Ein Überblick über die Chemogenetik

Aufgrund bedeutender Entwicklungen in den neurowissenschaftlichen Techniken sind Forscher nun in der Lage, neuronale Systeme in bewussten Tieren durch aufkommende Methoden, die als Chemogenetik und Optogenetik bezeichnet werden, selektiv zu nutzen. Diese Methoden helfen bei der Erforschung der neuronalen Schaltkreise, die komplizierten Verhaltensweisen bei Krankheit und Gesundheit zugrunde liegen.

Chemogenetik und Optogenetik zeigen Ähnlichkeiten in ihrem Ansatz, die neuronale Aktivität zu modifizieren; zum Beispiel müssen bei beiden Techniken Ionenkanäle oder konstruierte Rezeptoren in bestimmte Hirnregionen eingeführt werden, durch Plasmidexpression oder virale Vektorsysteme. In der Optogenetik müssen bakterielle lichtempfindliche Ionenkanäle exprimiert werden und Faseroptiken müssen auch nachträglich verwendet werden, um neuronale Aktivität in vivo oder in vitro zu hemmen oder zu aktivieren (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

Obwohl diese Methode eine überlegene zeitliche Kontrolle der neuronalen Aktivität in vivo bietet, ist bekannt, dass sie inhärent invasiv ist und eine zerebrale Implantation von Faseroptik erfordert. Die Chemogenetik hingegen benötigt kein chronisches Implantat, behält aber das Potenzial, die neuronale Aktivität zu kontrollieren. Dies geschieht durch Verabreichung von Liganden, selektiv für Ionenkanäle oder konstruierte Rezeptoren, die ansonsten inert sind (Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). Tabelle 1 zeigt die Hauptmerkmale der Chemogenetik und Optogenetik.

Tabelle 1. Chemogenetik vs Optogenetik

Geschichte und Entwicklung

RASSLs

Chemogenetik bezieht sich auf die Verwendung von Ionenkanälen oder gentechnisch veränderten Rezeptoren und den selektiven Liganden, die diese Rezeptoren aktivieren, um die Manipulation der neuronalen Aktivität zu erleichtern. In diesem Zusammenhang haben G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Entwicklung der Chemogenetik vorangetrieben, und das Originalpapier, das GPCRs definiert, die nur auf synthetische Liganden reagieren, wurde 1998 veröffentlicht.

Diese Rezeptoren — bekannt als Rezeptoren, die ausschließlich durch einen synthetischen Liganden (RASSLs) aktiviert werden — wurden in vivo effektiv angewendet, um beispielsweise die Herzaktivität fernzusteuern. Trotz dieser Tatsache wurde die Anwendung von RASSLs in den Neurowissenschaften durch die endogene Aktivität von Rezeptoren in Abwesenheit ihres jeweiligen Liganden und die pharmakologische Aktivität von Liganden in vivo begrenzt (Coward et al., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

In den letzten Jahren haben sich Designer-Rezeptoren entwickelt, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDS) aktiviert werden. Mutierte humane Muskarinrezeptoren, die nur durch inerte Liganden stimuliert wurden, waren die ersten DREADDS, die entwickelt wurden (Armbruster et al., 2007). Durch mehrere Runden Mutagenese und Screening gegen den biologisch inerten Liganden Clozapin-N-Oxid (CNO) wurden Muskarinrezeptoren identifiziert, die an den intrazellulären Gaq-Signalweg gekoppelt sind.

An diesen Signalweg gekoppelte Rezeptoren sind in der Lage, neuronale Aktivität als Reaktion auf CNO zu aktivieren. Niedrige Konzentrationen von CNO aktivieren alle drei Gaq-TDS – hM1Dq, hM3Dq und hM5Dq (Roth, 2016). Darüber hinaus zeigte die gleiche Studie, dass hM4Di und hM2Di die neuronale Aktivität über ihre Kopplung an intrazelluläre Gai-Signalwege hemmen können. Diese inhibitorischen TDS sprechen auch auf CNO an (Armbruster et al., 2007; Abbildung 1).

Abbildung 1. Wirkmechanismus von DREADD-Liganden. Die Bindung von DREADD-Liganden an Gaq-DREADDs provoziert ein neuronales Feuern, während die Bindung an Gai-DREADDs zu einer Hemmung der neuronalen Aktivität führt. Clozapin-N-Oxid-Dihydrochlorid und DREADD-Agonist 21 sind nicht selektive muskarinische DREADD-Agonisten und können daher je nach exprimiertem spezifischem Rezeptor die neuronale Aktivität aktivieren oder hemmen. Salvinorin B ist selektiv für den KORD-Rezeptor, der an die GaI-Signalisierung gekoppelt ist, wodurch die Bindung zu einer Hemmung der neuronalen Aktivität führt. Bildnachweis: Tocris Bioscience

Die Bindung zwischen Gaq-TDS und CNO bewirkt die Stimulation der Phospholipase C (PLC), die die Umwandlung von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in 1,2-Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-Trisphosphat (IP3) katalysiert. Sowohl DAG als auch IP3 besitzen Second Messenger-Funktionen: Letzterer bindet an seine Rezeptoren, um die Freisetzung von Ca2 + aus intrazellulären Speichern auszulösen, während ersteres verschiedene Formen der Proteinkinase C (PKC) stimuliert.

Die Bindung zwischen Gai-TDS und CNO bewirkt die Hemmung der Adenylylcyclase (AC), was zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln führt. Da sowohl EPAC als auch Proteinkinase A (PKA) durch cAMP aktiviert werden, hemmt die Wirkung des CNO an Gai-2ds die EPAC- und PKA-Downstream-Signalisierung (siehe Abbildung 1).

CNO ist ein Metabolit von Clozapin, Studien zeigen, dass dies eine bidirektionale Umwandlung ist und dass CNO einen umgekehrten Metabolismus zu Clozapin durchlaufen kann. Wenn CNO in den Konzentrationen verabreicht wird, die zur Aktivierung von TDS erforderlich sind, kann Clozapin anschließend endogene Rezeptoren aktivieren (Gomez et al., 2017). Clozapin — ein atypisches Antipsychotikum – wirkt auf eine Reihe von Zielen und führt zu vielen verschiedenen Verhaltenseffekten.

Ratten, Mäuse, Menschen, nichtmenschliche Primaten und Meerschweinchen zeigen alle den reversiblen Metabolismus von CNO zu Clozapin (Gomez et al., 2017; Manvich et al., 2018). Als Ergebnis des potenziellen umgekehrten Metabolismus von CNO haben sich Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien entwickelt, um stabile, alternative Liganden zu entwickeln.

Der potente DREADD—Ligand — DREADD-Agonist 21 – wurde zunächst auf Aktivität gegen hM3Dq analysiert. Das zugelassene Medikament Perlapin wurde in derselben Studie als starker hM3Dq-Agonist identifiziert. In Japan wurde dieses Medikament als Beruhigungsmittel und Hypnotikum zugelassen (Chen et al., 2015). Sowohl Perlapin als auch HMD-Agonist 21 haben sich anschließend als potente Agonisten von hM4Di, hM3Dq und hM1Dq mit geringer bis keiner Off-Target-Aktivität erwiesen. Darüber hinaus wurde der HMD-Agonist 21 in vivo getestet, in dem gezeigt wurde, dass er hM3Dq-exprimierende Neuronen aktiviert und die Aktivität von hM4Di-exprimierenden Neuronen hemmt (Thompson et al., 2018).

Im Anschluss an die Entwicklung von muskarinischen DREADDs wurde aus dem κ-Opioid-Rezeptor (KORD) ein inhibitorischer DREADD erzeugt. Die Aktivierung dieses inhibitorischen DREADD wird durch Bindung des Liganden Salvinorin B erreicht, was zur Hemmung der neuronalen Aktivität durch Gai-Signalisierung führt. Um eine bidirektionale Kontrolle der neuronalen Aktivität zu ermöglichen, kann KORD neben der Aktivierung von DREADDs wie hM3Dq verwendet werden (Vardy et al., 2015).

Einige gemeinsame Merkmale aller DREADDs machen sie für die Anwendung in neurowissenschaftlichen Experimenten geeignet. Erstens zeigen DREADDs keine Reaktion auf endogene Liganden aufgrund genetischer Mutationen innerhalb ihrer Ligandenbindungsstellen, die die Bindung eliminieren, was bedeutet, dass jede Aktivität des DREADD nur aufgrund der Anwendungen des spezifischen DREADD-Liganden erfolgt. Zweitens hat die In-vitro- oder In-vivo-Expression von DREADDs vor der Zugabe des DREADD-Liganden keinen Einfluss auf das Ausgangsverhalten, die neuronale Funktion oder die zelluläre Aktivität (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs / PSEMs

Während RDS und RASSLs auf GPCRs basieren, wurden modifizierte Ionenkanäle, die als Pharmakologisch selektive Aktuatormodule (PSAMs) bezeichnet werden, auch zur Modulation der Aktivität von Neuronen verwendet. PSAMs basieren auf Studien, die darauf hindeuten, dass es möglich ist, die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne des α7-Nikotin-ACh-Rezeptors (nAChR) auf die Ionenporendomäne anderer ligandengesteuerter Ionenkanäle zu transplantieren. Wenn die α7-nAChR-Ligandenbindungsdomäne mit der Ionenkanaldomäne des 5-HT3-Rezeptors gespleißt wird, entsteht ein Ionenkanal mit α7-nAChR-Pharmakologie, jedoch mit 5-HT3-Kationenleitungseigenschaften (Eiselé et al., 1993).

Ebenso erzeugt das Spleißen der α7 nAChR-Ligandenbindungsdomäne mit der Ionenporendomäne des chloridselektiven Glycinrezeptors (GlyR) einen ACh-ansprechenden Chloridkanal (Grutter et al., 2005). Eine selektive Mutation der α7-nAChR-Ligandenbindungsdomäne erzeugt folglich PSAM-Ionenkanäle, die keine ACh-Bindung zeigen, aber dennoch selektiv an Verbindungen gebunden sind, die als pharmakologisch selektive Effektormoleküle (PSEMs) bezeichnet werden.

PSAMs oder chimäre Ionenkanäle, die eine Regulierung der Anion- oder Kationenleitfähigkeit ermöglichen, wurden durch die Kombination der mutierten α7 nAChR-Ligandenbindungsdomäne (die zwei oder eine Mutation aufweist) mit der Ionenporendomäne mehrerer variierter ligandengesteuerter Ionenkanäle hergestellt. Solche PSAM-Chimären werden aufgrund ihrer Mutationen sowie der verknüpften Ionenporendomäne PSAML141F, Y115F—GlyR, PSAML141F-GlyR, PSAML141F, Y115F-GABAC und PSAML141F, Y115F-5-HT3 benannt. Die Aktivierung der neuronalen Aktivität wird durch 5-HT3-haltige Chimären ermöglicht, während GABAC- und GlyR-haltige Chimären inhibitorisch wirken (siehe Abbildung 2) (Magnus et al., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Abbildung 2. Wirkungsmechanismus von PSEMs. Aktivierende PSAMs bestehen aus einer mutierten α7-nAChR-Ligandenbindungsdomäne, die mit der Ionenporendomäne eines kationenselektiven Kanals wie 5-HT3 gespleißt ist. Die Bindung von PSEMs an aktivierende PSAMs führt zu einem Zustrom von Kationen und einer Aktivierung der neuronalen Aktivität. Inhibitorische PSAMs bestehen aus einer mutierten α7-nAChR-Ligandenbindungsdomäne, die mit der Ionenporendomäne eines anionenselektiven Kanals wie GlyR gespleißt ist. Die Bindung von PSEMs an inhibitorische PSAMs führt zu einem Zustrom von Anionen und einer Hemmung der neuronalen Aktivität. Bildnachweis: Tocris Bioscience

Scientific reviews for further reading

• Campbell & Marchant (2018) Die Verwendung der Chemogenetik in den Verhaltensneurowissenschaften: Rezeptorvarianten, Targeting-Ansätze und Vorbehalte. In: Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) DREADDs für Neurowissenschaftler. Nervenzelle. 89, 683.
• Magnus et al. (2011) Chemische und gentechnische Untersuchung selektiver Ligand-Ionenkanal-Wechselwirkungen. Wissenschaft. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Chemogenetische Werkzeuge zur Abfrage von Gehirnfunktionen. In: Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster et al. (2007) Entwicklung des Schlosses zur Anpassung des Schlüssels, um eine Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu erzeugen, die durch einen inerten Liganden potent aktiviert werden. In: Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5163.
2. Atasoy et al. (2012): Die Entwicklung eines neuronalen Schaltkreises für den Hunger. Natur. 488, 172.
3. Boyden et al. (2005) Genetisch gezielte optische Kontrolle neuronaler Aktivität im Millisekundenbereich. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Design von G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Medikamenten der nächsten Generation: Verknüpfung neuartiger Pharmakologie und In-vivo-Tiermodellen. In: Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley et al. (2018) Die Verwendung chemogenetischer Ansätze zur Untersuchung der physiologischen Rolle muskarinischer Acetylcholinrezeptoren im Zentralnervensystem. In: Neuropharmacology. 136, 421.
6. Chen et al. (2015) Die ersten Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien für Designer-Rezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert werden. In: ACS Chem Neuroscience. 6, 476.
7. Coward et al. (1998): Eine Einführung in die Gi-Kopplung mit einem Gi-gekoppelten Rezeptor. In: Proc Natl Acad Sci USA. 95, 352.
8. Eiselé et al. (1993) Chimaeric nicotinisch-serotonerger Rezeptor kombiniert Ligandenbindung und Kanalspezifitäten. Natur. 366, 479.
9. Ge et al. (2017) Glutamaterge Projektionen vom entorhinalen Kortex zum dorsalen Gyrus dentatus vermittelten eine kontextinduzierte Wiederherstellung der Heroinsucht. In: Neuropsychopharmacology. 42, 1860.
10. Gomez et al. (2017) Chemogenetik ergab: DREADDYS und Aktivierung über konvertiertes Clozapin. Wissenschaft. 357, 503.
11. Grutter et al. (2005) Molekulare Optimierung des schnellen Gating in pentameren ligandengesteuerten Ionenkanälen. In: Proc Natl Acad Sci USA. 102, 18207.
12. Jiang et al. (2018) Cholinerge Neuronen im medialen Septum behalten angstähnliche Verhaltensweisen bei, die durch chronische entzündliche Schmerzen induziert werden. In: Neuroscience Lett. 671, 7.
13. Manvich et al. (2018) Der CMD-Agonist Clozapin-N-Oxid (CNO) wird rückwärts zu Clozapin metabolisiert und erzeugt Clozapin-ähnliche interozeptive Stimuluseffekte bei Ratten und Mäusen. Sci Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli et al. (2017) Histaminmodulation der Basalganglienschaltung bei der Entwicklung pathologischer Prozesse. In: Proc Natl Acad Sci USA. 114, 6599.
15. Sasaki et al. (2011) Pharmakogenetische Modulation von Orexin-Neuronen verändert Schlaf- / Wachzustände bei Mäusen. Plus Eins. 6, e20360.
16. Schwartz et al. (2017) Cortico-Accumbens-Regulation des Annäherungsvermeidungsverhaltens wird durch Erfahrung und chronischen Schmerz modifiziert. Zelle Rep. 19, 1522.
17. Thompson et al. (2018) DREADD agonist 21 (C21) ist ein wirksamer Agonist für muskarinische DREADDs in vitro und in vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub vor dem Druck.
18. Vardy et al. (2016) Ein neuer DREADD erleichtert die Multiplex-chemogenetische Befragung von Verhalten. Nervenzelle. 86, 936.
19. Varela et al. (2016) Die Rolle des Hippocampus beim Gedächtnisrückruf mit Hilfe von DREADDs. Plus Eins. 11, e0154374.
20. Zhang et al. (2007) Multimodale schnelle optische Abfrage neuronaler Schaltkreise. Natur. 446, 633.

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