Einzelmutation in einer hochkonservierten Region von Chloramphenicolacetyltransferase ermöglicht Isobutylacetatproduktion direkt aus Cellulose durch Clostridium thermocellum bei erhöhten Temperaturen

Bakterienstämme und Plasmide

Bakterienstämme und Plasmide

Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (MO, USA) und/oder Thermo Fisher Scientific (MA, USA) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Für die molekulare Klonierung wurden Restriktionsenzyme und T4-Ligase von New England Biolabs (MA, USA) erhalten. Phusion Hot Start II DNA-Polymerase wurde für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.

Medien und Kultivierung

Für die molekulare Klonierung und Proteinexpression wurden E. coli-Stämme in Lysogeniebrühe (LB) gezüchtet, die geeignete Antibiotika enthielt, sofern nicht anders angegeben. Zur in vivo Charakterisierung von CATSa in E. coli wurde M9 Hybrid Medium mit 20 g/L Glucose verwendet. Für die C. thermocellum-Kultur wurde MTC-Minimalmedium oder CTFuD-NY-Medium verwendet, wie in den Experimenten angegeben. Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Spektralphotometer bei 600 nm Wellenlänge (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) gemessen.

Multiple Sequence Alignment Analysis

Die Multiple Sequence Alignment (MSA)-Analyse wurde mit MEGA7 durchgeführt. Proteinsequenzen wurden mit ClustalW ausgerichtet und mit ESP-3.0 (http://espript.ibcp.fr) visualisiert. Die Schlüsselmerkmale in Proteinstrukturen von 3U9F , 4CLA und 2XAT wurden jeweils aus CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX und CAT4_PSEAE extrahiert.

Molekulare Modellierung und Andocksimulationen

Dreidimensionale (3D) Strukturen

Die 3D-Struktur von CATSa und Alkoholen von Interesse wurde zuerst mit Swiss-Model bzw. den Builder-Tools von MOE (Molecular Operating Environment Software, Version 2019.01) generiert. Die 3D-Struktur des dualen substratgebundenen CATSa-Komplexes (d. h. Acetyl-CoA–Isobutanol–CATSa) wurde erhalten, indem ein Isobutanol aus dem Isobutanol–CATSa-Komplex extrahiert und dann dem Acetyl–CoA-CATSa-Komplex zugesetzt wurde. Alle Strukturen wurden mit dem QuickPrep-Tool von MOE mit Standardparametern vorbereitet und durch Energieminimierung mit dem Amber10: EHT-Kraftfeld weiter optimiert.

Andocksimulation

Zur Durchführung von Andocksimulationen wurde die potentielle Bindungstasche mit dem ‚Site Finder‘ Tool von MOE gesucht. Die am besten bewertete Stelle, die mit den gemeldeten katalytischen Stellen übereinstimmt , wurde für weitere Studien ausgewählt. Docking-Simulationen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt . Kurz gesagt, Acetyl-CoA und jeder Alkohol wurden unter Verwendung des induzierten Fit-Protokolls mit der Triangle Matcher Placement-Methode und der London ΔG Scoring-Funktion angedockt. Nach den Andocksimulationen wurde die am besten bewertete Bindungspose ausgewählt, die die entscheidende Wechselwirkung zwischen dem Rückstand und dem Substrat bei einer mittleren quadratischen Abweichung (Root-Mean-Square-Deviation, RMSD) < 2 Å zeigt. Als Beispiel für das Acetyl-CoA-Andocken wurde die Bindungspose gewählt, die die Wasserstoffbindung zwischen der Hydroxylgruppe von Ser-148 und dem N71 des CoA aufweist . Für das Andocken von Alkohol wurde die Bindungspose ausgewählt, die die Wasserstoffbindung zwischen dem N3 von His-189 und der Hydroxylgruppe von Alkohol zeigt .

In silico mutagenese Analyse

Die In silico Mutagenese Analyse des Acetyl-CoA–isobutanol–CATSa Komplexes wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Insbesondere wurden die Alanin-Scan- und Rückstandsscan-Tools von MOE verwendet, um die potenziellen Rückstandskandidaten für die Mutagenese zu identifizieren.

Molekulare Klonierung

Plasmidkonstruktion

Plasmide wurden durch die standardmäßige molekulare Klonierungstechnik der Ligase-abhängigen Methode und / oder Gibson-Assemblierung unter Verwendung der in zusätzlicher Datei 1: Tabelle S1 aufgeführten Primer konstruiert. Die konstruierten Plasmide wurden durch Hitzeschocktransformation in E. coli TOP10 eingebracht. Auf einer selektiven Platte isolierte Kolonien wurden PCR-gescreent und Plasmid gereinigt. Die gereinigten Plasmide wurden mittels Sanger-Sequenzierung verifiziert, bevor sie in E. coli BL21 (DE3) transformiert wurden. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des QuickChange ™ -ortsgerichteten Mutageneseprotokolls mit reduzierter Überlappungslänge oder Gibson-Assemblierungsmethode durchgeführt . Für das C. thermocellum Engineering wurde zunächst das Plasmid pHS005 konstruiert und dann zu pHS0024 modifiziert. pHS0024 hat kein hpt am stromabwärts vom Operon, während andere Reihenfolgen des Plasmids zu pHS005 identisch sind.

Transformation

Für die Transformation von E. coli bzw. Für C. thermocellum wurde das Verfahren jedoch leicht modifiziert, wie hier beschrieben. Zunächst wurde C. thermocellum M1354 (Tabelle 2) in 50 ml CTFuD-NY Medium bei 50°C in einer anaeroben Kammer (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., ODER, USA). Die Zellkultur mit OD in einem Bereich von 0,8–1,0 wurde 20 min bei Raumtemperatur abgekühlt. Über diesen Punkt hinaus wurden alle Schritte außerhalb der Kammer durchgeführt. Die abgekühlten Zellen wurden bei 6500×g und 4°C für 20 min geerntet. Die Zellpellets wurden zweimal mit eisgekühltem Milli-Q Wasser gewaschen und in 200 µL des Transformationspuffers bestehend aus 250 mM Saccharose und 10% (v/v) Glycerin resuspendiert. Mehrere 30 µL Aliquots der elektrokompetenten Zellen wurden sofort bei − 80°C zur weiteren Verwendung gelagert. Zur Elektroporation wurden die elektrokompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und mit 500-1000 ng methylierten Plasmiden für 10 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine eisgekühlte 1-mm-Gap-Elektroporationskuvette (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) überführt, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden exponentiellen Abklingpulsen mit 1.8 kV, 350 Ω und 25 µF. Die Impulse ergaben üblicherweise eine Zeitkonstante von 7,0–8,0 ms. Die Zellen wurden sofort in vorgewärmtem frischem CTFuD-NY resuspendiert und bei 50 ° C unter anaeroben Bedingungen (90% N2, 5% H2 und 5% CO2) in einem mit Gummi bedeckten Balchröhrchen gewonnen. Nach 0-12 h Erholung wurden die Zellen mit geschmolzenem CTFuD-NY-Agarmedium gemischt, das mit 15 µg / ml Thiamphenicol ergänzt wurde. Schließlich wurde das Medium-Zell-Gemisch auf eine Petrischale gegossen und in der anaeroben Kammer verfestigt. Die Platte wurde bei 50°C bis zu 1 Woche inkubiert, bis Kolonien erschienen. Die Transformationseffizienz betrug 2-100 koloniebildende Einheiten pro µg Plasmid (KBE/µg Plasmid).

In vivo Charakterisierung von CATSa und seinen Varianten in E. coli

Zur in vivo Charakterisierung von CATSa und seinen Varianten in E. coli wurden, wie zuvor beschrieben, Kulturen mit hoher Zelldichte unter Zusatz von 2 g/L verschiedener Alkohole durchgeführt. Zur In-situ-Extraktion von Estern wurde jedes Röhrchen mit 25% (v/v) Hexadecan überzogen. Um die Proteinexpression von CATSa und seinen Varianten zu bestätigen, wurden 1% (v/v) Stammzellen über Nacht bei 37 °C und 200 U / min in 15 ml Kulturröhrchen mit 5 ml LB-Medium und Antibiotikum gezüchtet. Anschließend wurden 4% (v/v) der Übernachtkulturen in 1 ml antibiotikahaltiges LB-Medium in einer 24-Well-Mikroplatte überführt. Die Kulturen wurden bei 37 ° C und 350 U / min unter Verwendung eines inkubierenden Mikroplattenschüttlers (Fisher Scientific, PA, USA) gezüchtet, bis der OD 0,4–0,6 erreichte, und dann durch 0 induziert.1 mM Isopropyl-β-d-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) für 4 h mit einer Breathe-Easy-Dichtungsmembran gegen Verdunstung und Kreuzkontamination (cat # 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Die Proteinproben wurden mit dem B-PER complete Reagenz (cat#89822, Thermo Scientific, MA, USA) gemäß Herstelleranweisung gewonnen und mittels SDS-PAGE analysiert.

Enzymcharakterisierung

His-Tag-Reinigung

Zur Enzymexpression wurde eine Übernachtkultur mit einer 1 inokuliert:50 % in frischem LB-Medium, das 1 mM IPTG und Antibiotikum enthält, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 18 ° C (bis zu 20 h) in einem Schüttelinkubator bei 200 U / min. Die induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4°C und 4700×g für 10 min geerntet. Anschließend wurde das Zellpellet einmal mit Milliporenwasser gewaschen und im B-PER Komplettreagenz resuspendiert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde 2 min bei 17.000×g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und als Rohextrakt bezeichnet. Zur His-Tag-Reinigung wurde der Rohextrakt wie vom Hersteller empfohlen mit HisPur Ni–NTA Superflow Agarose im Batch inkubiert. Anschließend wurde das Harz mit mindestens drei Volumina Waschpuffer, bestehend aus 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 0,1 mM EDTA, gewaschen. Die harzgebundenen Proteine wurden mit 300 µL Elutionspuffer enthaltend 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM Imidazol und 0,1 mM EDTA eluiert. Die eluierte Probe wurde anschließend entsalzt und über eine Amiconfiltersäule mit 10 kDa Molekulargewichtsabschaltung eingeengt. Abschließend wurde die Proteinprobe in 200 µL 20 mm Tris–HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert. Die Proteinkonzentration wurde durch den Bradford-Assay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Referenzprotein gemessen.

Thermal Shift Assay

Zur Messung der Proteinschmelztemperatur (Tm) wurde ein Thermofluor-Assay mit SYPRO Orange eingesetzt. Etwa 10-250 µg His-Tag gereinigtes Protein wurden mit 5× SYPRO Orange in einem 50 µL Endvolumen in einer 96-Well qPCR Platte gemischt. Die Platte wurde mit PCR-Kappen versiegelt, bevor der Test ausgeführt wurde. Die StepOne Real-Time PCR-Maschine (Applied Biosystems, CA, USA) wurde verwendet, um den Assay mit den folgenden Parametern auszuführen: ROX-Reporter, 1 ° C-Inkrement pro Zyklus, 1-min-Halt bei jedem Zyklus und Temperaturbereich von 20 bis 98 ° C. Die Daten wurden gesammelt, exportiert und verarbeitet, um Tm zu berechnen.

5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) -Assay

Die Reaktionsgeschwindigkeit für jede KATZE wurde durch einen DTNB-Assay in einer 384-well-Platte bestimmt. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 50 µL mit dem Reaktionspuffer bestehend aus 50 mm Tris-HCl (pH 8,0). Die Konzentrationen von Acetyl-CoA (CoALA Biosciences, TX, USA) und Alkoholen wurden wie in jedem Experiment angegeben variiert. Für die Reaktionen gegen Chloramphenicol bzw. Alkohole wurden Endenzymkonzentrationen von 0,05 µg/ml bzw. 10 µg/ml verwendet. Die Reaktionskinetik wurde durch Messung der Extinktion bei 412 nm jede Minute für 1 h bei 50 ° C in einem Mikroplattenleser (Synergy HTX Microplate Reader, BioTek) erfasst. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten aus einer Standardkurve von freiem Coenzym A (MP Biomedicals, OH, USA) unter der gleichen Bedingung berechnet. Es ist zu beachten, dass, da die für den Plattenleser empfohlene maximale Betriebstemperatur 50 ° C beträgt, der Hochdurchsatz-Enzymtest für CAT bei erhöhten Temperaturen nur zur Bestimmung der enzymkinetischen Parameter durchgeführt wurde.

Berechnung kinetischer Parameter für Reaktionsgeschwindigkeiten

Die Parameter des Michaelis-Menten-Geschwindigkeitsgesetzes (Gl. 1) wurden für jedes Enzym wie folgt berechnet. Zunächst wurde eine lineare Regression an Daten durchgeführt, die von einem Mikroplattenleser gesammelt wurden, um anfängliche Reaktionsraten, \(y_{i}\), bei verschiedenen anfänglichen Substratkonzentrationen, \(s_{i}\), zu identifizieren, wobei i = {1,2, …,n} die Anzahl der gesammelten Datenpunkte ist. Anschließend wurden diese anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten und die damit verbundenen anfänglichen Substratkonzentrationen für alle Replikate gleichzeitig an das Michaelis–Menten-Modell (Gl. 1) mit robuster nichtlinearer Regression (Gl. 2) mit einem Soft-L1-loss Estimator (Gl. 3) wie in der SciPy Numerical Computing Library v1.2.0 implementiert :

Das Problem der kleinsten Quadrate bestimmt die Parameter \(K_{\text{M}}\) und \(v_{\text{max} }\) durch Minimierung der Differenz zwischen den vom Modell vorhergesagten Reaktionsgeschwindigkeiten \(v_{i}\) und den gemessenen Reaktionsgeschwindigkeiten \(y_{i}\) (Gl. 2). Eine Glättungsfunktion \(\rho \left ( z \right)\) wird verwendet, um das kleinste quadratische Problem gegen Ausreißer resistent zu machen (Gl. 3). Aufgrund der unvoreingenommenen Resistenz gegen Ausreißer und der Vermeidung von Fehlern, die sich aus herkömmlichen Linearisierungsmethoden ergeben, liefert die robuste nichtlineare Regression die genaueste Parameterschätzung für das Michaelis-Menten–Modell .

Isobutylacetatproduktion in C. thermocellum

Cellobiose-Fermentation

Die Isobutylacetatproduktion aus Cellobiose in C. thermocellum-Stämmen wurde durch die zweistufige Biokonversionskonfiguration durchgeführt. Die Zellen wurden zuerst in MTC-Minimalmedium, das 5 g / l Cellobiose enthielt, in einem mit Gummi bedeckten Balchröhrchen kultiviert, bis der OD 0,8–1 erreichte.0. Die Zellen wurden 20 min bei Raumtemperatur abgekühlt und 20 min bei 4700×g und 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurden die Zellen im gleichen Volumen frischen MTC-Minimalmediums enthaltend 2 g/L Isobutanol in einer anaeroben Kammer resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in einem 2,0 ml Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem 200 µL Hexadecan-Overlay in 800 µL aufgeteilt. Die Zellen wurden 24 h bei 55 ° C inkubiert, gefolgt von einer gaschromatographischen Analyse in Verbindung mit einem Massenspektrometer (GC/MS), um die Menge an erzeugtem Isobutylacetat zu quantifizieren.

Cellulosefermentation

Für die Cellulosefermentation wurde modifiziertes MTC-Medium (C-MTC-Medium) verwendet. Anstelle von Cellobiose wurden 20 g/l Avicel PH-101 als alleinige Kohlenstoffquelle verwendet und 10 g/l MOPS zur Erhöhung der Pufferkapazität zugegeben. Der anfängliche pH-Wert wurde mit 5 M KOH auf 7,5 eingestellt und autoklaviert. In einer anaeroben Kammer wurden 0,8 ml Zellkultur über Nacht in 15,2 ml C-MTC-Medium (Impfverhältnis 1:20) mit 4 ml überlagertem Hexadecan inokuliert. Jedes Röhrchen enthielt einen kleinen Magnetrührstab, um Cellulose zu homogenisieren. Das mit Gummi bedeckte Balchröhrchen wurde in einem Wasserbad inkubiert, das mit einem auf 55 ° C eingestellten Temperaturregler und einem Magnetrührsystem verbunden war. Nach pH-Einstellung mit 70 µL 5 M KOH-Injektion wurden alle 12 h 800 µL Zellkultur und 200 µL Hexadecan-Schicht beprobt. Der pH-Wert der Kultur wurde während der Fermentation in einem Bereich von 6,4–7,8 gehalten.

Das Zellwachstum wurde durch Messung des Pelletproteins überwacht. Das Zell-Cellulose-Pellet aus 800 µL Probenvolumen wurde zweimal mit Milli-Q Wasser gewaschen und mit 200 µL Lysepuffer suspendiert (0.2 M NaOH, 1% SDS) gefolgt von einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Lösung mit 50 µL 0,8 M HCl neutralisiert und mit 550 µL Wasser verdünnt. Die Mischung wurde 3 min bei 17.000×g zentrifugiert. Die Proteinkonzentration aus dem Überstand wurde mit dem detergenzkompatiblen Bradford-Assay (Thermo Scientific, WA, USA) analysiert. Das restliche Pellet wurde eine Stunde lang in einem 98 ° C-Ofen gekocht, bevor die restliche Cellulose quantifiziert wurde.

Restcellulose wurde mit einigen Modifikationen nach der Phenol–Schwefelsäure-Methode quantifiziert. Die gekochte Probe wurde zweimal mit Milli-Q Wasser gewaschen und in 800 µL Wasser suspendiert, um ein äquivalentes Volumen wie das Original zu erhalten. Die Probe wurde durch Pipettieren und Vortexen für 10 s homogenisiert, und 20 µL der homogenisierten Probe wurden in ein neues 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder eine 96-Well-Platte überführt und über Nacht in einem 55 ° C-Ofen getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 200 µL 95%iger Schwefelsäure suspendiert und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem das Pellet vollständig gelöst war, wurden 20 µL 5%iges Phenol zugegeben und mit der Schwefelsäurelösung vermischt. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 µL der Probe auf eine neue 96-well Platte transferiert und die Extinktion bei 490 nm gemessen. Die Extinktion wurde nach der Standardkurve von Avicel PH-101, das nach dem gleichen Verfahren behandelt wurde, in Cellulosekonzentration umgerechnet.

Analysemethoden

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Extrazelluläre Metaboliten wurden mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-System (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µL Kulturproben wurden 3 min bei 17.000×g zentrifugiert, anschließend wurden die Überstände durch 0,2 µm Filter filtriert und mit 10 mN H2SO4 Laufmittel bei 0,6 ml/min auf einem Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) Säule bei 50 ° C. Brechungsindexdetektor (RID) und Ultraviolettdetektor (UVD) bei 220 nm wurden verwendet, um Konzentrationen von Zuckern, organischen Säuren und Alkoholen zu überwachen.

Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie (GC/MS)

Ester wurden mittels GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) ausgestattet mit einem MS (HP 5973, Agilent, CA, USA) gemessen. Für das GC-System wurde die Kapillarsäule Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) zur Trennung von Analyten verwendet, und Helium wurde als Träger mit einer Flussrate von 0,5 ml/ min verwendet. Das Ofentemperaturprogramm wurde wie folgt eingestellt: 50 ° C Anfangstemperatur, 1 ° C/ min Rampe bis 58 °C, 25 °C/ min Rampe bis 235 °C, 50 °C/ min Rampe bis 300 °C und 2-min Bake-Out bei 300 °C. 1 µL abgetastete Hexadecanschicht wurde im Splitless-Modus mit einer Injektortemperatur von 280 ° C in die Säule injiziert. Für das MS-System wurde ein ausgewählter Ionenmodus (SIM) verwendet, um Ester mit den folgenden Parametern nachzuweisen und zu quantifizieren: (i) Ethylacetat, m / z 45,00 und 61,00 von 4,2 bis 4,6 min Retentionszeit (RT), (ii) Isopropylacetat, m / z 45 und 102 von 4,7 bis 5,0 min RT, (iii) Propylacetat, m / z 59 und 73 von 5,2 bis 5,8 min RT, (iv) Ethylisobutyrat, m/z 73 und 116 von 6,1 bis 6,6 min RT, (v) Isobutylacetat, m/z 61 und 101 von 6,6 bis 7,6 min RT, (vi) Butylacetat, m/z 61 und 116 von 7,7 bis 9,2 min RT, (vii) Isobutylisobutyrat, m/z 89 und 129 von 10,1 bis 12.5 min RT, (viii) Benzylacetat, m/z 108 und 150 von 13,1 bis 13,8 min RT und (ix) 2-Phenethylacetat, m/z 104 und 121 von 13,8 bis 15,5 min RT. Als interne Standardanalyten wurden Isoamylalkohol und Isoamylacetat verwendet. Die Ester wurden durch RT identifiziert und durch die Peakflächen und Standardkurven quantifiziert. Standardkurven wurden mit in Hexadecan verdünnten reinen Estern in Konzentrationen von 0,01 g/l, 0,05 g/L, 0,1 g/l, 0,5 g/L und 1 g/l bestimmt.