Die Rolle von Akkordin / Bmp-Signalen in der pharyngealen Entwicklung von Säugetieren und beim DiGeorge-Syndrom | Entwicklung

ERGEBNISSE

Gastrulationsdefekte bei Chrd- / – Mäusen

Das von Chrd sekretierte Bmp-bindende Protein wird im Mausknoten und seinen Derivaten, Notochord und pharyngealem Endoderm, exprimiert (Abb. 1A-F). Das Chrd-Protein enthält vier cysteinreiche (CR) Domänen, die alle in der Lage sind, Bmps zu binden.CR1 und CR3 zeigen die höchste Affinität zu Bmp4 und können Bmp-Signale durch mRNA-Injektion in Xenopus-Embryonen antagonisieren (Larrain et al., 2000). Um ein Nullallel von Chrd zu erzeugen, haben wir ein Targeting-Konstrukt mit Translationsstoppcodons in den drei möglichen Leserahmen innerhalb der Signalpeptidregion vorbereitet. Auf die Stop-Codons folgte ein Frameshift und die Einführung von IRES-lacZ- und PGK-neo-Kassetten nach CR1, die das Chrd-Gen weiter zerstörten (Abb.1G). Transkripte dieses Chrdtm1DR-Allels (im Folgenden als Chrd-bezeichnet) waren inChrd-/-Embryonen im Knotenstadium nicht nachweisbar (Abb. 1J, Pfeilspitze).

Heterozygote Chrd-Mäuse waren lebensfähig und fruchtbar und wurden gepaart, um Chrd-/- Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien zu erzeugen stages.At tag E8.5 beobachteten wir das Vorhandensein von Resorptionsknoten in der Gebärmutter vonschwangere Frauen und eine kleine Verringerung der erwarteten Anzahl VONCHRD- / – Embryonen (50 erholt, 57 erwartet). Viergenotypisierte homozygote mutierte Embryonen zeigten eine deutliche Verringerung der Größe der embryonalen Region, begleitet von einer Vergrößerung der Allantois in Bezug auf den Rest des Embryos (Abb.2A, A‘). In histologischen Schnitten eine beträchtliche Hypoplasie der Nervenplatte (Abb.2B, B‘), Abwesenheit von Somiten und Notochord (Fig. 2C, C‘) und eine Fülle von extraembryonalen mesodermalen Zellen im Allantois (Abb. 2D,D‘) beobachtet. Die übrigen Mutanten (46) waren morphologisch nicht von ihren heterozygoten und Wildtyp-Wurfgeschwistern zu unterscheiden. Der Phänotyp der fourabnormalen Mutanten war ähnlich, aber weniger ausgeprägt als die Ventralisierung des Mesoderms, die bei doppelt homozygoten Chrd beobachtet wurde;Nogmutanten (Bachiller et al.,2000), bei denen zusätzlich auch anteriore Trunkationen der Neuralplatte vorhanden waren.

Bei Zebrafischen und Xenopus führt die Inaktivierung von Chrd zu einer Ausdehnung des ventralen Mesoderms und einer Reduktion des dorsalen Mesoderms und der Neuralplatte (Schulte-Merker et al.,1997). Bei Säugetieren bildet sich das Mesoderm während der Gastrulation durch die Expression von Epiblastenzellen durch den primitiven Streifen. Zellen, die am hinteren Ende des primitiven Streifens austreten, bewegen sich in die extraembryonale Region, wo sie zu einer mesodermalen Linie (Allantois, Amnion und Blutinseln des Dottersacks) führen, die dem ventralen Mesoderm Vonxenopus entspricht. Im Gegensatz dazu verbleiben Zellen, die sich in vordereren Regionen des Streifens befinden, im eigentlichen Embryo und produzieren das paraxiale, intermediäre und laterale Plattenmesoderm des zukünftigen Rumpfes. Der frühe Phänotyp von CHRD-/- Mutanten, bei dem das Allantois am Ende des embryonalen Mesoderms expandiertwird, steht im Einklang mit einer frühen Ventralisierung des Mausembryos. Dieser Phänotyp muss zum Tod der betroffenen Tiere führen, da keine homozygote Mutante mit abnormalem Allantois in späteren Stadien aus Dissektionen gewonnen wurde. Analyse dieses Phänotyps mit molekularen Markernwurde nicht durchgeführt, weil so wenige abnormale Embryonen erhalten wurden.

Perinatale Letalität

Nur 49% (95 von 194) der erwarteten Chrd-/-Tiere wurden bei der Geburt wiedergefunden, alle zeigten den gleichen vollständig penetranten Phänotyp. Von diesen war die Mehrheit tot geboren, aber einige versuchten erfolglos, ihre Lungen aufzublasen. Äußerlich waren homozygote mutierte Neugeborene etwas kleiner als ihre Wildtyp-Wurfgeschwister und zeigten Zyanose, Mikrozephalie und Reduktion des äußeren Ohrs, das abnormal nahe am Auge eingestellt war (Abb. 3A).Histologische Untersuchung (Abb.3B‘-C‘) zeigte das Fehlen von Thymus (t, ein Derivat des dritten Pharynxbeutels) und sekundärem Gaumen (p) sowie Hypoplasie des Innenohrs (ie) bei den Mutanten. Der Vorderlappen und die Pars intermedia der Eitrigdrüse (pi), die beide aus dem dorsalen oralen Ektoderm unmittelbar neben dem Kopfrand des vorderen Endoderms stammen, waren normal(Abb. 3C, C‘). Dies definierte die rostrale Grenze des Phänotyps im Oropharynx, wobei Fehlbildungen auf Derivate des Chrd-exprimierenden Endoderms beschränkt waren. Die Schilddrüse, die sich im ventralen pharyngealen Endoderm am Foramen caecum bildet, differenzierte zwar, war aber hypoplastisch und unregelmäßig geformt (th, Abb. 3C‘). Die Nebenschilddrüsen, Derivate der Pharynxbeutel 3 und 4, fehlten(Daten nicht gezeigt), eine Beobachtung, die mit der neonatalen Hypokalzämie bei Personen mit DiGeorge-Syndrom übereinstimmt(DiGeorge, 1968). Wir schließen daraus, dass der Phänotyp von Chrd- / – totgeborenen Mäusen die meisten der bei solchen Individuen beschriebenen Merkmale rekapituliert.

Skelettdefekte

Bei Skelettpräparaten von Chrd- / neugeborenen Tieren waren die appendikulären und lumbalen Knochen normal, aber die Schädelbasis und das vordere axiale Skelett wiesen mehrere Defekte auf. Zu den Veränderungen im Schläfenbein gehörten das Fehlen der Squama temporalis (st) und die Verkürzung des Jochbogens (Abb.4A, A‘). Wir beobachteten auch eine beträchtliche Hypoplasie des Zungenbeins und der Schilddrüsen- und Kehlkopfknorpel(Abb. 4B‘), und anabnormalerweise kleiner Kiefer (Fig.4C‘). In der Schädelbasis erschien das Alisphenoid (as)normal, aber in der Mittellinie waren die Basioccipital- (bo) und Basisphenoid- (bs) Knochen verschmolzen, und das Presphenoid (ps) war hypoplastisch(Abb. 4D, D‘). Konsistentmit den histologischen Befunden konnten sich die Gaumenregale nicht medial ausdehnen, um den sekundären Gaumen zu bilden. Im Ohr der Trommelfellring und die Ohrkapselwurden reduziert und missgebildet (Abb.4D‘). Skelettfehlbildungen wurden auch im Gebärmutterhals beobachtetund thorakale Regionen der Wirbelsäule. Wirbelkörper (vb) waren bei Chrd-/- Neugeborenen kleiner(Abb. 4E‘), mit delayedossification und gelegentlichem Verlust anderer Elemente der Wirbel wie spinöse Prozesse, neurale Bögen und der vordere Bogen des Atlas(Abb. 4E‘ Und Fig. 5A).

Die Skelettdefekte von Chrd-Mutanten waren bereits bei E14.5 in Kartilagenkondensationen nachweisbar (Abb.5A, A‘). Die Knorpel des Basiokzipitals und des Basisphenoids waren verschmolzen, und das Ossifikationszentrum des Basiokzipitals war schmaler und in das Basisphenoid hineingedehnt (Abb.5B, B‘). Das anteriore Notochord, das in der Mittellinie des Wildtyp-Basioccipitals vorhanden war, fehlte bei Chrd-Mutanten(Abb. 5B, B‘). Das Fehlen des vorderen Notochords wurde durch histologische Untersuchung der cervikalen Region bei E14.5 bestätigt (Abb.5F‘).

Die von der Chrd-Mutation betroffenen Knochen haben sehr unterschiedliche Ursprünge. Das Basioccipital ist rein somitischen Ursprungs; Teile des Basisphenoids entstehen aus der endochondralen Ossifikation des cephalic Mesenchyms; Das Palatin stammt aus der intramembranösen Ossifikation des Neural Crest-Derivedmesenchyms; die otischen Kapseln unterscheiden sich von einer Mischung aus paraxialen Mesodermand neural crest Zellen; und das Zungenbein ist streng neural Crest abgeleitet (Le Douarin und Kalcheim, 1999). Inmitten einer solchen Vielfalt von Abstammungslinien scheint das vereinheitlichende Prinzip des Phänotyps die Lage missgebildeter Strukturen in der Nähe des Chrd-exprimierenden axialen Mesendoderms zu sein (Abb. 1E). Diese Interpretation steht im Einklang mit der beobachteten vorzeitigen Degeneration des Anteriornotochords bei Chrd- / – Tieren und mit der Anforderung vonprechordalplatte und Mesendoderm abgeleitete Signale für die Entwicklung des Skeletts des Kopfes (Belo et al.,1998; Couly et al.,2002; David et al.,2002).

DiGeorge-ähnliche kardiovaskuläre Defekte

Die bei der Geburt beobachtete Zyanose kann ein Zeichen für eine Herzfunktionsstörung sein. Um dies weiter zu untersuchen, wurden Dissektionen in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung durchgeführt. An der E14.5, die Herzen VONCHRD-/- Tiere zeigten ein einzelnes Gefäß, anstelle von thenormal zwei, im Herzausflusstrakt(Abb. 5D,D‘,E,E‘).Dieser Zustand ist beim Menschen als persistierender Truncus arteriosus bekannt und ist eine unwichtige Fehlbildung bei Personen mit DiGeorge-Syndrom. Die fehlende Trennung zwischen der aufsteigenden Aorta und dem Lungenstamm kann die Arbeitsbelastung des rechten Ventrikels erhöhen, was zu seiner Hypertrophie führt, sowie die Vasodilatation, Ödeme und Blutungen, die bei E14.5-Embryonen beobachtet wurden (Abb. 5C‘). Als inDiGeorge-Syndrom erstreckten sich Defekte im Herz-Kreislauf-System über den Ausflusstrakt hinaus und umfassten die großen Gefäße, die aus den Rachenarcharterien stammen (Abb. 6). Bei neugeborenen CRD-Mutanten schlossen sich die Arteria carotis communis direkt dem Truncusarteriosus an, was zum Fehlen der Arteria brachiocephalica und eines Teils des Aortenbogens führte (Abb. 6A-C).Die Lungenarterien stammten direkt vom proximalen Truncusarteriosus, was zum Fehlen eines gemeinsamen Lungenstamms führte(Abb. 6A-C). Darüber hinaus wurden Lateralitätsdefekte mit einer abnormalen Rechtsdrehung der Aortain 40% der Mutanten beobachtet (Abb. 6, vergleiche 6E mit 6F). Wenn Dissektionen von hinten durchgeführt wurden, konnte festgestellt werden, dass die rechten oder linken A. subclavia je nach Lateralität der absteigenden Aorta eine abnormale retroösophageale Position einnahmen (Abb. 6D-F). Ähnliche Defekte wurden bei Hühnerembryonen mit Neuralleistenzellablationen beschrieben (Kirby et al., 1983) und Inmice-tragende Deletionen in der DiGeorge congenic Region (Lindsay et al., 1999;Merscher et al., 2001) Mutationen in Tbx1 und Fgf8 (Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002;Jerome und Papaioannou, 2001;Lindsay et al., 2001;Vitelli et al., 2002b).

Bei der Geburt wurden nur 49% der erwarteten homozygoten Chrd-Mutanten wiedergefunden. 48 der erwarteten 56 (86%) Chrd- / -Embryonen lebten jedoch noch in Würfen, die bei E14.5 seziert wurden, eine Häufigkeit, die sich nicht signifikant von der bei E8.5 (88%) beobachteten Häufigkeit unterschied. Der starke Anstieg der Letalität nach E14.5 fällt mit der vollständigen Manifestation des kardiovaskulären Phänotyps zusammen und legt nahe, dass eine Durchblutungsstörung eine wichtige Ursache für die Letalität von Chrd- / – Embryonen während der späten Schwangerschaft ist.

Pharyngeale Anomalien

Um den Beginn des pharyngealen Phänotyps zu bestimmen, sezierten wir schwangere Frauen aus heterozygoten Paarungen zu verschiedenen Zeiten post coitum. Bei E9.0, als Stadium, in dem Chrd im Rachenendoderm exprimiert wird, konnten Chrd-/- Embryonen durch eine Vertiefung im Halsbereich identifiziert werden (Abb.7A‘, Pfeil). Die otischen Vesikel der Mutanten wurden reduziertauf die Hälfte ihres normalen Durchmessers (Abb.7A‘, Pfeilspitzen) und der zweite (Zungenbein-)Rachenbogen fehlten. Pharynxbögen drei bis sechs nie in mutierten Embryonen gebildet(Abb. 7B‘ und Daten nicht gezeigt). Die fehlenden oder missgebildeten Strukturen sind entweder direkte Vorläufer oder spielen eine induktive Rolle bei der Entwicklung vieler der Organe, die bei der Geburt in Chrd- / – Mäusen defekt sind. Da die meisten der bei neugeborenen Mutanten beobachteten phänotypischen Anomalien ihren embryologischen Ursprung im pharyngealen Endoderm und in der peripharyngealen Region haben, analysierten wir die Expression einer Reihe von Genen, von denen bekannt ist, dass sie wichtige Entwicklungsrollen bei menschlichen Erbkrankheiten spielen.

Wir untersuchten zunächst die Expression von Pax3, einem Transkriptionsfaktor, der in Neuralleiste, dorsalem Neuralrohr und Somiten exprimiert wird (Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 ist bei Neuralkastenerkrankungen mutiert, die als Waardenburg-Syndrom Typ 1 und 3 bezeichnet werden (Strachan und Read, 1994) und ist zusammen mit SOX10 ein Co-Regulator des Mikrophthalmie-orMITF-Gens (Bondurand et al.,2000), der im Waardenburg-Syndromtyp 2a beim Menschen mutierte Transkriptionsfaktor (Tassabehji et al.,1994). Mutation von Pax3 in der Splotch (Sp2H) Maus führt zu Herzfehlern, einschließlichpersistent Truncus arteriosus, sowie Fehlbildungen des Thymus, Thyreoidand Nebenschilddrüsen (Conway et al.,1997). Wir fanden heraus, dass die Pax3-Expression bei E7.5 (nicht gezeigt) nicht zwischen Mutanten- und Wildtyp-Embryonen zu unterscheiden war, aber bei E10.5 wurden signifikante Unterschiede beobachtet. Die Pax3-positivenneuralen Kammzellen, die durch die Pharynxbögen 3, 4 und 6 wandern (Abb. 7C, Pfeilspitzen) waren bei Chrd-/- Tieren kaum nachweisbar (Abb. 7C‘). Diese Neuralcrest-Zellen bevölkern das Septum, das die Aorta von der Lungenarterie trennt, im Abflusstrakt oder in der konotrunkalen Region des Herzens(Li et al., 2000). Das Versagen der Herzneuralleiste, das Herz zu erreichen, erklärt den Mangel an Abfluss tractseptation und die anschließende kardiovaskuläre Phänotyp inChrd-Mutanten beobachtet. Interessanterweise war die Expression von Pax3 in anderen Geweben wie der Unterkieferkomponente (md) des ersten Rachenbogens, den Dermomyotomen (dm) und den Myoblastvorläufern in den Vorderbeinen (fl) nicht betroffen(Abb. 7C‘).

Als nächstes führten wir In-situ-Hybridisierungen mit Sox10 durch, einem Gen, das bei Personen mit Waardenburg-Syndrom Typ 4 mutiert war (Pingault et al., 1998), die in Neuralleistenzellen und Schwann-Zellen exprimiert werden. Bei E7.5 war die Expression von SOX10 in Chrd-/- Embryonen und in ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern gleich (Daten nicht gezeigt). Bei E9.5 war die Sox10-Expression in den dorsalen Wurzelganglien (drg) des Rumpfes normal(Abb. 7B, B‘), aber die Verteilung von Gliazellen, die Sox10 exprimieren, zeigte spezifische Mängel in der Organisation des peripheren Nervensystems im Hals- und Kopfbereich der Mutanten (Abb.7B‘). Insbesondere zeigten kraniale sensorische Ganglien markiertabnormalitäten. Die Trigeminus- (tr) und Vestibulo-Cochlea-Ganglien (vc), die den Hirnnerven V bzw. VIII entsprachen, lagen bei Chrd-/-Embryonen enger beieinander als bei Wildtyp-Lettermates. Darüber hinaus wurden abnormale Nervenvorsprünge gesehen, die die beiden verbindenSie wurden gesehen (Abb. 7B‘, Pfeilspitze). Die Ganglien geniculate (g), Petrosal (p) und Nodose (n), die den Hirnnerven VII, IX und X entsprechen, waren am stärksten betroffen und zeigten entweder eine extreme Verringerung der Größe oder eine vollständige Abwesenheit. Diese drei Ganglien stammen aus den epibranchialen Placodes und erfordern bekanntermaßen induktive Signale aus dem vorderen Endoderm für ihre ordnungsgemäße Entwicklung (Begbie et al., 1999). Der Mangel an epibranchialen Placode-abgeleiteten Ganglien zeigt an, dass das sekretierte proteinChrd für die Aktivität des induktiven Signals benötigt wird, das vom Kehlkopfendoderm freigesetzt wird.

Pax9 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung des pharyngealen Endoderms und seiner Derivate in der Maus benötigt wird (Peters und Balling, 1999;Peters et al., 1998). Bei E9.5 war die Expression von Pax9 im pharyngealen Endoderm von CHRD-/-Embryonen schwächer als in ihren Wildtyp-Lettermates (pe, Abb.7D, D‘). Die Pax9-Expression zeigte, dass die Größe und Form des Pharynx bei den Chrd-Mutanten verändert war, wobei die pharyngealen Taschen im vordersten Bereich auf eine einzige Schwellung reduziert waren (Abb. 7E, E‘). Die Hypoplasie des Pharynx wurde durch histologische Schnitte von E14.5embryos bestätigt, bei denen das vordere Endoderm als dünner Schlauch erschien, der ein stark vermindertes Lumen umriss (ph, Abb.5F, F‘). Die Reduktion des pharyngealen Endoderms wurde auch bei Xenopus Chrd Knockdowns beobachtet (Oelschläger et al.,2003). Nicht-pharyngeale Regionen, in denen Pax9-mRNA normal exprimiert wird, wie die somitischen Sklerotome (sc) und das Gesichtsmesenchym (fm), zeigten keine Unterschiede in der Verteilung oder Häufigkeit der Transkripte (Abb.7F, F‘).

Wir folgern aus diesen Studien, dass Veränderungen in der Pax3-, Sox10- und PAX9-Expression auf einen sehr begrenzten Bereich breiter Expressionsdomänen beschränkt sind, was darauf hindeutet, dass das Fehlen des sekretierten Proteins Chrdspecifically lokale Regulationswege stört, die in der peripharyngealen Region um das Chrd-exprimierende Endoderm wirken.

Tbx1- und Fgf8-Expression erfordert Chordin

Um die Interaktion von Chrd mit Genen zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie DiGeorge- oder DiGeorge-ähnliche Phänotypen in Mäusen verursachen, analysierten wir die Expression von TBX1 und Fgf8 in Chrd-mutierten Embryonen. Tbx1 ist ein Mitglied der T-Box-Familie von Transkriptionsfaktoren (Papaioannou und Silver, 1998). Es bildet sich innerhalb der DGS / VCFS 22q11-Mikrodeletion beim Menschen ab und es wurde kürzlich gezeigt, dass es bei Inaktivierung einen DiGeorge-ähnlichen Phänotyp verursachtbei Mäusen (Jerome und Papaioannou, 2001; Lindsay et al.,2001; Merscher et al.,2001; Vitelli et al.,2002a). Die Expression von Tbx1 wurde inChrd-/- Embryonen verändert. Bei Wildtyp-E7.5-Tieren Tbx1wird im Vorderdarm (zukünftiges pharyngeales Endoderm) und im Kopfmesoderm exprimiert(Abb. 8A). In diesem Stadium zeigten mutierte Wurfgeschwister eine deutliche Verringerung der Tbx1expression in den gleichen Bereichen (Abb.8A). Die Reduktion der Tbx1-mRNA war in der pharyngealen Region homozygoter Chrd-Embryonen bei E8.0, E8.5 und E9.0 gleich deutlich (Abb.8B‘, C‘, D‘). Transversale histologische Schnitte zeigten, dass auf zellulärer Ebene die Häufigkeit von Tbx1-Transkripten im Endoderm sowohl im Pharynx als auch im Vorderdarm bis zur Ebene des hepatischen Divertikels drastisch reduziert war (Abb.8F-H‘) Abnahme der Konzentration von Tbx1 mRNAwar auch im Mesoderm, einschließlich Kopf, splanchnic (Pfeilspitzen) undsomatic Mesoderm (Pfeile) in der peripharyngealen Region (Abb.8F‘, G‘,H‘). Darüber hinaus war die Tbx1-Expression an E9 im mesodermalen Kern des ersten Rachenbogens diffus und erstreckte sich bis zum größten Teil des Bogens, und Tbx1-Transkripte waren aus dem otischen Vesikel vorhanden (Abb.8D-D‘).

Fgf8 ist ein sezernierter Wachstumsfaktor, der in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird, einschließlich des pharyngealen Endoderms und des benachbarten Mesoderms (Crossley und Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Während der frühen Entwicklung wird Fgf8 für die Gastrulation benötigt(Sun et al., 1999) und die Etablierung der linken/rechten Symmetrieachse (Meyers und Martin, 1999). Atlater Stadien von Fgf8 ist für die Behandlung erforderlich(Lewandoski et al., 2000;Moon und Capecchi, 2000) undcraniofacial (Trumpp et al.,1999) Entwicklung. Jüngste Experimente haben gezeigt, dass Mäuse mit reduzierter Fgf8-Aktivität ein Spektrum von kardiovaskulären und pharyngealen Defekten aufweisen, die das DiGeorge-Syndrom genau nachahmen (Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002). Darüber hinaus wird die Fgf8-Expression im pharyngealen Endoderm von TBX1- / – Mutanten aufgehoben und beide Gene interagieren genetisch während der Differenzierung der Pharyngealbogenarterien (Vitelli et al., 2002b). AtE9, Fgf8 Ausdruck in Chrd Mutanten ist normal in themid-hinterhirn Isthmus, frontonasal prominenz und Schwanz. Im Pharyngealendoderm sind die Fgf8-Transkriptspiegel jedoch drastisch reduziert(Abb. 8E). Die Reduktion der Tbx1- und Fgf8-Expression in Chrd- /-Embryonen deutete darauf hin, dass beide Gene stromabwärts von Chrd auf dem gleichen regulatorischen Weg wirken. Diese Experimente bestimmen nicht, ob Chrdis für die Wartung oder für die Induktion von Tbx1 undFgf8 im Pharynx und in benachbarten Geweben erforderlich ist.

Um zu testen, ob Chrd Tbx1 und Fgf8 induzieren kann, injizierten wir Chrd-mRNA (50 pg) in die ventrale Region VONXENOPUS-Embryonen im vierzelligen Stadium. Die Explantate der ventralen Randzone (VMZ) wurden in der frühen Gastrula seziert, kultiviert, bis die Geschwisterembryonen das frühe Neurula-Stadium erreichten, und mittels RTPCR analysiert. Tbx1- und FGF8-mRNAs wurden in diesem Stadium in hohen Konzentrationen in ganzen Embryonen und Explantaten der dorsalmarginalen Zone (DMZ) und in niedrigen Konzentrationen in VMZ-Explantaten exprimiert (Abb. 8I, Spuren 1-3). Uponmikroinjektion, Chrd mRNA erhöhte die Spiegel von Tbx1 undFgf8 in VMZ (Abb. 8I, Spur 4). Die In-situ-Hybridisierung von mikroinjektierten Xenopus-Embryonen bestätigte, dass sich die durch Chrd-MRNA induzierten Tbx1-Transkripte im pharyngealen Endoderm befanden (Daten nicht gezeigt). Wir schließen daraus, dass CHRD, ein Bmp-Antagonist, Tbx1- und Fgf8-Expression in Xenopus-Embryonen induzieren kann und für die vollständige Expression dieser Gene in der pharyngealen Region des Mausembryos erforderlich ist.