Hintergrund: Chronische lymphatische Leukämie (CLL) hat einen klassischen Immunphänotyp, bestehend aus leichter Kettenrestriktion, CD5 +, CD19 +, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10- und CD79b-. Dies unterscheidet es von normalen B-Zellen und anderen lymphoproliferativen Erkrankungen (LPDs). Antikörper, die auf diese Antigene abzielen, sind in zwei 8-Farben-Durchflusszytometrie-Panels enthalten, die vom Euroflow-Konsortium für die Aufarbeitung von B-Zell-LPDs entwickelt wurden. Die Kombination dieser Antikörper in einem 10-Farben-Panel wäre kostengünstiger. Darüber hinaus können neue CLL-Therapien tiefe Remissionen induzieren, was zu einer zunehmenden Nachfrage nach Messung der minimalen Restkrankheit (MRD) führt, definiert als mit über 1 restleukämischen Zelle pro 10.000 Leukozyten (10-4). Der aktuelle internationale standardisierte Ansatz zur Messung von MRD, der von der Europäischen Forschungsinitiative für CLL (ERIC) entwickelt wurde, verwendet ein Panel von Antikörpern, die auf CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b und CD81 abzielen. Diese Antikörper-Fluorochrom-Kombinationen unterscheiden sich jedoch von denen, die von den Euroflow Diagnostic Panels verwendet werden. Daher müssten Laboratorien, die MRD-Tests durchführen möchten, Antikörper für 3 verschiedene Panels (2 Diagnose- und 1 MRD) kaufen. Wir haben das 8-Farben-Lymphozyten-Screening-Röhrchen (LST) von Euroflow um CD200 und CD23 erweitert, sodass CLL in einem 10-Farben-Röhrchen mit einem Gehalt von nur 0,01% nachgewiesen werden kann. Ziel dieser Studie war es, die potenziellen Kosteneinsparungen bei der Implementierung dieses neuen Panels zu ermitteln und festzustellen, ob es empfindlich genug ist, um MRD nachzuweisen.
Methoden: Wir berechneten die Anzahl der Proben, die mit unserem modifizierten 10-Farben-LST-Röhrchen (mLST1, lyophilisiert erhalten) von April 2018 bis März 2019 analysiert wurden, um eine LPD auszuschließen, und die Anzahl der Antikörper-Aliquots, die mit diesem Ansatz im Vergleich zur Standard-2-Röhrchen-Euroflow-Methode gespeichert wurden. Wir haben auch eine Version des oben genannten Panels (mLST2) mit flüssigen Antikörpern erstellt, um die Verallgemeinerbarkeit unserer Ergebnisse zu erhöhen, und CD38 durch CD43 ersetzt, um zu sehen, ob dies den MRD-Nachweis verbessert (siehe Panels unten). Für MRD-Tests verwendeten wir CLL-Proben von 24 verschiedenen Patienten, um 60 MRD-Proben in verschiedenen Konzentrationen von Leukämiezellen zu produzieren. Die Proben wurden hergestellt, indem CLL-Zellen in Suspensionen normaler Leukozyten in ungefähren Konzentrationen von 0,1%, 0,01% und 0,001% versetzt wurden. Jede Probe wurde aliquotiert und mit den drei Platten gefärbt: ERIC, mLST1 und mLST2. Die Daten wurden mit einem BD FACSCanto II oder einem BD FACSAria Fusion erfasst und mit der BD FACSDiva Software analysiert. CLL-Zellen wurden basierend auf der differentiellen Expression von Schlüsselmarkern identifiziert und die MRD wurde als Anzahl der CLL-Zellen / Gesamtleukozyten berechnet. Die MRD-Positivität wurde als ≥ 0,01% definiert. Die Übereinstimmung zwischen den Panels wurde mit der Bland-Altman-Plot-Methode bewertet. Wir haben auch die prozentuale Übereinstimmung zwischen den Panels bei der Identifizierung der MRD-Positivität berechnet.
Ergebnisse: In 1 Jahr wurde mLST1 an 474 Proben durchgeführt, von denen 220 einen LPD und 123 (56%) einen klassischen CLL-Phänotyp aufwiesen, sodass keine weiteren Tests erforderlich waren. Dies führte zu einer Nettoersparnis von 476 Antikörper-Aliquots. Für die MRD-Beurteilung war die differentielle Expression von CD5 und CD20 der wichtigste Faktor bei der Unterscheidung von CLL von normalen B-Zellen unter Verwendung von mLST1 und mLST2. Wir identifizierten einen CLL-Fall mit einem atypischen Immunphänotyp (dim CD5, bright CD20), der sich unter Verwendung eines mLST-Panels als schwierig erwies. Die MRD-Ergebnisse, die mit den mLST-Panels und dem ERIC-Panel erzielt wurden, stimmten überein. Für Werte oberhalb der Quantifizierungsgrenze betrug die 95% ige Übereinstimmungsgrenze ± 0,3369 log für den ERIC vs mLST1-Vergleich und ± 0,3485 log für den ERIC vs mLST2-Vergleich. Somit Variabilität der MRD-Spiegel zwischen den Panels war weniger als 2-fach die Mehrheit der Zeit, die wir als klinisch akzeptabel betrachteten, da MRD auf einer exponentiellen Skala gemessen wird. Das ERIC-Panel und das mLST1 waren sich bei der Unterscheidung von MRD-positiven und MRD-negativen Proben zu 88,3% einig. Die Zustimmung zwischen dem ERIC-Panel und dem mLST2 betrug 93,3%.
Schlussfolgerungen: Die Verwendung eines modifizierten 10-Farben-LST-Panels sowohl für die Diagnose als auch für die MRD-Messung von CLL ist möglich. Die Vorteile sind eine erhöhte Vertrautheit mit den Antikörpern und potenzielle Kosteneinsparungen, die MRD für mehr Zytometrielabors zugänglich machen. Atypische CLL-Fälle ohne die übliche CD5-Positivität und dim CD20 sind mit einem LST-Panel sehr schwer zu erkennen. In diesen Fällen ist das ERIC-Panel deutlich überlegen, da CD22, CD79b, CD81 und CD43 immer noch eine Trennung zwischen den malignen und normalen Lymphozyten ermöglichen können.
Bazinet:BD Biosciences: Sonstiges: Stellte eine signifikante Menge der in diesem Projekt verwendeten Antikörper kostenlos zur Verfügung.. Wever:Teva Deutschland Innovation: Beschäftigung. Gimmig:BD Biosciences: Beschäftigung. Johnson: Lundbeck: Anstellung, Honorar, Mitgliedschaft im Verwaltungsrat oder in Beratungsausschüssen eines Unternehmens, Andere: Reisegebühren, Geschenke und andere, Forschungsfinanzierung; Merck: Beratung, Honorar; Roche: Beratung, Beschäftigung, Honorar, Mitgliedschaft im Verwaltungsrat oder in Beratungsausschüssen eines Unternehmens, Andere: Reisegebühren, Geschenke und andere, Forschungsfinanzierung; Abbvie: Beratung, Beschäftigung, Honorar, Mitgliedschaft im Verwaltungsrat oder in Beratungsausschüssen eines Unternehmens, Forschungsfinanzierung; BD Biosciences: Andere: Stellte einen erheblichen Teil der in diesem Projekt verwendeten Antikörper kostenlos zur Verfügung.; BMS: Beratung, Honorar; Seattle Genetics: Honorar.