Die Chp1-Chromodomäne bindet den H3K9me-Schwanz und den Nukleosomenkern zur Assemblierung von Heterochromatin

Plasmide und Stämme Konstruktion

Chp1CD-Mutanten zur Expression und Reinigung wurden durch inverse PCR unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle S2 aufgeführten Primer ausgehend von der pET28a Chp1 Chromodomänen-Plasmid . Heterochromatin Rescue Assays wurden durch Einführung von Plasmiden enthaltend chp1 wt und chp1 mutant Protein unter seinem endogenen Promotor in einem chp1Δ Stamm (SP170, siehe ergänzende Tabelle S3) durchgeführt. das chp1-Volllängengen und sein endogener Promotor (-949 bp vom Beginn der chp1 + -kodierenden Sequenz) wurden in das pREP1-Plasmid kloniert. chp1-Chromodomänen-Mutanten wurden durch inverse PCR unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle S2 aufgeführten Primer erzeugt und in den angegebenen chp1Δ-Stamm transformiert.

Für die genomische Integration wurde das pREP1—Plasmid modifiziert, um den nmt1 + -Promotor durch die folgende Integrationskassette zu ersetzen: (SphI) Region am 5′ des Chp1—Gens (Chromosom I, 2215500-2215055) (AscI) —HphMX6-Resistenzkassette – (SphI) Chp1 endogener Promotor (Chromosom I, 2214829-2214664) -Chp1-kodierende Sequenz- (BamHI) Chp1-Terminator (Chromosom I, 2210976-2210582) (BamHI). Die Integrationskassette (sowohl die chp1 + – als auch die chp1LOOP1B / 2B-Kassette) wurde dann PCR-amplifiziert und durch Elektroporation in SP101-, SP170- und SP64-Stämme transformiert. Die Zellen wurden dann auf YES+ Hygromycin (50 mg ml−1 Hygromycin) Platten selektiert. Einzelne Kolonien wurden isoliert, PCR-gescreent und für die genomische Insertion der HphMX6-Resistenzkassette und der LOOP1B/2B-Mutationen sequenziert.

Plasmidhaltige Stämme wurden auf Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu-Medien gezüchtet. Alle in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in den ergänzenden Tabellen S3 und S4 aufgeführt.

Proteinreinigung

His6-SUMO-Chp1CD und alle CD-Mutanten wurden in E exprimiert. coli BL21 (DE3) (pLys) und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni-NTA-Harz (GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) gereinigt. His6-SUMO-Chp1CD enthält Thrombin-Schnittstelle zwischen zwei Tags .

Insgesamt wurden 0,2 mM IPTG zugegeben, um die Proteinexpression zu induzieren, gefolgt von Wachstum bei 18 ° C O/N. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Lysepuffer (20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 20 mM Imidazol) resuspendiert. Nach dem Flash-Freezing wurden die Zellen aufgetaut und vor der Beschallung für 30 min in Lysozym inkubiert (Branson Sonifier 250 -Ausgang 4, Duty Cycle 40). Die Suspension wurde zentrifugiert (12000 g, 20 min bei 4°C) und der Überstand zu dem in Bindungspuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM Imidazol) voräquilibrierten Ni-NTA-Harz gegeben und 30 min bei 4°C unter Rotation inkubiert. Anschließend wurde das Harz 5× mit Bindungspuffer gewaschen und Proteine in Elutionspuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM Imidazol) eluiert. Chp1CD wt und Mutanten wurden dann in einem Puffer enthaltend 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT O/N neutralisiert. Anschließend wurde His6-SUMO-Chp1CD durch Gelfiltration (Superdex 75 pg; GE Healthcare) weiter gereinigt und in einem Puffer enthaltend 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT dialysiert.

Silencing–Assays

Zellen für Silencing−Assays wurden auf eine OD 0,7-1 gezüchtet und dann auf eine Endkonzentration von 1×107 Zellen ml-1 Kultur normalisiert. Es wurden zehnfache serielle Verdünnungen durchgeführt, so dass der Spot mit der höchsten Dichte 1 × 105 Zellen enthielt. Die Zellen wurden auf nichtselektiven (YES) und 5-Fluor-Orotsäure (5-FOA 1 g l-1 5−FOA) Platten entdeckt. Die Platten wurden 2-3 Tage bei 32°C inkubiert und abgebildet. Zellen haben ein ura4-Reportergen, das in perizentromere imr-Wiederholungen (heterochromatischer Locus) eingefügt ist. Wenn das ura4-Reportergen zum Schweigen gebracht wird, können Zellen auf 5-FOA-haltigem Medium wachsen. Wenn Heterochromatin verloren geht, wird das ura4-Reportergen exprimiert und die Zellen können nicht auf 5-FOA-Medium wachsen.

Nachweis von RNA-Spiegeln durch qPCR (RT-qPCR)

Hefekulturen (10 ml) wurden auf eine OD600 von 0,7–1,5 gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen in 500 µl Lysepuffer (300 mM NaOAc pH 5,2, 1% Natriumdodecylsulfat) und 500 µl Phenol-Chloroform resuspendiert und 10 min bei 65°C unter ständiger Durchmischung inkubiert. Die wässrige Fraktion wurde durch Zentrifugation (10 min, 20 000 g) von Phenol–Chloroform abgetrennt und Ethanol gefällt. Nukleinsäuren wurden mit DNase I (Roche, Basel, Schweiz) für 30 min bei 37°C behandelt, gefolgt von 15 min bei 75°C Hitzeinaktivierung. Komplementäre DNA wurde unter Verwendung von 100 ng RNA und 1 pmol DNA-Oligos mit hochgestelltem III (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) unter Standardbedingungen synthetisiert. Die RNA-Spiegel wurden mit qPCR unter Verwendung des Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR-Kits quantifiziert und auf das euchromatische Gen tdh1 normalisiert.

RNA electrophoretic mobility Shift Assays

RNA Shift Assays wurden unter den zuvor berichteten Bedingungen durchgeführt . Insgesamt, 0.66 pmol 32P radioaktiv markierte 30 nt zentromere RNA wurden mit 10 µM Chp1 Chromodomain (Wildtyp und Mutante) in einem Puffer enthaltend 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 3% Glycerin inkubiert. Für die RNA EMSA mit 100 nt dg centromeren Transkripten wurden 2 pmol 32P radioaktiv markierte RNA inkubiert mit 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmols Chp1CD-Protein (wt und LOOP1B/2B-Mutante) in 15 µl Endvolumen. Peptid H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Deutschland) wurde an einem 1:1 Chp1CD- H3K9ME Peptid hinzugefügt, wie berichtet in. Es wurde 1 h auf Eis inkubiert und anschließend Proben (20 µl Endvolumen) auf ein 10%-iges Acrylamid-TBE-Native-Gel (Bis-Acrylamid-Verhältnis 1:29) geladen. Für die in vitro RNA Pull-Downs wurde 1 µg SUMO-Chp1CD (Wildtyp und LOOP1B/2B Mutante) an 15 µl Ni-NTA Harz (GE Healthcare) gebunden und das H3K9ME3NUCLEOSOM wurde zugegeben, um den Chp1CD-H3K9ME3NUCLEOSOM Komplex in Bindungspuffer (20 mM HEPES pH 7.5, 75 mM KCl, 0.5 mM DTT, 20 mM Imidazol) zu assemblieren. Nach dreimaligem Waschen mit 50 µl Bindungspuffer wurden 2 pmol 32P-markierte 100nt dg RNA zugegeben und mit dem Chp1CD-Nukleosomenharz auf Eis für 1 h inkubiert. Das Harz wurde bei langsamer Geschwindigkeit (60 g, 10 s) zentrifugiert und der Durchfluss gesammelt. Das Harz wurde dreimal mit mindestens 3× (v/v) Bindungspuffer gewaschen und der Chp1CD-Nukleosom-RNA-Komplex durch Zugabe von 300 mM Imidazolpuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM Imidazol) eluiert, 1 h auf Eis mit 5 min Intervallmischung inkubiert (gebundene Fraktion). Die Proben wurden auf ein 10% TBE-natives Acrylamidgel (Bis-Acrylamid-Verhältnis 1:29) geladen und 2 h bei 10 mA bei 4 °C laufen gelassen. Nach der Exposition über Nacht wurden die Gele mit dem TyphoonFLA9000 Phosphoimager gescannt.

Chromatinimmunpräzipitation

Hefekulturen (100 ml) wurden auf einen OD600 von 0,7 gezüchtet und wie beschrieben mit 3% Formaldehyd bei Raumtemperatur 15 min vernetzt. Die Reaktion wurde mit 125 mm Glycin 10 min bei Raumtemperatur gequencht. Die Zellen wurden in 500 µl Lysepuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M Natriumacetat, 5 mM MgCl2, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Ethylenglykol-Tetraessigsäure, 0,1% NP-40, 20% Glycerin) enthaltende Proteaseinhibitoren (Protease Inhibitor Cocktail Tabletten, Roche, Komplett, Ethylendiamintetraessigsäure frei). Gefrorene Zellen wurden mit dem MP Biospec Bead Beater lysiert. Nach der Lyse wurde der Extrakt 30 s lang 35× beschallt (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgien) und 15 min bei 13 000 g versponnen, um den Chromatinüberstand zu erhalten. Für Eingangs-DNA wurden 50 µl des Überstandes verwendet. Für Immunpräzipitationen wurden die Überstände bezogen auf die Proteinkonzentration normalisiert und mit anti-dimethyliertem H3K9-Antikörper oder Anti-Chp1-Antikörper (H3K9me2, Abcam No. Ab1220 und Chp1, Abcam Nr. Ab18191), immobilisiert auf magnetischen Dynabeads, für 2 h bei 4°C. Die Beads und das immobilisierte Protein wurden 5× mit 1 ml Lysepuffer gewaschen. Proteine wurden durch Inkubation mit 150 µl Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 1% Natriumdodecylsulfat) bei 65°C für 15 min eluiert. Die Querverbindungen wurden durch Inkubation bei 65 ° C über Nacht rückgängig gemacht, gefolgt von einem RNA–Abbau mit RNase A und einem Proteinabbau mit Proteinase K. DIE DNA wurde dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gewonnen und mit qPCR quantifiziert. Das euchromatische Gen tdh1 wurde zur Normalisierung verwendet. Oligonukleotide, die in Chromatin-Immunpräzipitationsassays verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle S2 aufgeführt.

Nukleosom-In-vitro-Rekonstitution und (H3K9me3) -methylierung

Nukleosomen wurden unter Verwendung von Xenopus-laevis-Histonen und der 601-Sequenz wie zuvor beschrieben rekonstituiert. Die In vitro Methylierung erfolgte wie beschrieben. Der Peak bei +42 Da wurde in der Originalpublikation beobachtet und ist keine Kontamination (Matt Simon, persönliche Kommunikation und beschrieben in ).

In vitro Chp1CD–H3K9me3 MLA Nukleosomen Komplexbildung und Elution

Insgesamt wurden 5 µg Chp1CD an 15 µl Ni-NTA Harz in Bindungspuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM Imidazol) für 20 min bei 4°C gebunden. Das Harz wurde einmal mit fünf Volumina Bindungspuffer gewaschen und 10 µg H3K9me3-Methyllysinanalogon (MLA) -Nukleosomen wurden in einem Endvolumen von 20 µl zugegeben (MLA-Nukleosomen wurden zuvor in Bindungspuffer dialysiert) und 1 h auf Eis unter konstanter Rücksuspension alle 5 min inkubiert. Nach Inkubation wurde das Harz zentrifugiert (60 g für 10 s) und der Durchfluss gesammelt. Anschließend wurde das Harz dreimal mit fünf Volumina Bindungspuffer gewaschen. Der SUMO-Chp1CD-H3k9me3nukleosomenkomplex wurde durch Zugabe von Thrombin (Sigma, München, Deutschland) für 2 h auf Eis in 20 µl Bindungspuffer eluiert. Die Komplexbildung wurde dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese an 15% Acrylamid-Gelen und durch negative Färbung EM beurteilt.

Chp1CD H3K9me3 peptid-bindende Assays

Insgesamt wurde 1 µg -Histon H3 (1-21)-GGK(Biotin) Peptid (Eurogentec) mit 15 µl Streptavidin-Agarose-Harz (Invitrogen) in 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT inkubiert. Anschließend wurden ca.5 µg Chp1CD (sowohl wt als auch Mutanten) in einem Endvolumen von 20 µl zugegeben und 1 h auf Eis unter den gleichen Pufferbedingungen inkubiert. Das Harz wurde dreimal gewaschen und anschließend die Bindungseffizienz an SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese an 15%igen Acrylamid-Gelen beurteilt. Die Quantifizierung der Bindung erfolgte unter Verwendung der ImageJ-Software. Die Bindung jeder Mutante wurde für jeden Assay auf wt Chp1CD normalisiert.

Mikroskalige Thermophorese (MST)

Für MST SUMO-Tag wurde aus Chp1CD-Konstrukten mit Ulp1-Protease entfernt. Insgesamt wurden 100 µg Wildtyp und Mutante Chp1CD mit dem MO-L003 Monolith Protein Marking Kit BLUE-NHS (Amine Reactive) nach Herstellerangaben fluoreszenzmarkiert (Nanotemper Technologies, München, Deutschland). Ein 1: 1 Fluoreszenz: Protein-Verhältnis wurde unter Verwendung der Nanodrop1000 Software ‚Proteine und Etiketten‘ -Funktion geschätzt und jede Chp1 Chromodomain wurde auf einem 15% SDS Acrylamid-Gel laufen Konzentrationen auf 0,1 mg ml-1 zu normalisieren.

Reaktionen wurden in 20 µl mit 300 ng fluoreszierendem Chp1CD und zunehmenden Mengen an -Histon H3 (1-21) -GGK (Biotin) Peptid (Eurogentec) oder H3K9me3Nucleosomen in einem Puffer mit 10 mm Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT und 0,05% Tween-20 zusammengesetzt. Für H3K9me3Nukleosomen-bindende Assays wurde Glycerin zu 10% Endkonzentration hinzugefügt. Für H3K9me3-Assays wurden diese Verdünnungen für Messungen verwendet: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Für H3K9me3Nucleosome Probe verwendeten wir folgende Verdünnungen für Maße: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1.06 µM, 1.2 µM, 1.4 µM, 1.6 µM, 2.4 µM.

MST-Läufe wurden unter Verwendung von standardbehandelten Kapillaren (Nanotemper Cat # K002) am NT durchgeführt.115 Monolith-Instrument. Alle Messungen wurden mit 80% LED- und 40% MST-Leistung durchgeführt, wobei der Laser 30 s eingeschaltet und der Laser 5 s ausgeschaltet war. Für jedes Experiment wurden fünf Einzelmessungen durchgeführt.

Die Daten wurden mit der GraphPad Prism Software Version 6 analysiert.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) und der SigmaPlot Software Version 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Für die Peptidbindungstests, bei denen die Kurven einen deutlichen Sigmoidtrend zeigen, haben wir die logistische asymmetrische Sigmoidgleichung mit fünf Parametern von Richards angepasst und die Kd automatisch berechnet. Für die H3K9ME3NUCLEOSOM-bindenden Assays wurde, da der Rohdatentrend nicht mehr für alle analysierten Proteine sigmoid war, eine Polynomgleichung dritter Ordnung (kubisch) verwendet, um die Rohdatenpunkte von Wildtyp-Chp1CD und den verschiedenen Mutanten anzupassen und zu vergleichen. Kd wurde basierend auf der ‚Interpolation‘ -Funktion der GraphPad Prism-Software berechnet, wobei der 50% gebundene / ungebundene Wert auf der y-Achse verwendet wurde.

Nukleosomen-Trypsinverdau

Schwanzlose Nukleosomen wurden hergestellt, indem rekonstituierte Nukleosomen mit einem immobilisierten TPCK-Trypsinharz (Thermoscientific) für 2 h bei Raumtemperatur in einem Puffer mit 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT inkubiert wurden. Der tryptische Aufschluss erzeugt sehr definierte Histonbanden und es wurde detailliert charakterisiert, wo genau Trypsin schneidet .

Nukleosomenbindungstests mit Chp1CD-Mutanten

Chp1CD-Wildtyp- und Mutanten—Nukleosomenbindungstests wurden wie zuvor beschrieben für die Chp1CD-H3KC9me3 MLA-Nukleosomenkomplexbildung in 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM Imidazol durchgeführt. Harze und INPUTs wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 15% Acrylamid-Gelen betrieben. Alle Proben wurden dann mittels Immunoblot mit Anti-H3-Histon (AbCam, Cambridge, UK, 1:1000) oder Anti-H3K9me3-Antikörper (AbCam, 1:1000), Anti-Ziegen-IgG-HRP (BioRad, 1:3000) Anti-Kaninchen-IgG-HRP (BioRad, München, Deutschland, 1:3000).

Negative stain electron microscopy

Nach Thrombin–Elution wurden 3 µl des Chp1CD-H3KC9me3-Nukleosomen-Komplexes auf einem glühentladenen Kupfergitter (Cu 400 Mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Deutschland), das mit einem 1 nm Kohlenstofffilm beschichtet war, für 45 s getupft. Nach einem schnellen Waschen mit Wasser wurde das Gitter für 15 s in 2% Uranylchlorid inkubiert.

Cryo-EM auf dem Chp1CD–H3KC9me3-Nukleosomenkomplex

Cryo-EM-Gitter (löchrige kohlenstoffbeschichtete Gitter, Cu 300 Mesh R3 / 3 + 1 nm Kohlenstoffschicht, Quantifoil) wurden unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Firma FEI) hergestellt. Cryo-EM-Daten wurden unter Verwendung eines Titan-Krios-Transmissionselektronenmikroskops (Firma FEI, Hillsboro, OR, USA) bei 200 keV und einer Vergrößerung von 113 000 × in der Ebene des CCD unter Verwendung einer F816 CMOS-Kamera (TVIPS GmbH, Gauting, Deutschland) gesammelt, was zu einer Bildpixelgröße von 1,2 Å pro Pixel auf der Objektskala führte (Pixelgröße des CCD betrug 13,6 µm). Für die automatisierte Datenerfassung wurde die EM-TOOLS-Software verwendet und die Daten wurden in einem Defokusbereich von 10 000-40 000 Å gesammelt.

Insgesamt wurden 2 480 Aufnahmen für den Chp1CD–H3KC9me3-Komplex bzw. 991 Aufnahmen für die H3KC9me3-Nukleosomenkontrolle für die Einzelpartikelanalyse unter Verwendung des Xmipp-Softwarepakets ausgewählt (Ergänzende Abbildung S9A). Einige tausend Partikel wurden manuell gepflückt und sorgfältig von Lärm gereinigt. Diese Partikel wurden dann für die halbautomatische und automatische Partikelaufnahme in XMIPP verwendet. Die Kontrasttransferfunktion wurde durch CTFFIND3 bestimmt. Ausgewählte Einzelpartikel wurden zur weiteren Analyse in SPIDER- und RELION-Formate konvertiert (Ergänzende Abbildung S9B). Die zweidimensionalen Klassenmittelwerte wurden mit dem RELION-Softwarepaket generiert (ergänzende Abbildung S9C). Schlechte Klassenmittelwerte wurden aus der weiteren Datenanalyse entfernt. Die dreidimensionalen Verfeinerungen wurden anschließend mit den Softwarepaketen SPIDER und RELION vorgenommen.

Die unbeaufsichtigte Partikelklassifizierung wurde durch zufälliges Seeding mit den vollständigen Dichtekarten ohne fokussierte Klassifizierung im SPIDER-Softwarepaket durchgeführt. Versuche, eine fokussierte Klassifizierung zu verwenden, führten zu einer starken Verzerrung und Rauschüberanpassung in interessierenden Regionen. Daher haben wir keine fokussierte Klassifizierung verwendet, um Verzerrungen zu reduzieren. Bei der anfänglichen Klassifizierung in SPIDER wurden die Klassen C0–C6 und N0-N5 unter Verwendung von Winkeln aus C0- und N0-Karten zurückprojiziert, und diese Klassen wurden nicht vollständig verfeinert. Hier wollten wir nur Klassen auswählen, die zusätzliche Dichte an das Nukleosom gebunden hatten. Partikel, die Karten mit unterschiedlichen Chp1CD-Dichten erzeugen, wurden getrennt und weiter klassifiziert. Ungefähr 20 Runden zufälliger Seeding-Klassifikationen wurden durchgeführt, bis wir die Partikel in fünf verschiedene Gruppen unterteilt haben (Ergänzende Abbildung S3). Die Klassen C11-C15 wurden mit dem RELION-Softwarepaket verfeinert. Die endgültigen Verfeinerungen der Chp1CD-H3k9me3nukleosomenkomplexe (C15-Klasse) und der Nukleosomenkontrolle wurden mit dem RELION-Softwarepaket durchgeführt. Zur endgültigen Verfeinerung wurde die Referenz auf ~ 50 Å gefiltert (RELION-Filter). Die Referenz, die wir verwendeten, hatte keines der Merkmale, die in verfeinerten Rekonstruktionen beobachtet wurden (die DNA-Doppelhelix ist nicht aufgelöst, die Hauptrille ist nicht sichtbar, α-Helices sind nicht aufgelöst). Dies deutet auf keine Referenzverzerrung in unserer Struktur hin. Die Auflösung der Nukleosomenkontrolle erreichte 7,3 Å unter Verwendung von Auto-Refine in RELION- und C2-Symmetrie (FSC 0,143 Cutoff von zwei unabhängig verfeinerten Karten). Der Chp1CD-H3K9ME3-Nukleosomenkomplex wurde ohne Symmetrie auf 10 Å verfeinert (FSC 0,143 Cutoff von zwei unabhängig verfeinerten Karten).

Die lokale Auflösung wurde mit der ResMap-Software berechnet (endgültiges Einzelvolumen, minRes = 7, maxRes = 14, Automask). Die durch Resmap ermittelte mittlere Auflösung beträgt 9,4 Å für den Chp1CD-H3k9me3nukleosomenkomplex, was unabhängig voneinander die zuvor ermittelte durchschnittliche Auflösung von 10 Å (FSC 0,143) bestätigt (Abbildung 1c). Für Chp1CD-H3K9me3Nucleosome komplexe lokale Auflösung für Nukleosom ist 9-10 Å und für den Liganden ~ 10 Å (Abbildung 2a). Die Euler-Winkelverteilung für die endgültigen Rekonstruktionen ist sowohl für das Nukleosom als auch für den Chp1CD-H3k9me3nukleosomenkomplex dargestellt (ergänzende Abbildung S9D). Alle Orientierungen sind vorhanden, wobei Ober- und Seitenansichten bevorzugt werden.

Molekulare Modelle wurden unter Verwendung des Chimera-Softwarepakets unter Verwendung der starren Körperanpassung von Kristallstrukturen erstellt. Die Anpassung an die Dichte erfolgte mit den Chimären-Optionen ‚Fit in Map‘ und ‚Fit in Segments‘ mit nur geringfügigen manuellen Anpassungen. Die Segmentierung und Visualisierung aller Cryo-EM-Karten erfolgte ebenfalls mit der Chimera-Software .