

Markeranalysen

Ein automatischer Chemilumineszenz-Immunoassay-Analysator Roche E601 Cobas (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) wurde zur Messung von Serum-CEA, CA125, neuronenspezifischer Enolase (NSE), α-Fetoprotein (AFP) und CYFRA21-1 in Patientenseren und Pleurafusionen verwendet. CYFRA21-1 > 3,3 ng / ml, NSE > 15,2 ng / ml, CEA > 5,0 ng / ml, CA125 > 35,0 ng / ml und AFP > 7 ng / ml wurden berücksichtigtpositive Werte.

TGF-β1-induzierte EMT in Lungentumorzellen

Tumorzellen wurden aus primären Fokusgeweben isoliert, die von den Patienten erhalten wurden. Primärzellen wurden aus primärem Tumorgewebe und Pleuraerguss desselben Patienten isoliert und kultiviert. Die Isolierung der Zellen erfolgte in zwei Schritten: i) Zentrifugation durch Lymphozytenseparationsmedium (spezifische Schwerkraft von 1.077), gefolgt von einer Kultivierung in RPMI-1640-Medium mit 20% fetalem Rinderserum (Beijing LabLead BiotechnologyCorporation, Peking, China) für 2 Tage. ii) Anschließend 40/20% Percoll (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Peking, China) wurde als zweite Zentrifugationsstufe zur Trennung der Zellen verwendet. Die gesammelten Zellen wurden erneut in kultiviertrpmi-1640 Kulturmedium, das 20% fetales Rinderserum enthielt, undinkubiert bei 37 ° C unter 5% CO2 Atmosphäre bis 70-80% Konfluenz. Die Zellen wurden mit TGF-β1 (gekauft Vonshanghai Kexing Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) bei 5 ng/ml für 24 h. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und aufbereitet. Immunhistochemische Analyse für E-Cadherin, CK19 und Vimentin, wurde vor und nach der Behandlung mit TGF-β1 durchgeführt, wie oben beschrieben. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein dieser Marker wurde als positiv bzw. negativ bewertet.

Statistische Analyse

P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Patientenmerkmale

Die 111 Patienten umfassten 90 Männer und 21 Frauen mit einer ähnlichen Altersverteilung (40-80 Jahre). Bei den Patienten wurde Lungenkrebs im Stadium IV diagnostiziert. Histologisch waren die meisten Fälle Adenokarzinome, gefolgt von SCLC und SCC, sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Patienten (TableI). In dieser Patientenprobe gab es nur zwei Fälle von adenosquamösem Karzinom. Die Mehrheit der Patienten erhielt eine Chemotherapie auf Platin- und Docetaxel-Basis Chemotherapie, während diejenigen mit epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor Gain-of-functionmutations Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) -Therapie (Gefitinib) verabreicht wurden. Nur eine kleine Anzahl von Patienten (5 Männer und 1 Frau)erhielt diese Therapien aus finanziellen Gründen nicht.

Histologie des Primärtumorgewebes

Tumorgewebe von 111 Patienten wurden immunhistochemisch auf CK19-Expression untersucht. Während bei bestimmten Lungenkrebsarten eine erhöhte ck19-Expression beobachtet wurde, ist ein Verlust von CK19 wahrscheinlich mit EMT assoziiert (17). In der vorliegenden Studie fehlte die CK19-Expression in vielen SCLC-Tumoren, > 50% bei Männern und 100% bei Frauen. Daher war die CK19-Expression in SCLC-Tumoren im Vergleich zu anderen Lungenkrebspatienten relativ vermindert (Abb. 1). Von Denadenokarzinomen waren etwa 31% der Tumoren männlicher Patienten negativ für CK19, was bei Frauen viel niedriger war (7%).Insgesamt zeigten SCLC-Tumorgewebe eine höhere Wahrscheinlichkeit für EMT-Eigenschaften (Tabelle I). Der Anteil CK19-negativer exprimierter Primärtumoren sowie Pleuraergusszellen zeigte sich nach TKITHERAPIE im Vergleich zu unbehandelten oder chemotherapeutisch behandelten Patiententumoren bei allen Lungenkrebsarten (Abb. 2).

CYFRA21-1-Spiegel

Serum- und Pleuraerguss-CYFRA21-1-Spiegel gelten als wichtige Marker für Malignität bei vielen Krebsarten, insbesondere bei Lungenkrebs. Da CYFRA21-1 ein Fragment von CK19 ist, untersuchten wir die Serum- und Pleuraergusscyfra21-1-Spiegel als Funktion des Verlusts der CK19-Expression Inpleuralergusszellen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei starker Expression von CK19 in den primären Fokus- und Pleuraergusszellen die CYFRA21-1-Spiegel hoch waren und bei Verlust der CK19-Expression in den primären Tumoren und / oder Pleuraergusszellen die CYFRA21-1-Spiegel bei allen Krebsarten signifikant abnahmen (Abb. 3). Darüber hinaus waren die CYFRA21-1-Spiegel im Serum und Pleuraerguss von Patienten mit C19-positiven SCC-Tumoren im Vergleich zu anderen Tumorarten viel höher (Abb. 2). Die hohen Konzentrationen von CYFRA21-1 in SCC-Patientenseren und Pleuraerguss spiegeln wahrscheinlich das starke Vorhandensein von CK19 in positiven Tumoren wider (Abb. 1). Die Ergebnisse deuteten auch darauf hin, dass die CYFRA21-1-Serumspiegel in den Lungenkrebsen im Vergleich zu den gutartigen Basenspiegeln (1,3–2,6 ng / ml) nur geringfügig erhöht waren, mit Ausnahme von SCC, wo der Anstieg weit über dem Normalbereich lag (Abb. 3). Allerdings waren die CYFRA21–1-Spiegel beim Pleuraerguss der Lungenkrebspatienten stark über dem gutartigen Bereich (6,5-35 ng / ml) (18) erhöht, was darauf hindeutet, dass die Messung des Pleuraergusses von CYFRA21-1 ein optimaler Tumormarker ist.

Andere Serummarker

Marker für Tumormalignität, einschließlich CA125, CEA, NSE und AFP, wurden in den Seren einiger Patienten gemessen, und es gab erhebliche Unterschiede zwischen den Patienten und den Spiegeln.Somit ist für Patienten mit ADC der Durchschnitt von CA125, CEA, NSE und AFPwas 23.6±10.9, 48.3±39.7, 10.1±2.4, und 2,1±0,6, beziehungsweise. Bei Patienten mit SCC betrug der Durchschnitt von CA125, CEA, NSE und AFP 57.1±31.5, 5.6±2.7, 20.8±2.5, und 2,6 ± 0,4 jeweils Keiner dermarker unterschied sich signifikant vom Normalbereich (Abb. 4).

Induktion von EMT in Primärfokuszellen durch TGF-β1

TGF-β1 inkubiert mit Primärfokus-Lungentumorzellen führte in vielen Fällen zu EMT-relevanten Veränderungen. So wurden in fast 40% der Adenokarzinomtumoren CK19-positive primäre Fokuszellen induziert, um die CK19-Expression zu verlieren und EMT durch TGF-β1 zu durchlaufen. Dieser Anteil an Tumoren betrug 28% für SCC und 50% für SCLC (Abb. 5). Somit können SCLC-Primärfokuszellen leichter durch TGF-β1 EMT unterzogen werden. Wie oben erwähnt, zeigen SCLC-Primärzellen auch ohne Induktion durch TGF-β1 ein höheres EMT-Niveau (TableI).

Ein weiterer Satz wichtiger Marker für EMT ist der Verlust von E-Cadherin und der Gewinn der Vimentin-Expression. E-Cadherin wurde in fast 37,5% der Adenokarzinom-Primärtumorzellen, 52,3% der SCC-Tumorzellen und 22% der SCLC-Tumorzellen als negativ befunden (Abb. 6), vor der Behandlung mit TGF-β1. Im Gegensatz dazu war die Vimentin-Expression in diesen Tumoren in 23,2% der Adenokarzinom-Tumorzellen, 33,3% der SCC-Tumorzellen und 31,3% der SCLC-Tumorzellen positiv (Abb. 7). Nach der Behandlung von Lungentumor-Primärfokuszellen mit TGF-β1 war der Verlust der E-Cadherin-Expression immer mit einem Anstieg der Vimentin-Expression verbunden (Abb. 8). Dasprozentsatz von SCC-Tumoren, die diese Reaktion auf TGF-β1 zeigten (40% ige Veränderung der E-Cadherin-Expression und 57% der Vimentin-Expression), warhöher als bei Adenokarzinomen und SCLC (Abb. 6).

Diskussion

Der vergleichende Expressionsstatus von CK19 in primären Lungenkrebsgeweben und in Pleuraergüssen kann nützlich sein, um die Metastasierungsfähigkeit dieser Krebszellen zu beurteilen. Wenn also die Pleuraergusszellen eines Patienten im Vergleich zu den primären Lungenkrebsgeweben desselben Patienten eine höhere negative Expression von CK19 aufweisen, wird angenommen, dass die negative CK19expression mit Invasion und Metastasierung assoziiert ist (19). So wurde in der vorliegenden Studie ein großeranteil der Patienten mit SCLC-Tumoren hatte Tumorgewebe ohne Expression von CK19 und die Pleuraergusszellen bei diesen Patienten zeigten einen Mangel an CK19-Expression, was auf einen hohen Grad an Metastase bei dieser Art von Lungenkrebs hinweist, der ein typisches Merkmal von SCLC ist (20). Mehrere Gründe für den Verlust der CK19-Expression wurden vorgeschlagen, einschließlich veränderter Expression und verstärktem proteolytischem Abbau (21).

Da CYFRA21-1 ein Fragment von CK19 ist, werden Serum- und Pleuraerguss-CYFRA21-1-Spiegel als wichtige Malignitätsmarker für viele Krebsarten, insbesondere für Lungenkrebs, angesehen (7,21). Es ist jedoch schwierig, sicher zu sein, dass die Krebsdiagnose auf der Grundlage der zirkulierenden CYFRA21-1-Spiegel erfolgt, da es Lungenkrebsfälle gibt, in denen die CYFRA21-1-Spiegel verringert sind, während in anderen Fällen ein Anstieg zu verzeichnen ist (7,21).Aus den vorliegenden Befunden geht jedoch hervor, dass die Serum-CYFRA21-1-Spiegel mit der erhöhten Möglichkeit einer EMT abnahmen, wie durch den Verlust der CK19-Expression in Pleuraergüssen im Vergleich zum entsprechenden Primärtumorgewebe festgestellt wurde. Somit können Serum-CYFRA21-1-Spiegel zusammen mit dem CK19-Expressionsstatus von Krebszellen aus Primärfokus- und Pleuraergüssen die Invasions- und Metastasierungsfähigkeit der Lungenkrebszellen positiv identifizieren. Andere Marker, darunter CA125, CEA, AFP und NSE, die häufig für die Krebsdiagnose verwendet werden, waren in dieser Bewertung nicht konsistent.

Die Metastasierungsfähigkeit wird den primären Krebszellen über EMT verliehen, und einer der Hauptfaktoren, die EMT induzieren können, ist TGF-β1. Obwohl TGF-β1 normalerweise als Inhibitor der Epithelzellproliferation fungiert, wirkt TGF-β1 aufgrund veränderter Signalwege in vielen Krebszellen zur Verbesserung der Proliferation von Krebszellen, einschließlich Lungenkrebszellen (22). Zusätzlich zum enhancingcancer Zellwachstum, ist TGF-β1 bekannt, EMT in den Krebs cellsand zu fördern, das folglich zur Krebszelleninvasion und -metastasierung beiträgt. Es wurde vorgeschlagen, dass TGF-β1 in den frühen Stadien der primären Tumorentwicklung in Epithelgeweben als Inhibitor des Tumorwachstums über Zellzyklusstillstand und Apoptose wirkt (23,24).Wenn jedoch eine Tumorprogression auftritt, kommt es in den späteren Stadien der Tumorentwicklung entweder zu einer Inaktivierung des TGF-ß1-Signalwegs oder zu einer abnormalen Regulation des Zellzyklus, und die Krebszellen werden resistent gegen eine Wachstumshemmung durch TGF-β1 (23,24). Unter diesen Bedingungen wird TGF-β1 von den Krebszellen als Wachstumsförderer verwendet (25). Die Expression von mRNA und Protein ofTGF-β1 war bei vielen Krebsarten, einschließlich Pankreas, Dickdarm, Magen, Lunge, Endometrium, Prostata, Brust, Gehirn und Knochen, stark erhöht (26).

In Anbetracht der Tatsache, dass die Neigung zur EMT in Gegenwart eines Zytokins wie TGF-β1, von dem bekannt ist, dass es bei Lungenkrebspatienten erhöht ist, erhöht wird, untersuchten wir die Emtinduzierbarkeit von primären Fokuszellen ex vivo durch TGF-β1.Abhängig vom verwendeten EMT-Marker hatten SCLC- und SCC-Tumoren eine höhere Fähigkeit, TGF-β1-induzierte EMT zu durchlaufen. SCLC primäre focuscells sind induzierbar EMT durch TGF-β1 leichter zu unterziehen, wenn weconsider Verlust der CK19-Expression. Es gibt in der Tat einen höheren EMT-Grad in Bezug auf den Mangel an CK19 in SCLC-Primärtumorzellen. Im Gegensatz dazu reagieren SCC-Tumorprimärzellen durch den Verlust von E-Cadherin und erhöhten Vimentin-Expressionen. Die Herunterregulation von E-Cadherin charakterisiert zusammen mit der Hochregulation von N-Cadherin den EMT-Prozess, und diese Veränderungen in der Expression dieser Proteine sind mit dem Erwerb von Resistenzen gegen Apoptose Undanämie verbunden (27,28).

Zusammenfassend deuten die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass die Invasion und Metastasierung von Lungentumorzellen durch ein vollständiges Bild des Serum-CYFRA21-1 zusammen mit dem CK19-Expressionsstatus von primären Fokuszellen und Pleuraeffusion beurteilt werden kann. Diese Beurteilung kann weiter verbessert werden, indem die Neigung der isolierten primären Fokuszellen untersucht wird, sich einer GF-β1-induzierten EMT in Zellkultur zu unterziehen.

Danksagung

Die Autoren danken Dr. Yong Chen und Dr. Jixin Jiang für ihre technische Unterstützung.

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