Das industrielle Anaerob Clostridium acetobutylicum verwendet Polyketide zur Regulierung der Zelldifferenzierung

Bakterienstämme und Medien

C. acetobutylicum ATCC 824 wurde in einer anaeroben Kammer (Coy Laboratory Products) kultiviert, die eine Atmosphäre aus 97% Stickstoff und 3% Wasserstoff enthielt. 2xYTG medium67 enthielt 16 g / l Trypton, 10 g / L Hefeextrakt, 5 g / L NaCl und 10 g / L Glucose (sofern nicht anders angegeben), wobei der pH-Wert auf 5 eingestellt war.2 für flüssige Medien und 5.8 für feste Medien (ebenfalls mit 15 g/L Agar). Clostridium Growth Medium (CGM)68 enthielt 30 g / L Glucose (sofern nicht anders angegeben), 6,25 g / L Hefeextrakt, 2,5 g / L Ammoniumsulfat, 1,25 g / L NaCl, 2,5 g / L Asparagin, 0,95 g / L einbasisches Kaliumphosphat, 0,95 g / L zweibasisches Kaliumphosphat, 0,5 g / L Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 13 mg / L Mangansulfat-Heptahydrat und 13 mg / L Eisensulfat-Heptahydrat mit einem pH-Wert von 6,4. P2 medium69 enthielt 80 g/L Glucose (sofern nicht anders vermerkt), 1 g/L Hefeextrakt, 2,2 g/L Ammoniumacetat, 0.5 g/L einbasisches Kaliumphosphat, 0,5 g/L zweibasisches Kaliumsulfat, 0,2 g/L Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 1 mg/L Paraaminobenzoesäure, 1 mg/L Thiaminhydrochlorid, 10 µg/L Biotin, 10 mg/L Mangansulfat-Heptahydrat, 10 mg/L Eisensulfat-Heptahydrat und 10 mg/L NaCl bei Einstellung des pH-Wertes auf 6,4. Clostridium basal Medium (CBM)70 enthielt 10 g/L Glucose, 0,5 g/L einbasisches Kaliumphosphat, 0,5 g/L zweibasisches Kaliumphosphat, 4 g/L Trypton, 0.2 g/l Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 10 mg/L Mangansulfat-Heptahydrat, 10 mg/L Eisensulfat-Heptahydrat, 1 mg/L Paraaminobenzoesäure, 1 mg/L Thiaminhydrochlorid und 2 µg/L Biotin bei pH-Einstellung auf 6,9. Für feste CGM-Platten wurden 15 g/L Agar zugegeben. CBM-S (für Flüssigsporulationstests verwendet) war identisch mit CBM, außer dass 50 g / l Glucose verwendet wurden und 5 g / l CaCO3 kurz vor der Inokulation der Kulturen zugegeben wurden. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) wurde in Luria-Bertani (LB) Medium bei 37°C gezüchtet. Für die entsprechenden Clostridiumstämme wurden Kulturmedien mit Erythromycin (Ery; 40 µg/ml für feste Medien, 80 µg/ml für flüssige Medien) und/oder Thiamphenicol (Th; 5 µg/ml für feste und flüssige Medien) ergänzt. Kanamycin (Kan; 60 µg/ml) oder Chloramphenicol (Cm; 25 µg/ml) wurden wie angegeben zu E. coli-Kulturmedien gegeben. Clostridium- und E. coli-Stämme wurden als 20% ige v/v-Glycerinvorräte bei -80 °C gelagert.

Plasmidkonstruktion

Oligonukleotide wurden durch integrierte DNA-Technologien bereitgestellt (Ergänzende Tabelle 5). Die Phasionspolymerase (NEB) wurde für alle PCR-Reaktionen verwendet. Zur Isolierung genomischer DNA aus C. acetobutylicum ATCC 824 wurde eine alkalische Lysemethode angewendet71. C. acetobutylicum wurde über Nacht in 2xYTG Medium zur stationären Phase kultiviert (OD600 > 2.0), wobei 10 ml Kultur 15 min bei 3500×g zentrifugiert wurden (Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 mL Setpuffer (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) resuspendiert. Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben und die Lösung vorsichtig gemischt. Die Mischung wurde 60 min bei 37°C inkubiert, wobei alle 15 min sanft gemischt wurde. Nach der Inkubationszeit wurden 660 µL Lysepuffer (1 M NaOH, 10% w/v SDS) zugegeben und die Lösung gründlich gemischt. Proteinase K wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben und die Lösung 1 h bei 55°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurde ein gleiches Volumen Phenol:Chloroform (1:1) zugegeben und die Lösung 5 min durch Inversion gemischt. Anschließend wurde die Lösung 15 min bei 3500×g zentrifugiert (Raumtemperatur) und die obere wässrige Phase durch Pipettieren verworfen. Zur organischen Phase wurden 3 M Natriumacetat zugegeben (10% v/v in Endlösung). Zur Präzipitation genomischer DNA wurden 2 Volumina Ethanol zugegeben und die Lösung gemischt. Gefällte genomische DNA wurde mit einem Glashaken gesammelt und mit 70% igem Ethanol gewaschen. Die gewaschene DNA wurde anschließend 15 min über Stickstoffgas getrocknet, in Low TE Puffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert und durch Inkubation bei 50°C gelöst.

Für die Konstruktion des Plasmids pKO_mazF_mod (das später als Vorlage für pKO_pks dienen sollte) wurden Primer pKON_Fo und pKON_Ro verwendet, um eine 5,0 kb-Region aus der pKO_mazF-Vorlage zu PCR-amplifizieren15. Dieser Schritt war notwendig, um eine 677 bp-Region aus dem pKO_mazF-Backbone zu entfernen, die wir nicht über PCR amplifizieren konnten. Das 5,0 kb PCR-Produkt wurde gelgereinigt, an den 5′- und 3′-Enden mit PshAI verdaut, zu pKO_mazF_mod ligiert und in E. coli TOP10 transformiert. Transformante Klone wurden durch gereinigten Plasmid-Testverdau gescreent, und Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Sequenz des endgültigen pKO_mazF_mod-Klons zu bestätigen. Zur Konstruktion des Plasmids pKO_pks (zur Deletion des pks-Gens aus C. acetobutylicum) wurde eine 3,8 kb-Region, die colE1, repL, bgaR und mazF enthielt, aus pKO_mazF_mod unter Verwendung der Primer pKO_F und pKO_R PCR amplifiziert. Zusätzlich wurden die Primer UHR_Fo und UHR_Ro sowie DHR_Fo und DHR_Ro verwendet, um 1 kb-Regionen, die die Upstream- und Downstream-homologen Regionen (UHR und DHR) flankierung des pks-Gens (CA_C3355) aus einem C. acetobutylicum ATCC 824 genomische DNA-Vorlage. Das Chloramphenicol/Thiamphenicol-Resistenzgen und der konstitutive Promotor (P ptb aus C. acetobutylicum) wurden aus pKO_mazF_mod unter Verwendung der Primer CMR_F und CMR_R (1,1 kb Region) PCR amplifiziert. Diese vier PCR-Produkte wurden über Gibson Assembly ligiert und in E. coli TOP10 transformiert. Transformante Klone wurden durch gereinigten Plasmid-Testverdau gescreent, und Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Sequenz des endgültigen pKO_pks-Klons zu bestätigen. Zur Konstruktion des Plasmids pAN315 (notwendig für die Methylierung von pKO_pks und pCKO_pks vor der Transformation in C. acetobutylicum), eine 6,4 kb-Region aus dem Plasmid pAN172 mit den Primern pAN1_F und pAN1_R und eine 1,0 kb-Region mit dem Kanamycin-Resistenzgen aus dem Vektor pCOLA_Duet mit den Primern KAN_Fo und KAN_Ro amplifiziert. Die gelextrahierten PCR-Produkte wurden über Gibson Assembly ligiert und in E. coli TOP10 transformiert. Transformante Klone wurden durch gereinigten Plasmid-Testverdau gescreent, und Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Sequenz des endgültigen pAN3-Klons zu bestätigen. Zum Aufbau des Plasmids pCKO_pks (zur Expression des pks-Gens unter dem konstitutiven Crotonase-Promotor aus C. acetobutylicum) wurden die Primer CPKS_Fo und CPKS_Ro verwendet, um das 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks Gen (CA_C3355) mit geeigneten Überhängen für die Gibson Assemblierung PCR zu amplifizieren. Das pWIS_empty vector71-Backbone (enthaltend den konstitutiven crt-Promotor stromaufwärts der multiplen Klonierungsstelle) wurde mit den Primern pWIS_F und pWIS_R PCR amplifiziert, was ein 5,0 kb Produkt ergab. Die beiden gelgereinigten PCR-Produkte wurden über Gibson Assembly ligiert und in E. coli TOP10 transformiert. Transformante Klone wurden durch gereinigten Plasmid-Testverdau gescreent, und Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Sequenz des endgültigen pCKO_pks-Klons zu bestätigen.

Zur Konstruktion des Plasmids pET24b_pks wurde das 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks Gen (CA_C3355) aus C. acetobutylicum genomischer DNA unter Verwendung der Primer PKS_Fo und PKS_Ro amplifiziert. Der doppelt verdaute Vektor pET24b (EcoRI/XhoI-verdaut) wurde mit dem doppelt verdauten pks-PCR-Produkt (EcoRI/XhoI-verdaut) ligiert und das Ligationsprodukt in E. coli TOP10 transformiert. Transformante Klone wurden durch gereinigten Plasmid-Testverdau gescreent, und Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Sequenz des endgültigen pET24b_pks-Klons zu bestätigen.

Elektrotransformation von C. acetobutylicum

Vor der Transformation in C. acetobutylicum wurde der Vektor pKO_pks mit pAN3 über Elektroporation in E. coli TOP10 co-transformiert. Diese Vorgehensweise ermöglichte die Methylierung von pKO_pks, die zur Überwindung des in C. acetobutylicum 72 aktiven nativen Restriktionsmodifikationssystems erforderlich war. Plasmidreinigung von E. coli pKO_pks / pAN3 Flüssigkultur wurde durchgeführt, und die resultierende Plasmidmischung wurde für Elektroporationen von C. acetobutylicum unter Verwendung der zuvor veröffentlichten Methode72 verwendet, die wir hier detailliert beschreiben. Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen wurde eine einzelne Kolonie von C. acetobutylicum aus einer 2xYTG-Platte (mehr als 1 Woche alt) 10 min lang bei 80 ° C hitzeschockt und zur Inokulation von 10 ml CGM verwendet. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ° C und Erreichen der mittleren exponentiellen Phase (OD600 0,4-0,9) wurden 6 ml Kultur verwendet, um 54 ml frisches 2xYTG zu inokulieren. Diese Subkultur wurde bei 37°C bis zum Erreichen von OD600 1 inkubiert.2 (~5 h), wobei die Subkultur bei 3500×g für 20 min (4°C) zentrifugiert wurde. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zellpellet in 20 ml eiskaltem Elektroporationspuffer (EPB; 270 mM Saccharose, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden 10 min bei 3500×g zentrifugiert (4°C), der Überstand verworfen und das Zellpellet in 20 ml eiskaltem EPB resuspendiert. Nach einer abschließenden Pelletierung durch Zentrifugation bei 3500×g für 10 min (4°C) wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 2,3 mL eiskaltem EPB resuspendiert. Diese letzte Resuspension wurde als Vorrat an elektrokompetenten Zellen verwendet. Elektrotransformationen wurden durchgeführt, indem zuerst 500 µL kompetente Zellen und ~ 20 µl zu transformierende Plasmid-DNA-Lösung (insgesamt 1-5 µg) (über Eis) gemischt wurden. Die Mischung wurde in eine 0,4 cm Elektroporationskuvette überführt und 15 min auf Eis inkubieren gelassen. Elektroporationen wurden mit folgenden Parametern durchgeführt: Spannung, 2000 V; Kapazität, 25 µF; Widerstand, unendlich Ω. Nach der Elektroporation wurden die Proben in 1 ml 2xYTG resuspendiert und in ein Röhrchen mit 9 ml 2xYTG überführt. Nach dem Mischen durch Inversion ließ man die Kulturen 4 h bei 37°C zurückgewinnen. Die Rückgewinnungskulturen wurden 15 min bei 3500×g zentrifugiert (Raumtemperatur) und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 500 µL 2xYTG resuspendiert und 100 µL auf feste 2xYTG-Platten, ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum, plattiert. Die Platte wurde 2-3 Tage bei 37 ° C inkubiert und Transformantenkolonien wurden einer PCR-basierten Verifikation unterzogen.

Deletion des pks-Gens und genetische Komplementierung

Gezielte Deletion des pks-Gens (ca_c3355) in C. acetobutylicum ATCC 824 wurde mit der zuvor veröffentlichten Methode15 erreicht. Im Einzelnen wurden 5 µg methyliertes pKO_pks/pAN3 Plasmidgemisch mit der oben beschriebenen Methode in C. acetobutylicum transformiert. Nach Rückgewinnung in flüssigem 2xYTG-Medium für 4 h wurden die Zellpellets durch Zentrifugation (3500×g, 15 min, Raumtemperatur) gesammelt, in 0,5 ml frischer flüssiger 2xYTG resuspendiert und 100 µL der resuspendierten Zellkultur auf feste 2xYTG + 5 µg/ml Th + 40 mm β-Lactose-Platten plattiert. Unter diesen Plattierungsbedingungen wird erwartet, dass nur Zellen überleben, die das gewünschte homologe Doppelkreuzungs-Rekombinationsereignis durchlaufen haben. Die Gegenselektion des Vektorrückgrats erfolgt durch den Lactose-induzierbaren Promotor (P bgaL ), der das Toxingen mazF auf dem pKO_pks-Vektorrückgrat antreibt. Nach diesem Plattierungsverfahren wurden ungefähr 10 Kolonien auf den 2xYTG + 5 µg / ml Th + 40 mM β-Lactose-Platten beobachtet. Von diesen 10 Kolonien wurden vier zweimal restreaked und einer Kolonie-PCR-Verifikation unterzogen. Vier Sätze von Primern wurden als Grundlage für die Kolonie-PCR-Verifikation verwendet, wie in der ergänzenden Abb. 2.

Zur Erzeugung des genetischen Komplementationsstamms pks wurde die Elektroporation von ∆pks C. acetobutylicum mit einer Plasmidmischung pCKO_pks/pAN3 wie oben beschrieben durchgeführt. Nach Elektroporation und Rückgewinnung wurden Kulturen auf festen 2xYTG + 5 µg / ml Th + 40 µg / ml Ery-Medien plattiert. Nach zweimaligem Restreaking auf festen 2xYTG + 5 µg/ml Th + 40 µg/ml Ery-Medien wurden potentielle Kolonien mit pCKO_pks mittels Kolonie-PCR mit den Primern pCKO_F und pCKO_R gescreent.

LC-HRMS metabolomische Analyse

Für ungezielte metabolomische Vergleiche von Wildtyp und ∆pks C. acetobutylicum wurden einzelne Kolonien jedes Stammes bei 80 ° C für 10 min hitzeschockt und verwendet, um 10 ml flüssiges CGM (30 g / L Glucose) zu inokulieren. Nach nächtlicher Inkubation (stagnierend) bis zum Erreichen von OD600 ~ 1,0 wurden diese Kulturen verwendet, um 10 ml flüssiges CGM (80 g / l Glucose) mit einem 10% igen Inokulum für die Subkultur zu inokulieren. Nach ~ 5 h (OD600 ~ 1.0) stagnierenden Wachstums wurden die Subkulturen zur Beimpfung von Vierfachkolbenfermentationen (70 ml CGM, 80 g/L Glucose + 5 µL Antifoam 204, 3% Inokulum), die über Magnetrührstäbe gerührt wurden, verwendet. Calciumcarbonat (6 g/l) wurde den Fermentationsmedien zur pH-Pufferung beigemischt. Die gesamte Kultivierung wurde bei 37 ° C durchgeführt. Etwa 5 µg / ml Th wurden in allen Kulturen von ∆pks mit Ausnahme der endgültigen Fermentationskultur eingeschlossen, da bestimmte Antibiotika bekanntermaßen die ABE-Fermentationsphasen stören. Von jedem Replikat wurden Proben Fermentationsbrühe (1 ml) während der stationären Phase entnommen und mit 3 ml 2:1 Chloroform-Methanol extrahiert. Die Mischungen wurden vortexiert, durch Zentrifugation getrennt (2700×g, 10 min) und die untere chloroformreiche Schicht in ein Glasfläschchen überführt. Diese organischen Extrakte wurden mit Stickstoffgas getrocknet, in 100 µL Methanol resuspendiert und 10 µL wurden auf ein Agilent Technologies 6520 Präzisions-QTOF LC-MS-Instrument injiziert, das mit einer Agilent Eclipse Plus C18-Säule (4,6 × 100 mm) ausgestattet war. Es wurde ein linearer Gradient von 2-98% CH3CN (vol/vol) über 40 min in H2O mit 0,1% Ameisensäure (vol/vol) bei einer Flussrate von 0,5 mL/min verwendet. Die metabolomische Analyseplattform XCMS16 (The Scripps Research Institute) wurde verwendet, um die Metabolome von Wildtyp- und ∆pks-Stämmen basierend auf den vierfachen LC-HRMS-Daten zu vergleichen. MS-Peaks einzigartig für ∆pks (Abb. 1a) wurden anhand folgender Parameter identifiziert: p-Wert < 0,01, Faltenänderung > 10,0, Peakintensität > 5000.

Bioreaktorfermentationen

Zum Vergleich der ABE-Fermentationsprofile von Wildtyp und ∆pks C. acetobutylicum wurden Bioreaktorfermentationen in DASGIP Bioreaktoren (4× GPI 100 Gefäße, DASGIP Bioblock System) mit 500 ml Arbeitsvolumen durchgeführt. Über Nachtkulturen (10 ml CGM, 30 g / l Glucose, stagnierend, 34 ° C), die mit Hitze inokuliert wurden, einzelne Kolonien von C. acetobutylicum wurden bis zum Erreichen von OD600 ~ 1 kultiviert. Ein 10% iges Inokulum wurde dann verwendet, um eine Subkultur zu starten (30 ml P2-Medien, 80 g / L Glucose, stagnierend, 34 ° C), und die Subkultur wurde inkubiert, bis OD600 ~ 1 erreicht war. Die 30 ml Subkulturen wurden dann aseptisch in einzelne DASGIP-Bioreaktoren überführt, die mit 500 ml P2-Medium (80 g/L Glucose, 100 µL Antifoam 204, 34°C) vorbeladen waren. Die Fermentationen wurden für 54 h mit periodischen Probenahmen für optische Dichtemessungen, Fermentationsproduktanalyse und Quantifizierung der Verbindungen 1, 2 und 3 fortgesetzt. Die Temperatur wurde während der gesamten Fermentation bei 34°C gehalten, durch Rühren bei 200 U/min gerührt und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 3 M NH4OH über 5,0 gehalten. Zur Aufrechterhaltung anaerober Bedingungen wurde für die Dauer der Fermentation sauerstofffreies Stickstoffgas mit einer Geschwindigkeit von 2 sL/h gespart. Zur Quantifizierung der Verbindungen 1, 2 und 3 wurde 1 mL Fermentationsbrühe mit 3 ml Ethylacetat versetzt, vortext, durch Zentrifugation abgetrennt (2700×g, 10 min, Raumtemperatur) und die obere organische Schicht isoliert. Die organische Schicht wurde durch Rotationsverdampfung getrocknet, in 200 µL Methanol resuspendiert und 20 µL auf ein Agilent Technologies 6120 Quadrupol LC-MS (mit DAD) Instrument injiziert, das mit einer Agilent Eclipse Plus C18 Säule (4,6 × 100 mm) ausgestattet war. Es wurde ein linearer Gradient von 2-98% CH3CN (vol/vol) über 40 min in H2O mit 0,1% Ameisensäure (vol/vol) bei einer Flussrate von 0,5 mL/min verwendet. Die Verbindungen 1, 2 und 3 wurden durch UV-Absorption (240 nm) identifiziert, wie in Fig. 1b und wurden durch die integrierte Peakfläche (Absorption bei 240 nm) quantifiziert.

Fermentation analytical procedures

Ein Spektralphotometer wurde verwendet, um die Zelldichten durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) zu bestimmen. Zur Analyse von C wurde ein Shimadzu Prominence UFLC-System verwendet, das mit einer Biorad Aminex HPX-87H-Säule (300 mm × 7,8 mm) ausgestattet war. acetobutylicum-Fermentationsbrühe zur Konzentration von Glucose und Fermentationsprodukten (Acetat, Butyrat, Lactat, Aceton, Butanol und Ethanol). Proben von Fermentationsbrühe (1 ml) wurden zuerst durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 3 min pelletiert, gefolgt von Filtration des Überstandes mit einem 0,22 mikron PVDF-Spritzenfilter. Proben von filtriertem Überstand (20 µL) wurden mit 0,01 N Schwefelsäure-Laufmittel bei 0,7 ml/min, Säulentemperatur von 35°C, auf das UFLC-System injiziert und 35 min chromatographiert. Analyten wurden unter Verwendung eines Brechungsindexdetektors (zur Quantifizierung der Konzentrationen von Glucose, Acetat, Lactat, Butanol und Ethanol) und eines Diodenarray-Detektors (zur Quantifizierung der Konzentrationen von Butyrat) nachgewiesen (208 nm) und Aceton (265 nm)).

RNA-Isolierung und RNA-Seq-Analyse

Proben (10 ml) Fermentationsbrühe wurden in biologischem Triplikat aus Bioreaktorfermentationen von Wildtyp und ∆pks C. acetobutylicum 26 h nach Inokulation entnommen. Die Proben wurden zentrifugiert (4000×g, 10 min, 4°C) und die Pellets wurden resuspendiert und in RNAprotect Zellreagenz (Qiagen) gelagert. Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Eine DNase-Behandlung an der Säule wurde mit DNase I (rnasefrei) (NEB) durchgeführt. Die RNA-Qualitätskontrolle, der Bibliotheksbau und die Bibliothekssequenzierung wurden vom QB3 Functional Genomics Laboratory der University of California-Berkeley und vom Vincent J. Coates Genomic Sequencing Laboratory durchgeführt. Die RNA-Qualität und -konzentration wurde mit einem Nanochip auf einem Agilent 2100 Bioanalysator bewertet. Bakterielle 16S- und 23S-rRNA wurde mit einem RiboZero-Kit (Illumina) entfernt. Die resultierende Boten-RNA (mRNA) wurde mit einem mRNA-Seq Library Construction Kit (Illumina) in eine RNA-Seq-Bibliothek umgewandelt. Die RNA-Bibliothekssequenzierung wurde an einem Illumina HiSeq4000 mit 50 bp Single End Reads durchgeführt. Sequenzierungslesungen (50 bp) wurden verarbeitet und auf das C. acetobutylicum ATCC 824-Genom (NCBI, NC_003030.1 und NC_001988.2) mit CLC Genomics Workbench 9.0 mit Standardparametern abgebildet. Reads, die nicht eindeutig auf das Genom ausgerichtet waren, wurden verworfen. Unterschiede in der Genexpression zwischen Wildtyp und ∆pks C. acetobutylicum wurden mit derselben Software berechnet. Gene wurden als differentiell exprimiert mit p-Wert < 0,003 (basierend auf einem ungepaarten t-Test, n = 3) und | normalisierte Faltenänderung |> 2,0. Korrekturen der falschen Entdeckungsrate an p-Werten wurden in CLC Genomics Workbench 9.0 unter Verwendung einer veröffentlichten Methode73 berechnet. Die Ergebnisse der RNA-Seq-Analyse sind in Supplementary Data 1 dargestellt. STRING-Analyse30 wurde durchgeführt, um mutmaßliche Protein–Protein-Wechselwirkungen zwischen den differentiell exprimierten Genen zu bestimmen, die durch RNA-Seq-Analyse aufgedeckt wurden.

Phänotypvergleichstests

Flüssigsporulationstests wurden mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt74. Aus biologischen Triplikat-Flüssigkulturen wurden nach 5-tägiger Inkubation Proben entnommen (30 ml CBM-S, 37°C). Die 20 µL Proben wurden hitzeschockt (80 ° C, 10 min), Verdünnungen (101-106) wurden auf 2xYTG-Platten entdeckt und Kolonien wurden nach 30 h Inkubation (37 ° C) aufgezählt, um die Anzahl der hitzebeständigen koloniebildenden Einheiten (kbe / ml) zu berechnen. Zur chemischen Komplementierung von ∆pks im Liquid sporulation Assay wurde gereinigte Clostrienose (Endkonzentration 3,5 µM) in CBM-S Kulturen von ∆pks C. acetobutylicum zum Zeitpunkt der Inokulation supplementiert. Da Verbindung 3 als konzentrierte Lösung in Methanol zugegeben wurde, wurde das äquivalente Volumen an Methanol (60 µL) zu allen anderen flüssigen Sporulationsassaykulturen (Wildtyp- und nicht-komplementierte ∆pks) gegeben, um diesen Effekt zu kontrollieren.

Für feste Sporulationstests wurde eine zuvor beschriebene Methode75 mit einigen Modifikationen verwendet. Im Detail wurden einzelne Kolonien unter Hitzeeinwirkung (80°C, 10 min) in flüssigen Medien (10 ml CGM, 37°C) für 24 h kultiviert. Kulturen wurden um den Faktor 106 verdünnt und auf festes CBM plattiert. Die Probenahme erfolgte 1, 2, 3, 4 und 6 Tage nach der ersten Plattierung. Zur Probenahme wurden drei einzelne Kolonien vereinigt und in 60 µL flüssigem CGM gründlich resuspendiert. Anschließend wurden 20 µL des resuspendierten Kolonieansatzes hitzeschockiert (80°C, 10 min), Verdünnungen (101-106) auf 2xYTG-Platten getupft und Kolonien nach 30 h Inkubation (37°C) zur Berechnung der Anzahl hitzebeständiger koloniebildender Einheiten (kbe/Kolonie) aufgezählt. Alle Proben wurden als biologische Triplikate durchgeführt.

Granuloseakkumulationstests wurden mittels Jodfärbung durchgeführt53. Mid-Log-Phase (OD600 ~ 0,6) Flüssigkulturen (P2, 37 ° C) wurden auf festem 2xYTG-Medium mit erhöhten Glucosespiegeln (50 g / l) plattiert, um die Granuloseproduktion zu ermöglichen. Die Platten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert, dann durch 10 min. Einwirken auf ein Bett aus Jodkristallen gefärbt. Die Platten wurden dann für 10 min vor der Abbildung destin gelassen. Zur chemischen Ergänzung von ∆pks im Granuloseakkumulationstest wurde gereinigte Clostrienose (Endplattenkonzentration 4,0 µM) vor dem Plattieren der ∆pks-Kultur in feste 2xYTG-Platten eingebettet. Da Clostrienose zu 2xYTG-Platten als konzentrierte Lösung in Methanol gegeben wurde (vor der Erstarrung in die geschmolzenen Medien eingemischt), wurde das äquivalente Volumen an Methanol (6 µL) zu allen anderen 2xYTG-Platten gegeben, die in den Granulat-Akkumulationstests verwendet wurden, um diesen Effekt zu kontrollieren.

Einzelne Kolonien von C. acetobutylicum, die auf CBM-Platten für 48 h (37 ° C) kultiviert wurden, wurden mit einem Leica MZ16 F-Dissektionsmikroskop, das mit einer Leica DFC300 FX-Kamera ausgestattet war, betrachtet und abgebildet.

Ölspreizuntersuchungen wurden wie zuvor beschrieben76,77,78 durchgeführt. Im Detail wurde ein 400 ml Glasbecher (7,5 cm Innendurchmesser) mit 300 ml Wasser gefüllt und ein 10 µL Tropfen Paraffinlampenöl zugegeben und über einen Zeitraum von 5 min (~ 25 mm Durchmesser) zu einem dünnen Film auf der Wasseroberfläche verteilt. Lösungen von Surfactin, gereinigter Clostrienose und einer Kaliumphosphatpufferkontrolle wurden bei dem angegebenen pH-Wert und der angegebenen Konzentration (hergestellt in 10 mM Kaliumphosphatpuffer) hergestellt. Etwa 10 µL Probe wurden vorsichtig in die Mitte des Ölfilms gegeben, und die Wirkung auf den Ölfilm wurde beobachtet. Es wird erwartet, dass Proben mit Tensidaktivität stabile kreisförmige Klärzonen im Ölfilm bilden, wobei eine stärkere Tensidaktivität größeren Klärzonen entspricht (oder eine vollständige Dispersion des Ölfilms für sehr hohe Tensidaktivität). Drop Collapse Assays wurden durchgeführt77,79,80. Kreisförmige Mikrotiter (8 mm Innendurchmesser) innerhalb des Polystyroldeckels einer 96-Mikrotiterplatte (12,7 × 8,5 cm) wurden mit einer dünnen Schicht Paraffinlampenöl beschichtet, indem 2,0 µL Paraffinlampenöl in jede Vertiefung gegeben wurden und sich das Tröpfchen über einen Zeitraum von 1 h gleichmäßig über die Mikrotiter verteilen ließ. Proben von Surfactin, gereinigter Clostrienose und Kaliumphosphatkontrolle wurden wie für die Ölspreiztests vorbereitet. Etwa 5 µL Probe wurden vorsichtig in die Mitte des Mikrotiters gegeben. Nach 5 min wurden Form und Ausbreitungsgrad des Tropfens beobachtet. Während erwartet wird, dass Pufferkontrollen stabile Kügelchen auf der Mikrotiteroberfläche bilden, wird erwartet, dass Proben, die Tensid enthalten, kollabieren und sich über die Mikrotiteroberfläche ausbreiten, wobei eine stärkere Tensidaktivität einem höheren Grad an Tröpfchenausbreitung entspricht.

Reinigung und In-vitro-Analyse von PKS-Protein

Zur Reinigung des His6-markierten PKS-Proteins für die In-vitro-Analyse wurde pET24b_pks in E. coli BAP1 transformiert. Eine einzelne Kolonie wurde in 10 ml LB + 50 µg / ml Kanamycin (Kan) für das Wachstum über Nacht bei 37 ° C inokuliert. Etwa 7 ml Übernachtkultur wurden verwendet, um 700 ml LB + 50 µg / ml Kan zu inokulieren, und die Kultur wurde bei 240 U / min und 37 ° C geschüttelt, bis OD600 von 0,5 erreicht wurde. Nach Vereisung der Kultur für 10 min wurde Isopropylthio-β-d-galactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0 zugegeben.1 mM, um die Proteinexpression zu induzieren, und die Kultur wurde 16 h bei 16°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5500×g, 4°C, 20 min) geerntet, in 25 ml Lysepuffer (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM Imidazol) resuspendiert und durch Homogenisierung über Eis lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (17.700×g, 4°C, 60 min) entfernt und der Überstand (2 ml/L Kultur) mit Ni-NTA-Agaroseharz versetzt. Die Mischung wurde 1 h bei 4°C inkubiert, auf eine Schwerkraftsäule geladen und das PKS-Protein mit steigenden Konzentrationen von Imidazol in Puffer A (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT) eluiert. Gereinigtes PKS-Protein wurde konzentriert und Puffer in Puffer A + 10% Glycerin mit einem Vivaspin Zentrifugalkonzentrator ausgetauscht. Aliquots von gereinigtem PKS-Protein wurden aliquotiert und in flüssigem Stickstoff blitzgefroren. Die ungefähre Proteinausbeute betrug 5 mg/L (203 kDa).

Ein PKS-Beladungsassay mit 14C-markiertem Substrat enthielt in einem Gesamtvolumen von 15 µL 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-Malonsäure (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS und 50 mM HEPES, pH 8,0. Nach 2 h Inkubation bei 25°C wurden die Proben durch Zugabe eines gleichen Volumens 1× SDS-Probenpuffers abgeschreckt. Nach SDS-PAGE-Analyse mit einem 4-15%igen TGX-Gel (Kriterium) wurde das Gel 2 h bei 50°C getrocknet und 5 Tage auf einem Speicherleuchtstoffsieb (20 ×25 cm; Molekulardynamik) belichtet. Radioaktiv markiertes Protein wurde auf einem Typhoon 9400 Phosphorimager (Speicherleuchtstoffmodus, 50 µm Auflösung; Amersham Biosciences) abgebildet.

Für In-vitro-Produktassays (50 µL) des PKS-Proteins wurden 8 µM PKS mit Malonyl-CoA (2 mM) in Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert, um Verbindung 4 zu erzeugen, identifiziert durch Vergleich mit einem chemischen Standard. NADPH (2 mM) wurde dem Assay zugesetzt, um die Verbindungen 5 und 6 zu erzeugen, die beide durch Vergleich mit chemischen Standards identifiziert wurden. Nach Inkubation wurden die Assay-Gemische zweimal mit 100 µL 99%-igem Ethylacetat/1%-iger Essigsäure (v/v) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet und in 100 µL Methanol resuspendiert, und 10 µL wurden auf ein Agilent Technologies 6120 Quadrupol LC-MS (mit DAD) Instrument injiziert, das mit einer Agilent Eclipse Plus C18 Säule (4,6 × 100 mm) ausgestattet war. Es wurde ein linearer Gradient von 2-98% CH3CN (vol/vol) über 40 min in H2O mit 0,1% Ameisensäure (vol/vol) bei einer Flussrate von 0,5 mL/min verwendet. Die LC-HRMS-Analyse der Assay-Extrakte wurde an einem Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS-Instrument durchgeführt, das mit einer Agilent Eclipse Plus C18-Säule (4.6 × 100 mm) mit dem gleichen Lösungsmittelgradienten und der gleichen Flussrate wie oben beschrieben.

Datenverfügbarkeit

Die in dieser Studie generierten RNA-seq-Daten wurden in ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) unter der Zugangsnummer E-MTAB-6019 hinterlegt. Alle weiteren relevanten Daten sind bei den Autoren auf Anfrage erhältlich.