Der Prozess der Anwendung von CLARITY Imaging beginnt mit einer postmortalen Gewebeprobe. Als nächstes muss eine Reihe chemischer Behandlungen angewendet werden, um Transparenz zu erreichen, bei der der Lipidgehalt der Probe entfernt wird, während fast alle ursprünglichen Proteine und Nukleinsäuren an Ort und Stelle verbleiben. Ziel ist es, das Gewebe transparent und damit für eine detaillierte mikroskopische Untersuchung seiner funktionellen Bestandteile (vorwiegend Proteine und Nukleinsäuren) zugänglich zu machen. Um dies zu erreichen, muss die bereits vorhandene Proteinstruktur in ein transparentes Gerüst gelegt werden, das sie konserviert, während die Lipidkomponenten entfernt werden. Dieses Gerüst besteht aus Hydrogelmonomeren wie Acrylamid. Die Zugabe von Molekülen wie Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd kann die Befestigung des Gerüsts an den Proteinen und Nukleinsäuren erleichtern, die konserviert werden sollen, und die Zugabe von Wärme ist notwendig, um die tatsächlichen Verbindungen zwischen den zellulären Komponenten und dem Acrylamid herzustellen.
Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, werden die Protein- und Nukleinsäurekomponenten der Zellen des Zielgewebes fest an Ort und Stelle gehalten, während die Lipidkomponenten abgelöst bleiben. Lipide werden dann über 1-2 Wochen passiver Diffusion in Waschmittel entfernt oder durch elektrophoretische Methoden auf nur Stunden bis Tage beschleunigt. Während des Durchlaufs ermöglichen die lipophilen Eigenschaften des Waschmittels, dass es alle auf dem Weg angetroffenen Lipide aufnimmt und herausnimmt. Lipophile Farbstoffe wie DiI werden entfernt, es gibt jedoch klarheitskompatible lipophile Farbstoffe, die an benachbarte Proteine fixiert werden können. Die große Mehrheit der Nicht-Lipidmoleküle wie Proteine und DNA bleibt dank des Acrylamidgels und der chemischen Eigenschaften der beteiligten Moleküle von diesem Verfahren unberührt.
Wie in der ersten Arbeit berichtet, dehnt sich das Gewebe während dieses Prozesses aus, kann aber bei Bedarf mit einem letzten Schritt der Inkubation in Brechungsindex-Matching-Lösung auf seine ursprünglichen Abmessungen zurückgeführt werden.
Zu diesem Zeitpunkt des Prozesses wurde die Probe vollständig für die Bildgebung vorbereitet. Der Kontrast für die Bildgebung kann von endogenen fluoreszierenden Molekülen, von Nukleinsäure- (DNA- oder RNA-) Markierungen oder von Immunfärbungen stammen, wobei Antikörper verwendet werden, die spezifisch an eine bestimmte Zielsubstanz binden. Darüber hinaus sind diese Antikörper mit fluoreszierenden Tags markiert, die der Schlüssel zum endgültigen Bildgebungsergebnis sind. Standard-Konfokal-, Zwei-Photonen- oder Light-Sheet-Bildgebungsverfahren sind alle geeignet, um dann die emittierte Fluoreszenz bis auf die Skala der Proteinlokalisierung zu detektieren, was zu den endgültigen hochdetaillierten und dreidimensionalen Bildern führt, die CLARITY erzeugt.
Nachdem eine Probe für ein Bild immunbestimmt wurde, ist es möglich, die Antikörper zu entfernen und neue erneut aufzubringen, wodurch eine Probe mehrmals abgebildet werden kann und auf mehrere Proteintypen abzielt.