Der gespaltene-Caspase-3-Antikörper ist ein Marker für die Caspase-9-ähnliche DRONC-Aktivität in Drosophila

Die Markierung durch den gespaltenen-Caspase-3-Antikörper bleibt in dcp-1-drICE-Doppelmutanten bestehen

Zur Bewertung der Spezifität des gespaltenen-Caspase-3-Antikörpers 3), analysierten wir Auge imaginal Scheiben von dritten instar Larven. In Wildtyp-Augen-Imaginalscheiben erkennt der Antikörper einige sterbende Zellen, die über die gesamte Scheibe verstreut sind (Abbildung 1a). Überraschenderweise ist in Augenscheiben doppelt mutant für die Nullallele dcp-1Prev und drICEΔ1 (Ref.14, 15) markiert der gespaltene-Caspase-3-Antikörper noch Zellen (Abbildung 1b). Die Markierung in dcp-1Prev drICEΔ1-Doppelmutanten erfolgt in Clustern (Abbildung 1b), ähnlich wie zuvor beobachtet wurde, als der Zelltod durch die Expression des Caspase-3-Inhibitors P35 blockiert wurde.3 Diese Beobachtungen würden darauf hindeuten, dass der gespaltene Caspase-3-Antikörper in Abwesenheit der Caspase-3-ähnlichen Proteine DCP-1 und DRICE immer noch ein Epitop nachweist. Da die Apoptose in diesem Stadium jedoch nicht in einem definierten Muster auftritt, waren wir uns über die Spezifität dieser Markierungssignale nicht sicher.

Daher verwendeten wir GMR-hid-Transgene, ein gut charakterisiertes apoptotisches Modell5, um die Spezifität des gespaltenen Caspase-3-Antikörpers weiter zu untersuchen. Durch die GMR-gesteuerte Expression des pro-apoptotischen Gens hid spezifisch in der hinteren Hälfte des sich entwickelnden Auges induzieren GMR-hid-Transgene Apoptose in zwei verschiedenen Wellen, wie durch den gespaltenen Caspase-3-Antikörper und die TUNEL-Markierung28 gezeigt (Abbildung 1c, d). Um die Spezifität des gespaltenen Caspase-3-Antikörpers zu bewerten, untersuchten wir GMR-hid-Augenscheiben, die doppelt für dcp-1Prev und drICEΔ1 mutiert waren. In Übereinstimmung mit der Erwartung hebt der Verlust von dcp-1Prev und drICEΔ1 die TUNEL-positive Apoptose in GMR-hid-Discs vollständig auf (Abbildung 1f). Überraschenderweise zeigten dcp-1Prev drICEΔ1-Doppelmutanten-GMR-hid-Augenscheiben jedoch immer noch eine starke Immunreaktivität mit gespaltenem Caspase-3-Antikörper (Abbildung 1e). Somit detektiert der gespaltene-Caspase-3-Antikörper nicht oder nicht nur DRICE und/oder DCP-1. Wir stellen jedoch fest, dass sich das Markierungsbild des gespaltenen Caspase-3-Antikörpers in Abwesenheit von DCP-1 und DRICE ändert (vergleiche Abbildung 1c und e). Das Markierungssignal ist nicht mehr auf zwei verschiedene Wellen beschränkt (Abbildung 1c), sondern füllt das gesamte hintere Kompartiment der Augenscheibe aus und ist auf interommatidiale Zellen beschränkt (Abbildung 1e). Eine ähnliche Änderung des Markierungsmusters wurde für die CM1-Antikörpermarkierung bei Expression des Caspaseinhibitors P35 berichtet.3 Diese Änderung des Markierungsmusters ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Zellen in dcp-1Prev drICEΔ1-Doppelmutanten-GMR-hid-Augenscheiben nicht absterben (Abbildung 1f) und somit das Epitop beibehalten, das durch den gespaltenen Caspase-3-Antikörper nachgewiesen wurde. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Analyse den Nachweis eines Epitops in Abwesenheit von Caspase-3-ähnlichen Proteinen DCP-1 und DRICE durch gespaltene Caspase-3-Antikörper zeigt.

Die Immunreaktivität des gespaltenen-Caspase-3-Antikörpers hängt von den Apoptosomenkomponenten DRONC und ARK ab

Es gibt zwei Möglichkeiten, warum der gespaltene-Caspase-3-Antikörper dcp-1 drICE-Doppelmutantenzellen markiert, obwohl sie nicht apoptotisch sind. Erstens kann der Antikörper kein apoptotisches Epitop nachweisen; oder zweitens kann der Antikörper ein apoptotisches Epitop nachweisen, das stromaufwärts oder parallel zu DCP-1 und DRICE erzeugt wurde. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, untersuchten wir GMR-hid eye Discs Mutant für die Apoptosomenkomponenten DRONC und ARK, die stromaufwärts von DRICE und DCP-1 wirken. In dronc- und ark-Mutanten-GMR-hid-Augenscheiben sind sowohl TUNEL- als auch Cleaved-Caspase-3-Antikörpermarkierungen blockiert (Abbildung 1 g, h; Abbildung 3a, b). Diese Daten bestätigen, dass der gespaltene-Caspase-3-Antikörper tatsächlich ein apoptotisches Epitop in Drosophila nachweist. Da das apoptotische Epitop in Dronc- und Ark-Mutanten, jedoch nicht in dcp-1-drICE-Doppelmutanten, nicht nachgewiesen werden kann, ist es genauer, den gespaltenen Caspase-3-Antikörper als Marker für die DRONC-Aktivität und nicht als Effektor-Caspase-Aktivität in sterbenden Drosophila-Zellen zu betrachten.

Das Tripeptid ETD ist das apoptotische Epitop, das durch den gespaltenen Caspase-3-Antikörper nachgewiesen wurde

Das vom gespaltenen Caspase-3-Antikörper nachgewiesene Epitop hängt von der DRONC-Aktivität ab. Es kann möglich sein, dass der Antikörper aktiviertes DRONC direkt erkennt. Alternativ ist es auch möglich, dass der gespaltene-Caspase-3-Antikörper unabhängig von DRICE und DCP-1 ein Epitop detektiert, das durch die Spaltung eines unbekannten Substrats durch aktives DRONC erzeugt wurde.

Zur Unterscheidung dieser beiden Möglichkeiten haben wir die Reste aus dem katalytischen Cystein (Cys163) an der Schnittstelle bei Asp175 der humanen Caspase-3 (Caspase-3-Peptid) mit den entsprechenden Regionen der Drosophila-Caspasen ausgerichtet (Abbildung 2a; siehe auch Ref. 3). Die meisten C-terminalen Reste des Caspase-3-Peptids, ETD, sind in DRICE und DCP-1 konserviert (Abbildung 2a). Ähnlich wie Caspase-3 ist dies die Schnittstelle für die Aktivierung von mindestens DRICE, 29 und möglicherweise DCP-1. Es ist interessant festzustellen, dass das N-Terminal, zwei Drittel des Caspase-3-Peptids, die größte Ähnlichkeit mit DRONC aufweist; Sechs von neun Resten sind konserviert (Abbildung 2a). Dieser Teil des Caspase-3-Peptids ist in DRICE, DCP-1 und den übrigen Drosophila-Caspasen weniger gut konserviert. Obwohl eine Spaltung zwischen den großen und kleinen Untereinheiten von DRONC für seine Aktivität nicht notwendig ist,30, 31 und möglicherweise nicht in vivo auftritt, haben wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass Antikörper, die gegen den N-terminalen Teil des Caspase-3-Peptids gerichtet sind, aktives DRONC direkt in sterbenden Zellen nachweisen können.

Wir verwendeten blockierende Peptide, um zu bewerten, welche Epitope des Caspase-3-Peptids durch den gespaltenen Caspase-3-Antikörper in sterbenden Drosophila-Zellen nachgewiesen werden. Die Sequenzen der blockierenden Peptide sind in Abbildung 2b dargestellt und in Abbildung 2a unterstrichen. Das blockierende Peptid A (TETD) leitet sich von DRICE und DCP-1 ab und das blockierende Peptid B (CRGDEYDLG) entspricht der Region mit der höchsten Ähnlichkeit in DRONC (Abbildung 2a, b). Peptid C ist ein Kontrollpeptid, das den Resten entspricht, die unmittelbar an Peptid B in DRONC angrenzen (Abbildung 2a, b). Peptid D ist ein weiteres Kontrollpeptid, das Peptid A sehr ähnlich ist und sich von der Prodomain von DRONC an Position 113 ableitet. Wenn die Prodomäne von DRONC an dieser Stelle gespalten wird, wird es ESD an seinem C-Terminus freilegen, der dem C-Terminus des Caspase-3-Peptids (ETD, Peptid A) sehr ähnlich ist und somit vom gespaltenen Caspase-3-Antikörper nachgewiesen werden kann.

Die blockierenden Peptide wurden mit dem gespaltenen-Caspase-3 Antikörper 60 min vor Inkubation mit den eye Imaginal Discs gemischt. Die Ergebnisse der Blockierungsversuche sind in Abbildung 2b und für die Peptide A und B in Abbildung 2c–f zusammengefasst. Peptid A ist ausreichend, um die gesamte Immunreaktivität des gespaltenen-Caspase-3-Antikörpers in GMR-hid und in dcp-1 drICE-Doppelmutanten-GMR-hid-Augenscheiben zu blockieren (Abbildung 2c, d). Im Gegensatz dazu hebt Peptid B die Immunreaktivität des Antikörpers in diesen Scheiben nicht auf (Abbildung 2e, f). Die Kontrollpeptide C und D können auch die gespaltene Caspase-3-Immunreaktivität nicht blockieren (Abbildung 2b; Daten nicht gezeigt).

Diese Daten zeigen, dass der gespaltene-Caspase-3 Antikörper spezifisch das Epitop ETD in apoptotischen Zellen detektiert. Unter den Drosophila-Caspasen ist dieses Epitop nur in DRICE und DCP-1 vorhanden, was es sehr wahrscheinlich macht, dass der Antikörper diese Effektor-Caspasen tatsächlich nachweist. Im Gegensatz dazu deutet die Tatsache, dass die von DRONC abgeleiteten Peptide B, C und D die Immunreaktivität nicht blockieren, darauf hin, dass es unwahrscheinlich ist, dass der Antikörper aktives DRONC direkt nachweist. Da der gespaltene-Caspase-3-Antikörper in dcp-1-drICE-Doppelmutanten keine Immunreaktivität verliert (Abbildung 1e), detektiert er daher mindestens ein anderes Protein, das das ETD-Epitop in einer DRONC-abhängigen Weise exponiert.

Aktivierung von DCP-1 unabhängig von ARK-gespaltener-Caspase-3-Immunreaktivität

Die in Abbildung 2 dargestellte Analyse legt nahe, beweist aber nicht, dass der gespaltene-Caspase-3-Antikörper tatsächlich gespaltenes DCP-1 und DRICE nachweist. Um diese Möglichkeit direkt zu testen, exprimierten wir ein GMR-ΔN-dcp-1-Transgen im mutierten Hintergrund. ΔN-dcp-1 fehlt die N-terminale Prodomäne von DCP-1. Es wird angenommen, dass Prodomain-abgereichertes ΔN-DCP-1 die Autoverarbeitung leicht fördert, und eine konsistente Expression unter GMR-Kontrolle induziert einen Augenablationsphänotyp.32 Dieser Augenablationsphänotyp wird durch die Induktion von Apoptose verursacht (Abbildung 3c, d). Wie oben erwähnt, können Ark-Mutantenklone im GMR-hid-Hintergrund keine TUNEL-positive Apoptose induzieren (Abbildung 3b) und der gespaltene Caspase-3-Antikörper weist keine Immunreaktivität in Ark-Klonen auf (Abbildung 3a), was darauf hindeutet, dass weder DCP-1 noch DRICE noch die unbekannten DRONC-Substrate in Ark-Mutantenklonen gespalten werden. Daher haben wir getestet, ob die Expression von ΔN-Dcp-1 in Abwesenheit von Apoptosomenaktivität, dh in Ark-Klonen, die Markierung von gespaltenen Caspase-3-Antikörpern wiederherstellen kann. Im Vergleich zu Wildtyp-Gewebe (markiert durch GFP in Abbildung 3c, c‘) ist die Anzahl der gespaltenen-Caspase-3-positiven Zellen in den mutierten Klonen stark reduziert (Abbildung 3c, c‘), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von ΔN-DCP-1 ist zumindest teilweise abhängig vom Apoptosom. Allerdings enthalten etwa 50% der mutierten Klone (n = 32) im GMR-ΔN-Dcp-1-Hintergrund gespaltene-Caspase-3-immunreaktive Zellen (Pfeile in Abbildung 3c, c ‚). Es ist unwahrscheinlich, dass dies ein Markierungsartefakt ist, da diese Zellen auch TUNEL-positiv sind (Abbildung 3d, d‘). Da DRONC im mutierten Hintergrund inaktiv ist, was darauf hindeutet, dass das gespaltene Caspase-3-Markierungssignal nicht durch das unbekannte DRONC-Substrat verursacht wird, zeigt diese Analyse, dass der gespaltene Caspase-3-Antikörper tatsächlich gespaltenes DCP-1 nachweist. Es ist auch möglich, dass der gespaltene-Caspase-3-Antikörper in diesem Experiment gespaltenes DRICE nachweist, da DCP-1 DRICE zumindest in vitro proteolytisch verarbeiten kann.29, 32 Eine ähnliche Analyse mit DRICE konnte nicht durchgeführt werden, da GMR-drICE und GMR-ΔN-drICE keinen Augenablationsphänotyp verursachen.32 Dennoch, ob DCP-1 DRICE in vivo spaltet oder nicht, angesichts der Sequenzähnlichkeit von DCP-1 und DRICE am C-Terminus der großen Untereinheit und der Peptidblockierungsdaten von Abbildung 2, Es deutet darauf hin, dass der Antikörper auch gespaltenes DRICE nachweisen kann.