Mechanismen der chromosomalen Umlagerung im menschlichen Genom

Pathologische DSBs werden willkürlich als DSB definiert, die keinem physiologischen Zweck dienen und zu Zellfunktionsstörungen führen können.

Zufällige DNA-Brüche durch ionisierende Strahlung oder oxidative freie Radikale

Bei vielen chromosomalen Umlagerungen scheinen die DSBs an einem oder beiden Genen zufällig in großen Regionen vieler Kilobasen zu liegen. Zufällige Positionierung und der offensichtliche Mangel an Sequenzneigung deuten auf sequenzunspezifische DSB-Mechanismen wie oxidative freie Radikale, ionisierende Strahlung oder seltener spontane DNA-Backbone-Hydrolyse hin.

Etwa die Hälfte der natürlichen ionisierenden Strahlung der Umwelt stammt von natürlichen Schwermetallen der Erde wie Uran, Thorium und sogar Kalium. Die andere Hälfte der ionisierenden Strahlung stammt von kosmischer Strahlung, die nicht vollständig von der Atmosphäre blockiert wird. Insgesamt passieren stündlich etwa 3 x 108 ionisierende Strahlungspartikel jeden von uns und produzieren freie Hydroxylradikale aus Wasser. Dieser Trakt von freien Hydroxylradikalen verursacht Clusterschäden an der DNA, wodurch beide DNA-Stränge gebrochen werden.

Etwa 0,1% des Sauerstoffs, den wir atmen, wird in freie Radikale umgewandelt . Dies erzeugt 3 x 1022 freie Radikale pro Stunde in jedem von uns, und diese schädlichen freien Radikale sind über die 1014 Zellen des menschlichen Körpers verteilt. Freie Radikale verursachen überwiegend Einzelstrang-DNA-Schäden, aber zwei nahe gelegene solche Ereignisse können zu einem DSB führen.

RAG-Aktion an kryptischen RSS-Stellen an Off-Target-Stellen sequenzspezifisch: V(D) J-Typ bricht

Die RSS-Heptamer / Nonamer-Konsensussequenz ist keineswegs eindeutig für die Ig- und TCR-Loci, und der RAG-Komplex kann an Stellen schneiden, die sich wesentlich vom 16-bp-Konsens unterscheiden. Das minimale Motiv für RAG Nicking ist nur CAC. Somit kann der RAG-Komplex an RSS-ähnlichen Nicht-Antigen-Rezeptor-Locus-Stellen wirken, die als Cryptic RSS (cRSS) bezeichnet werden. Dies tritt bei vielen der Umlagerungen auf, die beim akuten lymphoblastischen Lymphom mit humanen T-Zellen beobachtet werden . In diesen Fällen wird anstelle des RAG-Komplexes ein 12-RSS mit einem 23-RSS, ein 12-RSS-Paar mit einem 23-cRSS oder ein 23-RSS-Paar mit einem 12-cRSS gepaart. Wir nennen diese Pausen V (D) J-Typ Pausen, weil sie über den gleichen Mechanismus wie normale V (D) J-Rekombination auftreten, unabhängig von der Tatsache, dass eine der Seiten außerhalb der üblichen Antigen-Rezeptor-Loci ist (das heißt, es ist off-Target).

RAG-Einwirkung an DNA-Blasenstrukturen und anderen Bereichen der Heterologie strukturspezifisch

Neben seiner sequenzspezifischen Schneidweise kann der RAG-Komplex auch strukturspezifisch an Übergangsstellen von dsDNA zu ssDNA wirken, wie sie an den Rändern von Blasen-DNA-Strukturen oder auch bei Single-Base-Mismatches auftreten. Eine solche Aktivität durch den RAG-Komplex kann entstanden sein, weil der RAG-Komplex daran gewöhnt ist, Haarnadelstrukturen zu erzeugen, was eine erhebliche DNA-Verzerrung mit sich bringt. Daher ist jede Region mit Fehlanpassung oder Schlupf ein potenzielles Ziel für das Einknicken durch den RAG-Komplex in lymphoiden Zellen.

RAG-vermittelte Transposition als Mechanismus für chromosomale Umlagerung

Von 1998 bis 2007 schlugen mehrere Laboratorien vor, dass der RAG-Komplex die stumpfen RSS-haltigen Enden der V (D) J-Rekombination, sogenannte Signalenden, an neue Stellen im Genom einfügen könnte. Dies wird als RAG-Transposition bezeichnet und tritt auf niedriger Ebene unter Verwendung einer abgeschnittenen Form der RAG-Proteine auf, die als Core RAGs (reviewed in ) bezeichnet werden. Die Bemühungen, RAG-Transpositionsereignisse in vivo zu finden, zeigten jedoch, dass diese viel seltener waren als die zufällige Integration von DNA . Schließlich gibt es keine Beispiele für humane lymphoide Malignome (oder irgendeine andere Art von Malignität), bei denen das Genom durch eine transpositionelle RAG-Insertion von Signalenden (oder eine andere offensichtliche Variante einer solchen Transposition) verändert wurde.

AID-Aktion an Off-Target-Orten

Wie in der obigen Diskussion der Class Switch-Rekombination erwähnt, kann AID C in U oder Methyl C oder T in jeder Region der ssDNA umwandeln. Dies scheint nicht nur an den Schaltsequenzen und variablen Domänen der Ig-Loci aufzutreten, sondern auch an einigen pathologischen Stellen, wie einigen Onkogenen wie c-myc . Wenn diese Regionen von AIDS betroffen sind, können sie Punktmutationen oder DSBS erleiden . Es wird angenommen, dass Hilfsmaßnahmen an der IgH-Schalterregion während der CSR und unabhängige Hilfsmaßnahmen am c-myc-Gen zur Erzeugung eines DSB die Grundlage für die beiden initiierenden DSB sowohl bei Maus- als auch bei menschlichen c-myc-Translokationen bilden . Man könnte Pausen dieses Typs als CSR-Typ-Pausen (wie oben in der Diskussion der Klassenschalter-Rekombination erwähnt) oder SHM-Typ-Pausen betrachten, wobei sich SHM auf AID-initiierte Ereignisse des Typs bezieht, die dem ähnlich sind, was normalerweise bei somatischer Hypermutation auftritt.

Mutmaßliche kombinierte Wirkung von AID und RAGs an CpG-Standorten: CpG-Typbrüche

Kürzlich berichteten wir, dass DSBs an bestimmten Loci in Translokationen im Pro-B / Pre–B-Stadium – der bcl–2 von t (14;18), der bcl-1 von t (11;14) und E2A von t (1;19) – eine starke Neigung haben, an der Dinukleotidsequenz CpG.

Die bcl-2-Translokation ist die häufigste Translokation bei Krebs und tritt bei > 90% der follikulären Lymphome und einem Drittel der diffusen großzelligen Lymphome auf. Fünfzig Prozent der Brüche am bcl-2-Gen treten innerhalb der Major Breakpoint Region (MBR) auf, die ein 175 bp Hotspot im 3’most Exon in der Region ist, die das 3’UTR codiert. Zwei weniger häufig verwendete Hotspots befinden sich 18 und 29 kb weiter distal des bcl-2-Gens, die 105 bp bcl-2 Intermediate Cluster Region (icr) und die 561 bp bcl-2 Minor Cluster Region (mcr). Jede der CpG-Standorte innerhalb einer dieser drei bcl-2-Translokationszonen kann ein Ziel für ein DSB sein . Dreizehn Prozent der bcl-2-Translokationsbrüche befinden sich im icr und 5% im mcr.

Die Verwendung von CPGs gilt auch für den bcl-1-Haupttranslokationscluster, der der Ort ist, der an der t (11;14) -Translokation beteiligt ist. Die bcl-1-Translokation tritt in fast allen Mantelzell-Lymphomen auf, wobei 30% der Brüche am 150 bp bcl-1 Major Translocation Cluster (MTC) auftreten.

CpG-artige Brüche treten auch bei einer dritten lymphoiden Malignität auf, der t(1;19) in einem kleinen Prozentsatz von Pre-B-ALLs eine Translokation, die zwischen dem Pbx1-Gen und dem E2A-Gen auftritt. Die Brüche am E2A-Gen treten in einer Zone von nur 23 bp auf, und diese DSBs sind auch signifikant um CpG-Stellen gruppiert . Alle drei Translokationen, an denen bcl-2, bcl-1 und E2A beteiligt sind, treten im Pro-B / Pre-B-Stadium der B-Zell-Entwicklung auf.

Der bcl-2 MBR ist reaktiv mit einer chemischen Sonde für Einzelsträngigkeit namens Bisulfit . Wie der bcl-2 MBR ist dieser bcl-1 MTC relativ klein (150 bp) und weist eine ähnliche Reaktivität wie Bisulfit auf . Diese in hohem Grade bisulfit reagierenden Zonen sind in den Läufen von Cs reich. Basierend auf Zirkulardichroismus, Röntgenkristallographie, NMR und chemischer Sondierung neigen solche Cs-Läufe dazu, eine DNA-Struktur anzunehmen, die zwischen B-Form-DNA und A-Form-DNA liegt, die als B / A-Intermediat bezeichnet wird . Die B / A-Zwischenstruktur weist eine schnellere Öffnungskinetik auf, was möglicherweise für einen Teil der beobachteten Zunahme der Bisulfitreaktivität verantwortlich ist. Solche ungewöhnlichen DNA-Regionen können anfälliger für Schlupfereignisse sein, die möglicherweise durch DNA-Replikation oder -transkription induziert werden. Dies kann dann für ihre Anfälligkeit in minichromosomalen Rekombinationstests verantwortlich sein .

Die Cs der CPGs innerhalb oder direkt angrenzend an diese B/A-Zwischenzonen sind einem erhöhten Desaminationsrisiko ausgesetzt. Diese Desaminierung gilt nicht für alle Cs in der Region, sondern nur für die Cs, die sich innerhalb von CpG-Standorten befinden. Das einzige Unterscheidungsmerkmal solcher Cs innerhalb von CPGs ist, dass sie durch DNA-Methyltransferase methyliert werden können. Wenn reguläre Cs desaminieren, werden sie zu U, was zu einer U: G-Fehlanpassung führt. Aber wenn Methyl Cs desaminieren, werden sie T, was zu einer T: G-Fehlanpassung führt. Die Reparatur von U: G-Fehlanpassungen ist sehr effizient, aber die Reparatur von T: G-Fehlanpassungen ist nicht effizient. Tatsächlich ist die T: G-Mismatch-Reparatur so ineffizient, dass sie etwa die Hälfte der Punktmutationen am p53-Gen in einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten ausmacht. Diese T: G-Mismatch-Sites befinden sich immer an CpG-Sites.

Was verursacht die Unterbrechung an diesen T: G-Mismatch-Sites? Interessanterweise scheint diese Desaminierung an diesen lymphoiden Translokations-Hotspots im Prä-B-Stadium der Differenzierung aufzutreten. Dies ist das Stadium der B-Zell-Entwicklung, in dem die D- bis J-Rekombination am stärksten auftritt. Da die bcl-2- und bcl-1-Translokationen in diesem Stadium auftreten, scheint dies wahrscheinlich das Stadium der Translokation zu sein. Wir haben gezeigt, dass der RAG-Komplex an Stellen kleiner Blasenstrukturen ein DSB verursachen kann, und sogar einzelne Basenpaarfehlanpassungen. (Wie oben erwähnt, spiegelt diese Wirkung des RAG-Komplexes seine strukturspezifische Nukleaseaktivität wider, möglicherweise ein Merkmal, das die strukturspezifischen Wirkungen des RAG-Komplexes während des Haarnadelbildungsschritts der V (D) J-Rekombination widerspiegelt.) Daher haben wir vorgeschlagen, dass der RAG-Komplex die DSBs an den Stellen der T: G-Fehlanpassung herstellt .

Wenn der RAG-Komplex die DSBs an CpG-Stellen verursacht, warum treten dann solche Brüche vom CpG-Typ nicht in Prä-T-Zellen auf, die auch den RAG-Enzymkomplex exprimieren? Die B-Zell-Linie exprimiert eine Cytidin-Deaminase für die Rekombination von Klassenschaltern und somatische Hypermutation. Wie oben erwähnt, wird dieses Enzym aktivierungsinduzierte Deaminase (AID) genannt. AID wird in B-Zellen exprimiert, aber nicht in anderen somatischen Zellen. AID wird am stärksten in B-Zellen exprimiert, wenn sie sich in den Keimzentren befinden. In Prä-B-Zellen wurde jedoch eine geringe AID-Expression beschrieben . Darüber hinaus wird angenommen, dass B-Zellen, die gerade das Knochenmark verlassen und als Übergangs-B-Zellen bezeichnet werden, ebenfalls HILFE exprimieren . Daher gibt es eine Zeitspanne, in der B-Zellen die V (D) J-Rekombination abschließen und beginnen, AID zu exprimieren, wenn sowohl AID als auch der RAG-Komplex in den B-Zellen vorhanden sind. Daher schlagen wir vor, dass AID wahrscheinlich für die Mutation von meC zu T an CpG-Stellen in frühen B-Zellen verantwortlich ist. Die resultierende T: G-Fehlanpassung wird dann durch den RAG-Komplex geschnitten, was zu einem DSB führt. Dieses Modell erklärt drei Translokationsspitzen innerhalb des bcl-2-MBR, die alle an CpG-Standorten zentriert sind .

Andere Ursachen für pathologische DSBs mit unbekanntem Mechanismus

Bestimmte Translokationen sind stark mit der Typ-II-Toposiomerase-Inhibitor-Therapie assoziiert . Nach einer solchen Therapie entwickeln einige Patienten sekundäre Malignome mit diesen charakteristischen Translokationen. Topoisomerasen machen im Allgemeinen Einzel- oder Doppelstrangbrüche, um DNA zu wickeln oder abzuwickeln, daher haben sie eine Nukleaseaktivität als Teil ihrer Funktion. Nach dem Auf- oder Abwickeln der DNA verschließen sie normalerweise die Unterbrechung (en) wieder. Es wurde vorgeschlagen, dass eine Unterbrechung oder Verhinderung der Wiederversiegelung zu stabilen Brüchen bei chromosomalen Umlagerungen führen kann .

Einige DSBs entstehen an Stellen in der Nähe von direkten oder invertierten DNA-Wiederholungen. Solche Wiederholungen können zu rutschigen DNA-Strukturen führen, die Regionen einzelsträngiger DNA enthalten, die Ziele für die Spaltung sein können. Das beste Beispiel dafür ist die konstitutionelle Translokation t(11;22) (q23;q11), die ein AT-reiches Palindrom von mehreren hundert Basen mit Potenzial zur Kreuzbildung enthält.

Kombination mehrerer DSB-Mechanismen innerhalb einer Umlagerung

Da zwei DSBs erforderlich sind, um eine Translokation zu erzeugen, sind die beiden Brüche oft nicht miteinander verwandt. In den bcl-2- und bcl-1-Translokationen ist der Bruch am IgH-Locus beispielsweise ein Bruch vom V (D) J-Typ, der durch die sequenzspezifische Wirkung des RAG-Komplexes während der V (D) J-Rekombination erzeugt wird. (Man könnte dies als einen Fehler bei der Vervollständigung des normalen V (D) J-Rekombinationsprozesses betrachten.) Der DSB am bcl-2- oder bcl-1-Locus ist ein CpG-artiger Bruch, der aufgrund der sequentiellen Wirkung von AID und der strukturspezifischen Nicking-Aktivität des RAG-Komplexes vorgeschlagen wurde .

Selbst innerhalb eines gegebenen Locus kann es eine breite Palette von DSB-Mechanismen geben. Die SCL- und LMO2-Loci unterstützen überwiegend beide V (D) J-DSBs, aber ein Drittel oder mehr der DSBs sind mit den Sequenzanforderungen für V (D) J-DSBs nicht kompatibel, und diese können auf Schäden durch freie Radikale, ionisierende Strahlung oder Topoisomerase-Ausfälle zurückzuführen sein. Verschiedene Loci innerhalb einer einzelnen Zelle sind daher anfällig für verschiedene Arten von DSB-Mechanismen.

Replikationsinduzierte DSBs

Während der DNA-Replikation können Deletionen aufgrund von Schlupf des synthetisierenden Strangs auf dem Template-Strang auftreten. Chromosomale Umlagerungen, die an bestimmten Hotspots auftreten, sei es bei Krebs in somatischen Zellen oder während der Gametogenese / anfänglichen Entwicklungsabteilungen als konstitutionelle Translokationen, werden als wiederkehrende Translokationen bezeichnet, die bei vielen Patienten auftreten können. Nicht wiederkehrende Translokationen sind solche, die an verschiedenen Orten von einem Patienten zum anderen auftreten, aber ein Gen verändern oder inaktivieren, das eine Krankheit verursacht. Im Gegensatz zu den wiederkehrenden Translokationen, die wir oben in Krebs diskutiert haben, scheinen die Mechanismen, die den Strangaustausch bei nicht wiederkehrenden Translokationen verursachen, einen Templat-Wechsel während der replikativen DNA-Synthese zu beinhalten. Diese Template-Schalter können an kleinen Bereichen der DNA-Sequenzhomologie auftreten, wie 5 bp. Dieses Template-Switching wurde als Mikrohomologie-vermittelte bruchinduzierte Replikation (MMBIR) oder Fork Stalling and Template Switching (FoSTeS) bezeichnet. Für nicht wiederkehrende Translokationsübergänge, die mehrere lange Sequenzabschnitte aus Regionen des Genoms umfassen, die normalerweise voneinander getrennt sind, wurden mehrere Template-Switching-Ereignisse als Mechanismus vorgeschlagen .