Die ClpP-Proteaseaktivierung resultiert aus der Reorganisation der elektrostatischen Interaktionsnetzwerke an den Eingangsporen

Bindungsmodus von ACP1 an EcClpP

Zur Aufklärung der strukturellen Grundlage für die ClpP-Aktivierung durch ACP128 wurden Strukturen von NmClpP und EcClpP (Abb. 1a) im Komplex mit ACP1-Analoga gesucht. Während eine Struktur von NmClpP mit gebundenem ACP1 trotz wiederholter Versuche nicht erreicht wurde, wurde eine Struktur des CLPP+ACP1-06 Komplexes mit 1,9 Å Auflösung bestimmt (Fig. 1b, c, Tabelle 1), enthaltend ein Tetradecamer in der asymmetrischen Einheit (Ketten A-N). Die Elektronendichte für N-terminale Reste, die die axialen Schleifen von NPP bilden, ist in allen bis auf eine Untereinheit (Kette B) unklar. In zuvor veröffentlichten Strukturen sind diese axialen Schleifen hochflexibel und werden normalerweise in Abwesenheit von Aktivatoren oder durch Ausschluss durch Kristallpackung23 im Kristall ungeordnet. Eine eindeutige Elektronendichte wurde für ein einzelnes ACP1-06-Molekül in einer Tasche beobachtet, die durch die Untereinheiten D und E gebildet wurde, was zwei verschiedene Konfigurationen der Verbindung zeigt (Abb. 2a, b). Beide Konfigurationen wurden in der Elektronendichte modelliert, wobei die erste Konfiguration den Trifluormethylpyridinanteil der Verbindung innerhalb einer hydrophoben Tasche positioniert (Down-Konfiguration), während die zweite Konfiguration ihn außerhalb der dem Lösungsmittel ausgesetzten hydrophoben Tasche positioniert (Up-Konfiguration) (Fig. 2a). Die restlichen 13 hydrophoben Taschen zeigen eine mehrdeutige Elektronendichte für ACP1-06. Wir modellierten und verfeinerten alle 14 ACP1-06-Moleküle in Auf- und Ab-Konfigurationen bei einer Belegung von 0,5, was zu einer verbesserten Elektronendichte für jeden Liganden führte.

Die Bindungsmodi von ACP1-06 (Abb. 2b-d) annähernd die von ADEPs, die in Kristallstrukturen verschiedener bakterieller ClpPs beobachtet wurden (Abb. 2c-f)6,15,18,19,21,40. Beachten Sie, dass von unserer Gruppe synthetisierte Verbindungen als ACP1-YY und ADEP-YY nummeriert sind, während Verbindungen aus Studien anderer Gruppen wie in den jeweiligen veröffentlichten Arbeiten benannt sind. Alle Proteinkontakte mit ACP1-06 sind unpolarer Natur, mit Ausnahme von zwei bemerkenswerten elektrostatischen Bindungen, die zwischen (1) der phenolischen Hydroxylseitenkette von Y76 und dem Amidsauerstoff von ACP1-06 und (2) der Guanidinylseitenkette von R206 (dem vorletzten Arg in PPP) und einem Sulfonylsauerstoff von ACP1-06 auftreten (Abb. 2b). Die beiden letztgenannten Wechselwirkungen sind in beiden Konfigurationen von ACP1-06 vorhanden. Zusätzlich wird R206 (Kette E) durch Ionenbindung mit E65 einer benachbarten Untereinheit (Kette D) stabilisiert (Abb. 3a, b).

In der Down-Konfiguration nimmt der Trifluormethylpyridinteil von ACP1-06 einen hydrophoben Hohlraum ein, der durch L62, T93 und F96 (Kette D) und Y74, Y76, I104, L203 und L128 (Kette E) gebildet wird (Fig. 2b und 3b). Dies ist der gleiche Hohlraum, den der Ring des exocyclischen Phe-Restes der verschiedenen mit ClpP kokristallisierten ADEP-Analoga einnimmt, wie in unserem NmClpP + ADEP-0419 (Abb. 2e, f) oder die PPP+ADEP1-Strukturen40 (Fig. 2c, d). Im Gegensatz dazu ist in der up–Konfiguration die Trifluormethylpyridin-Einheit um die CS-Bindung gedreht und lösungsmittelfreigelegt, während van-der-Waals-Kontakte mit Y74, I104, F126 und L203 (Kette E) hergestellt werden (Fig. 2b und 3b). Der Gem-Dimethylteil stapelt sich gegen den flachen Ring von Y74 (Kette E), während die verlängerte aliphatische Kette, die mit einem ortho-Chlor-substituierten Phenylring endet, in einer unpolaren Nut zwischen zwei Helices benachbarter Untereinheiten sitzt (Abb. 3b). Dieser Bindungsspalt wird gebildet durch L62 (Kette D), F63 (Kette D), A66 (Kette D), L37 (Kette E), V42 (Kette E) und den unpolaren Anteil von E40 (Kette E) (Fig. 2b und 3b).

Sowohl in ACP1-06- als auch in ADEP1-gebundenen Strukturen von EcClpP findet sich die Intrasubunit-Salzbrücke zwischen R36 und E40, wobei der nahe gelegene aliphatische Schwanz von ADEP1 oder der chlorsubstituierte Phenylring von ACP1-06 eine hydrophobe Wechselwirkung mit der Seitenkette von E40 bildet (Abb. 3b, c). Die beiden Aktivatoren werden in der hydrophoben Stelle durch zwei unterschiedliche Wasserstoffbindungsmuster weiter stabilisiert. Während ACP1-06 durch eine lösungsmittelexponierte ionische Wechselwirkung zwischen seiner Sulfonylgruppe und dem C-terminalen Rest R206 gesichert ist (Abb. 3b) wird ADEP1 durch zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit der Hydroxylgruppe von Y76 innerhalb der hydrophoben Stelle (Fig. 3c). Eine lösungsmittelvermittelte Wasserstoffbindung zwischen E65 und der Carbonylgruppe der N-Acyl-Phe-Seitenkette von ADEP1 verstärkt seine Wechselwirkung mit PPP weiter (Abb. 3c). Diese zusätzliche Wasserstoffbindung sowie die größere Größe des cyclischen Depsipeptidrings, der im Vergleich zur kleineren Trifluormethylpyridingruppe von ACP1 eine größere Oberfläche zur Bildung von Van-der-Waals-Wechselwirkungen aufweist, können für die allgemein engere Bindung verantwortlich sein, die für ADEPs beobachtet wird als ACP1s28.

In der PPP + ACP1-06-Struktur fanden wir eine ungeklärte Elektronendichte in allen 14 Untereinheiten, die sich vom nukleophilen Rest S111 der katalytischen Triade erstrecken, was auf eine kovalente Modifikation hindeutet (Ergänzende Abb. 1a, b). Die Dichte erstreckt sich ungefähr rechtwinklig in entgegengesetzte Richtungen von den S111-Seitenketten weg. Trotz umfangreicher Bemühungen konnte es nicht überzeugend mit Peptiden, Acylketonprodukten oder verschiedenen bekannten Serinprotease-Inhibitormolekülen ausgestattet werden.

Bindungsmodus von ADEP an NmClpP

NmClpP hat eine kürzere Prosequenz am N-Terminus, während es im Vergleich zu NMPP vier zusätzliche Reste am C-Terminus aufweist (Abb. 1a). Obwohl NmClpP als Protein in voller Länge exprimiert wurde, das einen N-terminalen His6-Tag trägt, beobachteten wir wiederholt eine fehlende Bindung an das Ni-Nitrilotriessigsäureharz. Die N-terminale Sequenzierung des gereinigten Proteins ergab, dass das reife NmClpP am Rest Y6 beginnt (Abb. 1a), was auf Autoproteolyse hinweist, um seine N-terminale Prosequenz (1MSFDN5) freizusetzen.

Zuvor hatten wir die Struktur von NmClpP mit ADEP-0419 bestimmt. In dieser Studie haben wir die Struktur von apo-NmClpP auf 2,0 Å und NmClpP mit gebundenem ADEP-14 auf 2,7 Å bestimmt (Abb. 1b, c, Ergänzend Fig. 1c, Tabelle 1). Die Struktur von apo-NmClpP enthält ein Tetradecamer in der asymmetrischen Einheit und zeigt keine eindeutige Dichte für eine der 14 N-terminalen Axialschleifen. Eine schwache Elektronendichte wird für die durch Reste G133-G137 gebildeten Schleifen im Strang β8 des Griffbereiches beobachtet (Fig. 1a). Die asymmetrische Einheit für den NmClpP+ADEP-14-Kristall enthält zwei Tetradecamere (Ergänzende Abb. 1d). Für die Reste 1-22 aller 28 Untereinheiten wurde aufgrund der Kristallpackung keine Elektronendichte beobachtet (Abb. 1c, Ergänzend Fig. 1d). Zusätzlich kann der β8-Strang (Reste 130-137; Fig. 1a) ist in allen Untereinheiten nur teilweise sichtbar. ADEP-14 ist in ähnlicher Konfiguration wie ADEP-04 an NmClpP gebunden (Fig. 2e, f und 3e, f). Kurz gesagt, die Difluorphenyleinheit von ADEP-14 besetzt eine hydrophobe Tasche, die durch Y67, L95, L97 und L119 einer Untereinheit und V49, L53, T84 und F87 einer benachbarten Untereinheit gebildet wird (Abb. 3e). Der sechsgliedrige Ring des Pipecolsäureanteils ist lösungsmittelfrei und wird durch den Phenylring von F117 und die hydrophoben Seitenketten von L97, L119 und L196 stabilisiert (Abb. 3e). Die zusätzliche Methylsubstitution am Allo-Threonin-Rest des Depsipeptidrings (Fig. 1b) ist lösungsmittelbelichtet. Wie ADEP-04 ist ADEP-14 in der hochkomplementären hydrophoben Tasche durch zwei Wasserstoffbindungswechselwirkungen zwischen der phenolischen Hydroxylgruppe von Y67, der Aminogruppe des Difluorphenylalaninrestes und der Alanincarbonylgruppe im Depsipeptidringund eine lösungsmittelvermittelte Wasserstoffbindung mit E56 (Abb. 3e, f). Die Octadiensäure-Seitenkette von ADEP-14 befindet sich in dem engen hydrophoben Kanal, der von L53, F54 und S57 einer Untereinheit und R27, L28, E31, I33, F35 und Y67 der benachbarten Untereinheit gebildet wird (Abb. 3e).

ACP1- und ADEP-Bindung führen zu deutlichen allosterischen Effekten auf den ClpP-Lauf

Unter Verwendung von Strukturen von apo- und verbindungsgebundenen Formen von CLPP und NmClpP (Abb. 1c) untersuchten wir die allosterischen Effekte, die bei der Aktivatorbindung auftreten. Wie in der ergänzenden Fig. 2 wirkt die Aktivatorbindung als Keil, der die seitliche Verschiebung zweier benachbarter Untereinheiten verursacht. Das Ausmaß der globalen Konformationsänderung, die durch die ACP1-06-Bindung verursacht wird (rmsd = 0,84 Å relativ zu apo-PPP), ist ähnlich wie bei ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å relativ zu apo-NmClpP), aber weniger als das für ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å relativ zu apo-NmClpP). Interessanterweise unterscheidet sich die Verschieberichtung zwischen den beiden Aktivatorklassen (Ergänzende Abb. 2 und ergänzende Filme 1-4). Zwischen den beiden ADEPs verursacht ADEP-14 eine größere Gesamtstrukturstörung des NmClpP-Zylinders (vergleiche Ergänzende Filme 3 vs. 4). Die ADEP-Bindung führt zu einer Ausdehnung der apikalen Oberfläche von NmClpP, begleitet von einer Verengung im Äquatorbereich. Der Drehpunkt für diese Bewegung liegt im Griffbereich aus Wendel aE und Strang β8. Dieses Phänomen wird bei allen bisher bekannten ADEP-gebundenen ClpP-Strukturen mit unterschiedlichem Verdichtungsgrad des ClpP-Zylinders15,18,19,23,40 beobachtet. Im Gegensatz dazu bewirkt die Bindung von ACP1-06 an ClpP eine Einwärtsbewegung aller Untereinheiten, was zu einem Anziehen des ClpP-Zylinders führt (Ergänzungsfilm 1). So zeigen die Strukturen, dass ACP1s und ADEPs ClpP aktivieren, indem sie unterschiedliche allosterische Effekte induzieren.

In den aktivatorgebundenen CLPP- und NmClpP–Strukturen bleiben die das Tetradecamer stabilisierenden elektrostatischen Ring-Ring-Grenzflächen-Bindungen trotz der Konformationsänderungen erhalten (Ergänzende Abb. 3). Darüber hinaus behalten die Ser-His-Asp-katalytischen Triaden von NMPP und NmClpP trotz der globalen Strukturänderung bei Aktivatorbindung katalytisch kompetente Geometrien bei, da nur geringfügige Ca-Rückgratverschiebungen in der Nähe des aktiven Zentrums auftreten (ergänzende Abb. 1a-c). Die Analyse aller vorhandenen ACP1- und ADEP-gebundenen Strukturen von ClpP zeigt, dass die Bindung von Verbindungen auch zur Kontraktion der Äquatorregion führt (Ergänzende Abb. 4).

Wir haben die Verdichtung des ClpP-Zylinders bei ACP1- oder ADEP-Bindung quantifiziert, indem wir die Volumina der jeweiligen katalytischen Kammern gemessen haben (Ergänzende Abb. 4). Die Bindung von ACP1-06 bewirkt eine Abnahme des Volumens der katalytischen Kammer um ~ 5% im Vergleich zu apo-PPP. ADEP1-Bindung an PPP führt zu einer ähnlichen Abnahme des katalytischen Kammervolumens. Dies wird auch für andere aktivatorgebundene ClpP-Strukturen wie ADEP-14-gebundenes NmClpP, ADEP-gebundenes BsClpP und den ADEP-gebundenen hetero-oligomeren Komplex MtClpP1P2 beobachtet (Ergänzende Abb. 4).

ClpP-Aktivierung führt zur Reorganisation des elektrostatischen Bindungsnetzwerks an den axialen Poren

In der Struktur von apo-NmClpP stabilisieren zwei elektrostatische Bindungen in der Nähe der axialen Pore die Grenzfläche zweier benachbarter Untereinheiten (Abb. 3d, Ergänzende Fig. 5). Erstens bildet die negativ geladene E58-Carboxylatgruppe einer Untereinheit ein Ionenpaar mit der positiv geladenen R27-Guanidiniumgruppe der benachbarten Untereinheit. Zweitens bilden die S57-Hydroxy- und E31-Carboxylatgruppen zweier benachbarter Untereinheiten eine Wasserstoffbindung. Bei der ADEP-Bindung brechen diese beiden nichtkovalenten Bindungen, während die ionische Bindung zwischen R27 und E31 derselben Untereinheit verkürzt, d. H. verstärkt wird (Abb. 3e, f). In apo-EcClpP verbindet nur eine Ionenbindung zwischen E67 und R36 zwei benachbarte Untereinheiten, da der äquivalente Rest zu S57 von NmClpP ein Alanin in EcClpP ist und daher keine Wasserstoffbindung mit E40 bilden kann (Abb. 3a). Wie bei NmClpP eliminiert die Bindung von ACP1 oder ADEP1 an CLPP die intersubunitäre E67-R36-Ionenbindung und führt zu einer stärkeren intrasubunitären Ionenbindung zwischen R36 und E40 (Abb. 3b, c, Ergänzend Fig. 5).

Um diese Beobachtungen weiter zu verifizieren, haben wir NmClpP- und NMPP-Punktmutanten entwickelt, die zum Verlust der oben genannten elektrostatischen Bindungen zwischen den Untereinheiten führen. Wie in Fig. 4a, während das NmClpP nicht in der Lage war, das Protein Casein abzubauen, wurde die NmClpP E58A-Mutante gefunden, um Casein mit einer höheren Rate als die E31A-Mutante abzubauen. Wichtig ist, dass die Doppelmutante E31A + E58A eine noch höhere Aktivität aufwies als die Einzelmutanten. Das Ausmaß der Aktivierung der Doppelmutante NmClpP ist ähnlich dem, das in Gegenwart von 1 µM ADEPs oder 10 µM ACP1s beobachtet wurde (Fig. 4a). Ähnliches Verhalten wurde für PPP mit ähnlichen Mutationen beobachtet (E40A und E67A; Abb. 4b). Die jeweilige DPP-Doppelmutante ist nicht löslich und konnte nicht getestet werden.

Anschließend wurden Röntgenstrukturen von NmClpP E58A- und NmClpP E31A + E58A-Mutanten bestimmt (Tabelle 1). Die katalytischen Stellen in beiden Mutanten sind nicht gestört (Ergänzende Abb. 1e). In der NmClpP E58A-Einzelmutante hebt die Mutation die Intersubunit E58–R27–Ionenbindung auf und führt zu einer stärkeren Intrasubunit R27-E31-Wechselwirkung, während die Wasserstoffbindung zwischen S57 und E31 erhalten bleibt (Abb. 4c). Ein ähnlicher „Keileffekt“ wird somit in der Struktur beobachtet, wie die subtile globale Konformationsänderung im Ca-Rückgrat der NmClpP-Mutante zeigt (rmsd = 0,33 Å relativ zum NmClpP) (Ergänzender Film 5). Die Mutation von E31 und E58 zu Alanin zur Erzeugung der Doppelmutante NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 Å relativ zu WT–NmClpP) hebt die beiden stabilisierenden elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Subeinheiten sowie die in der NmClpP E58A-Einzelmutante vorhandene intrasubunitäre R27-E31-Ionenbindung auf (Abb. 4d und Ergänzungsfilm 6) und in ADEP-gebundenem NmClpP (Fig. 3e, f). Somit ist die NmClpP E31A + E58A Doppelmutante im Gegensatz zu ADEP-gebundenem NmClpP mit der eliminierten intrasubunitären Ionenbindung dennoch ein aktiviertes Protein mit einer intrinsischen proteolytischen Aktivität, die mit der von kleinmolekülaktiviertem ClpP vergleichbar ist (Abb. 4a). Wie ADEP-gebundenes NmClpP haben sowohl NmClpP-Einzel- als auch Doppelmutanten aufgrund der ClpP-Fassverdichtung reduzierte katalytische Kammervolumina (Ergänzende Abb. 4).

Eine solche Reorganisation des Bindungsnetzwerks wird für alle in der PDB verfügbaren aktivierten ClpP-Strukturen beobachtet, sei es in Gegenwart von niedermolekularen Aktivatoren oder aufgrund spezifischer Mutationen (Ergänzende Abb. 6). Beispielsweise löst ein niedermolekularer Aktivator, der an B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP) und Homo sapiens ClpP (HsClpP) bindet, eine oder zwei elektrostatische Bindungen zwischen den Subeinheiten in der Nähe der axialen Pore auf und führt zu einer stärkeren ionischen Wechselwirkung zwischen den Subeinheiten (Ergänzende Abb. 6a-e, g-l)6,15,18,21,39. In MtClpP2 existiert die Ionenbindung zwischen den Untereinheiten, die der E58–R27-Wechselwirkung in NmClpP entspricht, nicht18. Der äquivalente Rest für E58 von NmClpP ist L66 in MtClpP2 und kann nicht an einer ionischen Wechselwirkung mit K35 von MtClpP2 teilnehmen (entspricht R27 von NmClpP). Stattdessen stabilisiert eine intersubunitäre Wasserstoffbindung zwischen S65 und E39 die Grenzfläche (Ergänzende Abb. 6g, h). ADEP Bindung an MtClpP2 bricht die S65-E39 Wasserstoffbindung und stärkt die intrasubunit Ionenbindung zwischen K35 und E3918.

Interessanterweise unterstützt sogar die aktivierte SaClpP Y63A variant41, mit der aktivierenden Mutation im Zentrum der hydrophoben Stelle, und daher nicht äquivalent zu den hier vorgestellten aktivierenden Mutationen von NmClpP, unser vorgeschlagenes Modell der Reorganisation des Wasserstoffbindungsnetzwerks um die axiale Pore bei ClpP-Aktivierung (Ergänzende Abb. 6f). In der Struktur der SaClpP Y63A-Mutante wird der Abstand zwischen dem Intersubunit–Ionenpaar (Q54–R23) vergrößert, während die Intrasubunit-Salzbrücke (R23-D27) verstärkt wird (Ergänzende Abb. 6d, f). Wir generierten auch die äquivalente Y63A-Mutation in EcClpP und NmClpP. Die NmClpP Y67A-Mutante war unlöslich, während die NMPP Y76A eine Aktivität aufwies, die etwas höher als die E40A-Mutante, aber niedriger als die der E67A-Mutante war (Abb. 4b).

Die ClpP-Aktivierung führt zu einer Verringerung der strukturellen Heterogenität der N-terminalen Axialschleifen

Wie oben diskutiert, löst die ADEP–Bindung in der geordneten Axialschleife des NmClpP + ADEP-04-Komplexes, der die β1-β2-Haarnadelkurve bildet, R27 von einer intersubunitären Ionenbindung mit E58 und verstärkt die intrasubunitäre Ionenbindung mit E31 der Helix aA (Abb. 5a). Folglich bildet R27 eine ionische Bindung mit D23 des Strangs β1 der Axialschleife. Diese stabilisierende Wechselwirkung wird in allen aktivatorgebundenen Strukturen von ClpP beobachtet, in denen die axialen Schleifen geordnet sind (Abb. 5a-e).

Für die PPP + ACP1-06-Struktur sind die axialen Schleifen (Reste 14-31) teilweise im Kristall angeordnet, wobei nur 1 von 14 axialen Schleifen die β1–β2-Haarnadelkurve bildet (Abb. 1c-vollständige Ordnung scheint teilweise durch Kristallpackungseffekte verhindert zu sein). In der geordneten axialen Schleife der Untereinheit A ermöglicht die Freisetzung von R36 aus der intersubunitären Ionenbindung mit E67 die Bildung einer stärkeren intrasubunitären Ionenbindung mit E40 der Helix aA (Abb. 5f). Es gibt jedoch keine stabilisierende ionische Wechselwirkung zwischen E22 des Strangs β1 und R36 der Helix aA, wahrscheinlich aufgrund einer partiellen Ordnung (Abb. 5f). Eine zusätzliche Wasserstoffbindung zwischen D32 des Strangs β2 und S21 der Helix aA verankert die axiale Schleife an der PPP-Kerndomäne (Fig. 5f). In ähnlicher Weise sind die axialen Schleifen in der Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4-Struktur nur teilweise geordnet21. Die konservierte Wasserstoffbindung zwischen dem Arg-Rest der Helix aA und einem negativ geladenen Rest des Strangs β1 ist in den teilweise geordneten EfClpP-Axialschleifen nicht zu sehen, obwohl EfClpP potenzielle wasserstoffbindungsbildende Reste auf dem Strang β1 (T6) und auf der Schleife aufweist Verbindungsstränge β1 und β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Abb. 5g).

Zusätzlich zu konservierten elektrostatischen Wechselwirkungen stabilisieren ausgedehnte hydrophobe Kontakte mit der ClpP-Kopfdomäne die Axialschleifen. In ACPP + ACP1-06 nehmen unpolare N-terminale Reste des Strangs β1 und der vorhergehenden strukturierten Spule an hydrophoben Wechselwirkungen mit unpolaren Resten der Helix aA derselben Untereinheit und an den hydrophoben Flächen der Helices aA ‚und aB‘ einer benachbarten Untereinheit teil (Ergänzende Fig. 7a). Die unpolaren Reste auf den Helices aA, aB‘ und β3′ bilden ein kontinuierliches hydrophobes Pflaster auf dem Umfang der axialen Pore (Ergänzende Fig. 7b)15.

Um ein klareres Bild der konformationellen Heterogenität der ClpP-Axialschleifen zu erhalten, wurden anschließend Methyl-TROSY-NMR-Experimente durchgeführt. Anfänglich wurde eine einzelne Cysteinmutation in die axialen Schleifen von NmClpP (T10C) eingeführt. Es wurde einheitlich deuteriertes Protein hergestellt und anschließend mit 13C-Methyl-methanthiosulfonat (MMTS) umgesetzt. Dies führt zur Anlagerung einer einzelnen NMR–sichtbaren 13CH3-S-Gruppe an die Cystein-Seitenkette, was zur Bildung eines S-Methylthio-Cystein (MTC) -Rückstands führt42. Diese Methode bietet eine einfache Möglichkeit, die Struktur und Dynamik großer Komplexe in Lösung zu überwachen. Die Überwachung der NMR-Korrelationen der angebrachten Spinsonde in freien, aktivatorgebundenen oder mutierten Formen des Enzyms liefert eine Ablesung der Lösungskonformation der axialen Poren.

Zunächst wurden Kontrollexperimente durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Einführung der T10MTC-Einheit die Struktur von NmClpP nicht stört. Kurz gesagt, 1H-13C heteronukleare multiple Quantenkohärenz (HMQC) Korrelationen von WT und T10MTC NmClpP markiert 13CH3 an der Seitenkette von ILVM-Resten in einem ansonsten vollständig deuterierten Hintergrund wurden verglichen und als praktisch identisch befunden. Anschließend wurden 1H-13C HMQC-Korrelationen von NmClpP T10MTC in verschiedenen Zuständen erhalten (Abb. 6a). Die Apo-Form (blaue Konturen) weist eine große Anzahl von Korrelationen auf, die auf strukturell heterogene Axialschleifen hinweisen. Zugabe des zweifachen molaren Überschusses an ADEP-28 (Aktivität in Fig. 4a) über monomeres ClpP verringerte signifikant die Anzahl der Korrelationen (rote Konturen), die auf eine Versteifung oder strukturelle Ordnung hindeuten. Die ACP1-17-Bindung (zweifacher molarer Überschuss gegenüber monomerem ClpP; Aktivität in Fig. 4a) führt zu nicht nachweisbaren Änderungen der beobachteten Korrelationen (grüne Konturen), was bedeutet, dass die Axialschleifen nicht beeinflusst werden.

Dieser Ansatz wurde auch genutzt, um die Wirkung aktivierender Mutationen zu überwachen (Abb. 4a, b) an den Axialschleifen. In diesen Experimenten wurden die aktivierenden Mutationen im Hintergrund der T10C-Mutation (Markierung) eingeführt. Wie in Fig. 6a sind Korrelationen der NmClpP T10MTC/E31A-Mutante (rote Konturen) etwas weniger heterogen als die Pseudo-WT-Form, während die der NmClpP T10MTC/E58A-Mutante (orange Konturen) nahezu unverändert sind. Das gleichzeitige Vorhandensein beider aktivierenden Mutationen (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) hat eine viel dramatischere Wirkung als einzelne Mutationen und entfernt eine große Anzahl von Korrelationen, die den axialen Schleifen entsprechen (schwarze Konturen). Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass die Doppelmutante aktiver ist als die Einzelmutanten (Abb. 4a).

ClpP-Aktivierung führt zu einer Verringerung der Konformationsheterogenität der Griffregion

Der gleiche NMR-basierte Ansatz wurde verwendet, um die Wirkung von Aktivatorbindung und Mutationen auf die Griffregion zu untersuchen. Eine I144MTC (Helix aE) -Mutante von NmClpP wurde hergestellt und durch NMR in apo-, ADEP-28- und ACP1-17-gebundenen Formen untersucht. Die Apo-Form (blaue Konturen, Abb. 6a) weist ein Paar Peaks auf, was darauf hinweist, dass der Griffbereich mit einem Paar koexistierender Konformationen assoziiert ist, wie in unserer vorherigen Arbeit an PPP4 zu sehen. Interessanterweise führt die Zugabe von ACP1 und ADEP zum Verschwinden eines der Peaks. Da die Aktivatorbindungsstelle distal zur NMR-Spinsonde liegt, scheint es, dass ACP1 oder ADEP-Bindung allosterisch eine der Konformationen im Griffbereich auswählt. Alternativ könnten Aktivatoren in der Lage sein, beide Formen zu binden, aber eine Änderung in einen einzelnen Zustand zu induzieren.

Magnetisierungsaustauschversuche mit Mischverzögerungszeiten von 100, 200, 300, 400, 500, und 600 ms bei 40 ° C konnten keine Interkonversion zwischen den für die Griffregion beobachteten Konformern für WT NmClpP nachweisen. Dies deutet darauf hin, dass der Austauschprozess für eine NMR-Charakterisierung zu langsam ist.

SAXS zeigt aktivator-induzierte ClpP-Konformationsänderungen in Lösung

Um den oligomeren Zustand und die strukturellen Änderungen bei der Bindung von Verbindungen weiter zu untersuchen, wurden apo-NmClpP- und NmClpP + ADEP-04-Proben durch SAXS charakterisiert (Abb. 6b-g und ergänzende Fig. 8). Endgültige zusammengeführte Kurven sind in Abb. 6b, und die erhaltenen SAXS-Profile ähnelten denen von Hohlstrukturen 43. Hinsichtlich der Gesamtfaltung wurden keine wesentlichen Änderungen festgestellt (Ergänzende Fig. 8), Gyrationsradius (Rg) und oligomerer Zustand bei Zugabe von ADEP-04 zu NmClpP (Ergänzende Fig. 8c). Um die NmClpP-SAXS-Profile weiter zu analysieren und Lösungs-ab-initio-Strukturen zu erzeugen, wurde das GNOM-Programm verwendet, um Paarabstandsverteilungsfunktionen, p (r), zu konstruieren. Apo-NmClpP p (r) zeigte eine subtile Rechtsverschiebung und eine größere maximale Dimension (Dmax) im Vergleich zu ADEP-04-gebundenem NmClpP (Abb. 6c und ergänzend Fig. 8c). Anschließend wurden Dummy-Atommodelle (DAMs) unter Verwendung von SAXS-Daten generiert, um NmClpP-Lösungsstrukturen visuell zu analysieren (Abb. 6d-g). Es wurden zehn Modelle für apo-NmClpP und ADEP-04-gebundenes NmClpP generiert und die wahrscheinlichsten ausgewählt. Diese Modelle zeigten, dass die beiden NmClpP-Lösungsstrukturen insgesamt ähnlich sind (Hohlzylinder). Bei Überlagerung mit den entsprechenden Kristallstrukturen konnten jedoch leicht Unterschiede beobachtet werden, die mit den hochauflösenden Strukturen übereinstimmen (Abb. 6d, e). Eine Messung der axialen Höhen aller zehn Dämme für apo- und ADEP-04-gebundenes NmClpP ergab Werte von 93,0 ± 5,4 Å für die Apo-Form und 103,5 ± 6,1 Å für die ADEP-04-gebundene Form. Um diese Beobachtung weiter zu bestätigen, wurden gemittelte DAMs-Wahrscheinlichkeitskarten und höchste DAs-Belegungskarten (Abb. 6f, g) analysiert. Die axialen Höhen zeigten einen Anstieg von etwa 10 Å für ADEP-04-gebundenes NmClpP im Vergleich zu apo-NmClpP. Darüber hinaus zeigte ADEP-04-gebundenes NmClpP einen größeren axialen Porenumfang als apo-NmClpP (Abb. 6f, g). Trotz der geringen Auflösung der SAXS-Technik legen die Ergebnisse nahe, dass die Bindung von ADEP-04 an NmClpP den oligomeren Zustand von NmClpP nicht beeinflusst, sondern eine Ausdehnung der axialen Poren und eine erhöhte Belegung an den oberen und unteren Teilen des NmClpP + ADEP-04-DAMMS verursacht (Abb. 6e, g) im Vergleich zu apo-NmClpP. Dies spiegelt wahrscheinlich die Konformationsänderungen wider, die zu der durch Röntgen und NMR beobachteten verringerten Heterogenität der Struktur der N-terminalen Axialschleifen von NmClpP führen.