Clemizol und Modulatoren der Serotoninsignalisierung unterdrücken Anfälle beim Dravet-Syndrom

Zusammenfassung

Das Dravet-Syndrom ist eine katastrophale Epilepsie im Kindesalter mit früh einsetzenden Anfällen, verzögerter sprachlicher und motorischer Entwicklung, Schlafstörungen, angstähnlichem Verhalten, schwerem kognitivem Defizit und erhöhtem Todesrisiko. Es wird hauptsächlich durch De-novo-Mutationen des SCN1A-Gens verursacht, das für einen neuronalen spannungsaktivierten Natriumkanal kodiert. Zebrafische mit einer Mutation im SCN1A-Homolog rekapitulieren die spontane Anfallsaktivität und ahmen die beim Dravet-Syndrom beobachteten krampfhaften Verhaltensbewegungen nach. Hier zeigen wir, dass das phänotypische Screening von Wirkstoffbibliotheken in Zebrafisch-scn1-Mutanten schnell und erfolgreich neue Therapeutika identifiziert. Wir zeigen, dass Clemizol an Serotoninrezeptoren bindet und seine antiepileptische Aktivität durch Medikamente, die auf Serotonin-Signalwege wirken, z.B. Trazodon und Lorcaserin, nachgeahmt werden kann. Zeitgleich mit diesen Zebrafisch-Befunden behandelten wir fünf medizinisch schwer behandelbare Dravet-Syndrom-Patienten mit einem klinisch zugelassenen Serotonin-Rezeptor-Agonisten (Lorcaserin, Belviq®) und beobachteten einige vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf die Verringerung der Anfallshäufigkeit und / oder Schwere. Unsere Ergebnisse zeigen einen schnellen Weg von der präklinischen Entdeckung bei Zebrafischen über die Zielidentifikation bis hin zu potenziellen klinischen Behandlungen für das Dravet-Syndrom.

Einleitung

Epilepsien im Kindesalter, die als katastrophal eingestuft werden, sind häufig mit einer genetischen Mutation verbunden. Unter diesen wurde das Dravet-Syndrom mit mehr als 600 de-novo-Mutationen in einem einzigen Gen, SCN1A, in Verbindung gebracht (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Kinder mit dem Dravet-Syndrom zeigen bereits im Alter von 6 Monaten Krampfanfälle, eine verzögerte sprachliche und motorische Entwicklung, Schlafstörungen, angstähnliches Verhalten und ein schweres kognitives Defizit (Dravet, 2011). Symptome einer Autismus-Spektrum-Störung wurden ebenfalls berichtet (Li et al., 2011) und das Risiko für einen plötzlichen ungeklärten Tod mit Epilepsie (SUDEP) in dieser Population wird auf das 15-fache höher geschätzt als bei anderen Epilepsien im Kindesalter (Kearney, 2013). Verfügbare Antiepileptika bieten keine ausreichende Anfallskontrolle und resektive neurochirurgische Verfahren sind in der Regel keine Option. Neue Behandlungen für das Dravet-Syndrom bleiben trotz einer gewissen Wirksamkeit in begrenzten klinischen Studien für Cannabidiol (Epidiolex®) und Stiripentol (Diacomit®), die mit kognitiven oder appetitlichen Sicherheitsbedenken verbunden sein können, ein wichtiger ungedeckter Bedarf (Perez et al., 1999; In: Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

Mutationen in SCN1A, einem Gen, das für die porenbildende α-Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natriumkanals (Nav1.1) kodiert, wurden bei fast 85% der Patienten mit Dravet-Syndrom identifiziert (Dravet, 2011). Nav1.1-Kanäle tragen zur schnellen Depolarisation neuronaler Membranen bei, die während der Aktionspotentialerzeugung beobachtet werden (Hodgkin et al., 1952). Mäuse, die heterozygot für eine Funktionsverlustmutation in Nav1.1 sind, entwickeln früh im Leben spontane und temperaturempfindliche Anfälle und sterben vorzeitig um den postnatalen Tag 25 (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Akute elektrophysiologische Studien an diesen und verwandten Scn1a-defizienten Mäusen deuten auf eine Verringerung der Natriumstromdichte und eine damit verbundene Abnahme der Zündaktivität für eine Subpopulation von GABA-exprimierenden inhibitorischen Neuronen (aber nicht exzitatorischen Hauptzellen) hin, die zu einer verringerten synaptischen Hemmung und Netzwerkübererregbarkeit führen (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Diese Hypothese der Interneuronopathie stimmt mit anderen Formen katastrophaler Epilepsien im Kindesalter überein und wurde bei Mäusen bestätigt, bei denen Scn1a selektiv aus Parvalbumin- oder Somatostatin-exprimierenden Interneuron-Subpopulationen deletiert wurde (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autistische Verhaltensweisen wurden auch bei diesen Mäusen berichtet (Han et al., 2012). Interessanterweise berichteten erste Studien an menschlichen exzitatorischen und inhibitorischen Neuronen, die mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie von zwei Patienten mit Dravet-Syndrom abgeleitet wurden, über Defizite im spannungsaktivierten Natriumstrom für beide Zelltypen, was entweder auf eine homöostatische Kompensation für den frühen Funktionsverlust eines kritischen gehirnspezifischen Natriumkanals hindeutet oder zusätzliche Mechanismen, die zum epileptischen Phänotyp beitragen, der bei diesen Patienten beobachtet wurde (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

Obwohl Mäuse und aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitete Neuronen zu unserem Verständnis der zugrunde liegenden Pathophysiologie des Dravet-Syndroms beitragen, sind diese Systeme aufgrund der Variabilität dieser Modelle und der Reproduzierbarkeit quantitativer Messungen nicht gut für die schnelle Identifizierung neuer Therapien geeignet. Da Zebrafische ein ideales Wirbeltiermodellsystem für die Durchführung von auf niedermolekularen Phänotypen basierenden Screenings sind (MacRae et al., 2015) und Genmanipulationen zugänglich sind, konzentrierten wir unsere Bemühungen auf eine Zebrafisch-Natriumkanalmutante. Zebrafischmutanten mit einer Funktionsverlust-Missense-Mutation im SCN1A-Ortholog, scn1Lab, wurden in einem Mutagenesescreening identifiziert (Schoonheim et al., 2010). Aufgrund einer ancestralen Duplikation des gesamten Genoms sind Zebrafisch-scn1Lab-Mutanten haploineffizient für Nav1.1 und analog zu Scn1a +/− Mäusen oder Patienten mit Dravet-Syndrom. Krampfhaftes Verhalten und Episoden kurzer interiktaler und lang anhaltender Polyspike-iktal-ähnlicher elektrographischer Entladung werden bei mutierten Larven bereits 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) mit Fortschreiten zu robusteren Anfallsphänotypen zwischen 4 und 7 dpf beobachtet (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Mutierte Larven sterben vorzeitig ab, zeigen metabolische Defizite (Kumar et al., 2016) und sind resistent gegen viele Antiepileptika (AED) (Dinday et al., 2015). Ähnlich wie bei der klinischen Behandlung des Dravet-Syndroms kann eine gewisse Abschwächung der Anfallsaktivität mit Valproat, Benzodiazepinen, Bromiden, Stiripentol sowie einer ketogenen Diät erreicht werden (Baraban et al., 2013). Mit scn1Lab-mutierten Zebrafischlarven und einer zweistufigen Phänotyp-basierten Screening-Strategie haben wir jetzt mehr als 2300 Verbindungen gescreent. Clemizol, ein Histaminrezeptor (H1) -Antagonist der ersten Generation, wurde als potenter Inhibitor der verhaltens- und elektrographischen Anfallsaktivität identifiziert (Baraban et al., 2013). Antihistaminika sind jedoch bei pädiatrischen Epilepsiepopulationen kontraindiziert (Miyata et al., 2011) und das H1-Rezeptoranalogon im Zebrafisch zeigt weniger als 50% Ähnlichkeit mit dem Menschen (Peitsaro et al., 2007). Hier verwenden wir präklinische Zebrafischmodelle, um zu zeigen, dass Clemizol, aber keine Antihistaminika, antiepileptische Aktivität ausüben. Auf der Grundlage der Ligandenbindung und des zusätzlichen gezielten Wirkstoffscreenings bei scn1-mutierten Zebrafischen identifizierten wir mehrere Serotonin (5-HT) -Modulatoren als wirksam bei der Unterdrückung von Anfällen, darunter zwei von der FDA zugelassene Verbindungen (Trazodon und Lorcaserin). Lorcaserin (Belviq®) wurde Kindern mit Dravet-Syndrom im Rahmen eines Compassionate-Use-Programms verschrieben und führte bei einigen Patienten zu einer verminderten Anfallsaktivität. Wir schlagen vor, dass die Modulation der 5-HT-Signalgebung eine neuartige therapeutische Intervention für diese katastrophale Epilepsie im Kindesalter darstellt.

Materialien und Methoden

Zebrafischpflege

Anfallsüberwachung

Bei 5 dpf wurden einzelne Zebrafischlarven in eine einzelne Vertiefung einer klaren 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden gegeben, die Embryomedien enthielt. Die Larven wurden zufällig ausgewählt, da eine Geschlechtsbestimmung in diesem Stadium nicht möglich ist. Mikroplatten wurden in das Nanovision Motion-Tracking-Gerät gelegt und für 20 min bei Raumtemperatur akklimatisiert. Locomotion Plots wurden für jede Vertiefung während einer Aufzeichnungsperiode von 10 min unter Verwendung eines DanioVision-Systems mit EthoVision XT-Software (DanioVision, Noldus Information Technology) erhalten; die Schwellenwertdetektionseinstellungen zur Identifizierung von Objekten, die dunkler als der Hintergrund sind, wurden für jedes Experiment optimiert. Die Krampfbewertung wurde unter Verwendung der folgenden dreistufigen Skala durchgeführt, die für Pentylentetrazol-induzierte Anfälle festgelegt wurde (Baraban et al., 2005): Stadium 0, keine oder sehr geringe Schwimmaktivität; Stadium I, erhöhte, kurze Anfälle von Schwimmaktivität; Stadium II, schnelles ’strudelartiges‘ kreisendes Schwimmverhalten; und Stadium III, paroxysmale Ganzkörper-Klonus-ähnliche Krämpfe und ein kurzer Verlust der Körperhaltung. Wildtyp-Fische werden normalerweise in Stufe 0 oder I bewertet. Die Diagramme wurden für die zurückgelegte Strecke (in Millimetern) und die mittlere Geschwindigkeit (in Millimetern pro Sekunde) analysiert. Wie bereits berichtet (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013) waren Geschwindigkeitsänderungen der empfindlichste Test für das Anfallsverhalten.

Für elektrophysiologische Untersuchungen wurden Zebrafischlarven kurzzeitig mit α-Bungarotoxin (1 mg/ml) gelähmt und in 1,2% iger Agarose immobilisiert; lokale Feldpotentialaufnahmen wurden aus Vorderhirnstrukturen unter Verwendung einer Einzelelektrodentechnik erhalten, wie zuvor beschrieben (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Agarose-eingebettete lokale Feldpotentialaufzeichnungssitzungen von 10 bis 30 min wurden für jeden Fisch bei 1 kHz erhalten. Das iZAP-System (Hong et al., 2016) wurde zur nichtinvasiven Langzeitüberwachung von Zebrafischen in Abwesenheit eines Lähmungsmittels verwendet. Das System fängt autonom mehrere Zebrafischlarven unter mehreren integrierten Oberflächenelektroden in den mikrofluidischen Kammern ein. scn1Lab-Larven wurden 5 h lang kontinuierlich überwacht. Das elektrische Feldpotential wurde kontinuierlich bei 1 kHz aufgezeichnet, mit Ausnahme von 2 bis 3 Minuten Pause für den Medienwechsel für die Compound-Behandlung und das Waschen. Die aufgezeichneten Daten wurden unter Verwendung von MATLAB für Feldpotentialdiagramme und Frequenzanalyse analysiert.

Compound Library Screening

Compounds für das Drug Screening wurden von Selleck Chemicals bezogen und als 10 mM DMSO-Lösungen bereitgestellt. Sellecks Ionenkanal-Ligandenbibliothek (Katalog # L2700), GPCR-Verbindungsbibliothek (Katalog # L2200) und eine kundenspezifische 5-HT-Modulationsbibliothek wurden für das Screening verwendet. Die Verbindungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. In allen Arzneimittelbibliotheksbildschirmen wurden Verbindungen codiert und Experimente von Forschern durchgeführt, die für die Art der Verbindung blind waren. Baseline-Aufzeichnungen des Fortbewegungsverhaltens wurden von Mutanten in Embryonenmedien erhalten, wie oben beschrieben; Nach einem Lösungswechsel zu einer Testverbindung und einer Äquilibrierungsperiode von 20 min wurde dann ein zweites Fortbewegungsplot erhalten. Verbindungen für Fortbewegungsstudien wurden in embryonalen Medien gelöst und in einer Konzentration von 250 µM mit einer endgültigen DMSO-Konzentration von 2,5% getestet.

Kriterien für eine positive Trefferbezeichnung waren wie folgt: (i) eine Abnahme der mittleren Geschwindigkeit von ≥40%; und (ii) eine Verringerung des Anfallsverhaltens im Stadium 0 oder Stadium I im Bewegungsdiagramm für mindestens 50% der Testfische. Jede Testverbindung, die im Locomotion Assay als ‚positiver Treffer‘ eingestuft wurde, wurde nach einer 90-minütigen Arzneimittelexposition durch direkte Visualisierung auf einem Stereomikroskop auf Toxizität untersucht. Toxizität (oder Mortalität) wurde definiert als kein sichtbarer Herzschlag oder Bewegung als Reaktion auf externe Stimulation bei mindestens 50% der Testfische. Übererregbarkeit wurde definiert als eine Verbindung, die bei mindestens 50% der Testfische eine ≥40% ige Erhöhung der Schwimmgeschwindigkeit und / oder der Anfallsaktivität im Stadium III verursacht. Positive Treffer, die im primären Locomotion-Screening identifiziert wurden, wurden unter Verwendung der Locomotion-Screening-Methode in einem zweiten Assay mit einer unabhängigen Kupplung von Zebrafischen bestätigt. Die Verbindungen wurden dann separat von Sigma-Aldrich gekauft und mit der Locomotion-Screening-Methode zum dritten Mal an einer unabhängigen Kupplung von Zebrafischen getestet. Arzneimittel, die die mittlere Schwimmgeschwindigkeit über dem Schwellenwert reduzierten und in den drei unabhängigen Fortbewegungstests nicht toxisch waren, wurden unter Verwendung des elektrophysiologischen Tests weiter analysiert. In elektrophysiologischen Studien wurden Medikamente zunächst in einer Konzentration von 250 µM mit dem Locomotion Assay bestätigt und dann der gleiche Zebrafisch mit einer lokalen Feldpotentialaufzeichnung ausgewertet. Alle Screenings wurden mit codierten Verbindungen durchgeführt und von Forschern analysiert, die für die Identität der Verbindung geblendet waren.

Phylogenetische Analyse

Die phylogenetische Analyse von humanen HTR2- und Zebrafisch-Htr2-Proteinsequenzen wurde mit der PhyML-Software unter den SH-like Likelihood-Ratio-Testparametern (http://www.phylogeny.fr/) durchgeführt (Dereeper et al., 2008). Proteinsequenzen wurden von Ensembl human HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) und Zebrafisch htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b ( ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSDART00000024191) Sequenzen.

Quantitative Echtzeit-mRNA-Expressionsanalyse

Die Expressionsniveaus von Zebrafisch-htr2-Genen wurden unter Verwendung von RNA untersucht, die aus 25 Köpfen oder Schwänzen von 5 dpf-Wildtyp- oder scn1Lab-homozygoten mutierten Larven und sezierten Gehirnen von einzelnen Wildtyp-erwachsenen männlichen Zebrafischen gepoolt wurde. Die Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol®-Reagenz (Invitrogen) gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert und mit DNase I (Invitrogen) behandelt. Gereinigte mRNA wurde unter Verwendung des SuperScript®III-Erststrangsynthesesystems (Invitrogen) mit einer Mischung aus Oligo (dT) 20 in cDNA retrotranskribiert. Die Expressionsniveaus der Zebrafisch-htr2-Gene und des Housekeeping-Gens eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, like 1 (eef1a1l1) wurden mit einer StepOne ™ Real-Time PCR-Maschine (Applied Biosystems) bestimmt. Die Reaktionen wurden in 20 µl Volumen auf 96-well Platten mit SYBR®Green Master Mix (Applied Biosystems), mit 250 nM Primer und 3 µl cDNA durchgeführt. Oligonukleotidsequenzen sind in ergänzender Tabelle 2 aufgeführt. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten analysiert. Die Daten wurden als Ct-Werte ausgedrückt und zur Bestimmung von ΔCt-Werten verwendet.

Humanstudien

Nach erfolgreicher Identifizierung von Verbindungen in unserem Zebrafischmodell und Berücksichtigung der Pharmakokinetik wurde Kindern Belviq® (Lorcaserin) im Rahmen eines Compassionate-Use-Protokolls im Children’s Hospital Colorado (IND 125307) verschrieben. Kinder, die für die Anwendung von Belviq® qualifiziert waren, wenn sie eine SCN1A-Mutation oder eine klinische Diagnose des Dravet-Syndroms hatten und mindestens zwei Medikamente, einschließlich Stiripentol in einigen Fällen und ohne Natriumkanalblocker, versagten. Kinder mussten zu Studienbeginn und alle 6 Monate während der Anwendung des Produkts ein Elektrokardiogramm und ein Echokardiogramm erhalten. Darüber hinaus mussten sie alle 3 Monate Nachuntersuchungen durchführen, um ein angemessenes Wachstum sicherzustellen und auf zusätzliche Nebenwirkungen zu prüfen. Labortests waren alle 6 Monate erforderlich, um hämatologische Tests, Leberfunktionstests und Nierenfunktionstests einzuschließen. Die Belviq®-Dosis wurde mit 2, 5 mg vor dem Schlafengehen begonnen und bei Bedarf wöchentlich schrittweise auf eine Höchstdosis von 10 mg zweimal täglich oder 0, 3 mg / kg / Tag erhöht — je nachdem, was zuerst auftrat.

Die Genehmigung des Institutional Review Board für die retrospektive Datenerhebung einschließlich eines Verzichts auf die Zustimmung wurde eingeholt. Die Daten wurden aus einer retrospektiven Überprüfung der elektronischen Krankenakten im Children’s Hospital Colorado extrahiert, einschließlich Alter, Anfallsarten und Häufigkeit vor und nach der Anwendung von Belviq®, Nebenwirkungen, Dosis von Belviq® und gleichzeitige Einnahme von Medikamenten.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Zum Vergleich zwischen zwei Gruppen Student T-Test wurden verwendet. Wenn die Varianz keine Normalverteilung hatte, wurde der nichtparametrische Mann-Whitney-U-Test verwendet. Einweg-ANOVA nach Dunnetts Mehrfachvergleichstest zur Analyse gegen eine Kontrollprobe oder Holm-Sidak paarweise Mehrfachvergleiche zwischen Mittelwerten. Unterschiede, die als statistisch signifikant angesehen werden, sind mit Sternchen gekennzeichnet (*P < 0,05; **P < 0,01).

Ergebnisse

Wirkung von Clemizol auf das Anfallsverhalten bei Zebrafischen

Wir behandelten scn1Lab-mutierte Larven (5 dpf) mit Clemizol in Konzentrationen zwischen 30 und 400 µM und überwachten dann die Wirkung auf das spontane Anfallsverhalten mithilfe einer automatisierten Bewegungsverfolgungssoftware. Basierend auf 250 wiederholten Bewegungskontrollstudien mit unbehandelten scn1Lab-Mutanten wurde eine Verringerung der mittleren Schwimmgeschwindigkeit ≥40% (> 1,5 × SD) gegenüber dem Ausgangswert als Schwelle für eine positive Unterdrückung des Anfallsverhaltens festgelegt. Clemizol (Abb. 1A) zeigten bei 300 und 400 µM (30-min-Exposition) und bei 100 µM (90-min-Exposition) antiepileptische Aktivität (Abb. 1B); Längere Expositionen waren bei den höheren Konzentrationen toxisch. Um festzustellen, ob Clemizol das spontane Anfallsverhalten bei einer zweiten Zebrafisch-scn1-Mutante unterdrücken kann, untersuchten wir mutierte scn1Laa-Larven (5 dpf) im Locomotion Tracking Assay. Larven, die als Anfallsverhalten im Stadium III identifiziert wurden (z. B. Ganzkörperkrämpfe, schnelle Schwimmaktivität und kurzer Verlust der Körperhaltung; Abb. 1C) wurden in nachfolgenden Feldaufnahmen aus dem Vorderhirn als elektrographische Entladungen mit interiktalen und iktalen Anteilen bestätigt (Abb. 1D). Die mittlere Schwimmgeschwindigkeit für Larven, die als S3- oder ‚mutmaßliche scn1Laa-Mutanten‘ -Zebrafisch identifiziert wurden, war signifikant höher als für Geschwisterkontrollen oder alle getesteten Larven (Abb. 1E); Mutanten wurden als SCN1LAA-Homozygoten durch Post-hoc-PCR bestätigt. Wir testeten dann Medikamente, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie spontane Anfälle beim Dravet-Syndrom unterdrücken, und scn1Lab-Mutanten (250 µM Stiripentol und 250 µM Diazepam) sowie 250 µM Lamotrigin (ein AED, das Anfälle beim Dravet-Syndrom verschlimmern kann). Erwartungsgemäß unterdrückten Stiripentol und Diazepam, jedoch nicht Lamotrigin, das Anfallsverhalten bei scn1Laa-mutierten Larven signifikant; 250 µM Clemizol war auch in diesem Assay wirksam (Abb. 1F). Zusammen zeigen diese Studien, dass Clemizol das Anfallsverhalten in zwei verschiedenen scn1-mutierten Zebrafischlinien unterdrücken kann.

Untersuchung des Wirkmechanismus von Clemizol

Secondary drug screen using scn1Lab mutants

Tertiäres Screening zur Identifizierung vielversprechender Leitverbindungen für die Klinik

5- HT-Rezeptorexpression in Zebrafischlarven

Da Clemizol eine signifikante Bindungsaffinität zu HTR2A und HTR2B aufweist und sowohl Trazodon als auch Lorcaserin 5-HT-Signalmodulatoren sind, wollten wir die Expression dieser Rezeptoren in Zebrafischen bestätigen. Die Proteinsequenzausrichtung von menschlichen und Zebrafisch-HTR2-Rezeptoren ergab eine evolutionäre Konservierung mit Zebrafisch-Orthologen, wobei Htr2aa und Htr2ab beide 59,3% Proteinidentität mit dem menschlichen HTR2A aufweisen; und ein einzelner HTR2B-Ortholog, Htr2b, der 62,0% Proteinidentität zeigt. Die Quantifizierung des htr2-Expressionsniveaus unter Verwendung isolierter Köpfe oder Schwänze von 5 dpf-Wildtyp- oder scn1Lab-mutierten Larven ergab eine angereicherte htr2a- und htr2cl1-Expression im Kopf. Ähnliche Ergebnisse wurden von adulten Wildtyp-Zebrafischhirnen erhalten, da mutierte Larven nicht bis zum Erwachsenenalter überleben (Ergänzende Abb. 4).

Verringerung der Anfallshäufigkeit bei Patienten mit Dravet-Syndrom

Das Dravet-Syndrom ist eine katastrophale Epilepsie und seltene Erkrankung im Kindesalter (http://www.rarediseases.org/) mit schwächenden Folgen, einschließlich hartnäckiger Epilepsie, stark eingeschränkter kognitiver Entwicklung und SUDEP-RISIKO. Unsere präklinischen Daten bestätigen, dass die Modulation der 5-HT-Signalisierung Anfälle unterdrücken kann, die mit SCN1A-Funktionsverlustmutationen assoziiert sind. Da identifizierte 5-HT-Modulatoren von der FDA zugelassene Verbindungen mit bekannten Sicherheitsprofilen sind, könnte die Behandlung mit diesen umgewidmeten Medikamenten die Anfallshäufigkeit bei Kindern mit Dravet-Syndrom verändern. Dieser translationale Ansatz zielt auf seltene und verheerende Krankheiten ab, für die keine groß angelegten klinischen Studien durchführbar sind (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

Da Clemizol derzeit nicht in klinischer Formulierung hergestellt oder erhältlich ist und Trazodon je nach Konzentration als 5-HT-Rezeptoragonist oder -Antagonist wirken kann (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), wählten wir Belviq® (Lorcaserin) unter einem Compassionate Use Off-Label-Programm in einer kleinen Population von Kindern mit Dravet-Syndrom zu bewerten. Diese Kinder erwiesen sich als resistent gegen mindestens fünf zugelassene AEDs. Fünf Kinder (Durchschnittsalter: 11,8 Jahre; Spanne: 7-18 Jahre) heterozygot für eine Deletion in SCN1A wurden prospektiv mit Belviq® behandelt und longitudinal im Children’s Hospital Colorado (Aurora, CO) verfolgt. Das Behandlungsprotokoll wurde vom Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB) genehmigt, und die Eltern von Patienten mit Dravet-Syndrom stimmten der Teilnahme ihres Kindes schriftlich zu. Wir überprüften retrospektiv die im Tagebuch gemeldete Anzahl atonischer, myoklonischer und generalisierter tonisch-klonischer (GTC) Anfälle, Nebenwirkungen und gleichzeitige AEDs.

Die klinischen Merkmale von Kindern mit Dravet-Syndrom, die mit Belviq® behandelt wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Es gab keine Todesfälle unter den fünf mit Belviq® behandelten Patienten, und Belviq® wurde gut vertragen, ohne dass schwerwiegende unerwünschte Ereignisse zum Absetzen der Therapie führten. Während der Off-Label-Behandlung mit Belviq® war ein Patient zunächst 3 Wochen lang anfallsfrei, ein Patient 2 Wochen lang anfallsfrei und ein dritter Patient hatte 1-2 anfallsfreie Tage pro Woche. Alle fünf Patienten zeigten eine Verringerung der Gesamtzahl der Anfälle. Generalisierte tonisch-klonische Anfälle waren bei Patienten 1, 2 und 3 signifikant reduziert. In der Tat erlebte Patient 2 eine 90% ige Reduktion der generalisierten tonisch-klonischen Anfälle, ohne dass Rettungsmedikamente erforderlich waren. Zwei Patienten bleiben auf Belviq® ohne Zunahme der Anfallshäufigkeit und wie erwartet war die häufigste Nebenwirkung ein verminderter Appetit. Ein Patient nahm die Medikation ein zweites Mal mit vorübergehender Besserung für kurze Zeit wieder auf und verjüngte sich dann.

Diskussion

Clemizol, ein Antihistaminikum der ersten Generation, das in den 1950er Jahren entdeckt wurde (Zierz et al., 1952), wurde als potenzielles Therapeutikum für die Behandlung des Dravet-Syndroms unter Verwendung von scn1Lab-mutierten Zebrafischen identifiziert, um repurposed drug Libraries zu screenen (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Hier bestätigten wir eine antiepileptische Aktivität für Clemizol unter Verwendung eines zweiten scn1-Zebrafischmutantenmodells. Leider wird Clemizol bei Mäusen mit einer Plasmahalbwertszeit von < 10 min (im Vergleich zu 3,4 h beim Menschen) schnell metabolisiert (Nishimura et al., 2013), die ihre Bewertung in Mausmodellen einschränkt. Erfolgreich als Antihistaminikum eingesetzt (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) mit akuten und chronischen Studien, die von einer niedrigen Toxizität berichten (Finkelstein et al., 1960) wird Clemizol nicht mehr hergestellt und ist derzeit nicht für die Off-Label-klinische Verabreichung verfügbar. In Ermangelung eines Mittels zur effizienten Bewertung von Clemizol in präklinischen Nagetiermodellen verwendeten wir Zebrafische für die Zielbindung (5-HT-Rezeptoren) und die Identifizierung verwandter Arzneimittel (Trazodon und Lorcaserin) mit geeigneten Sicherheitsprofilen, die eine schnelle Übersetzung in eine klinische Anwendung ermöglichen. Compassionate Use, Off-Label-Verschreibung von Belviq® (Lorcaserin) an medizinisch hartnäckige Patienten mit Dravet-Syndrom wird ebenfalls beschrieben.

Antihistamin-H1-Rezeptor-Antagonisten sind in pädiatrischen Patientenpopulationen normalerweise kontraindiziert (Miyata et al., 2011) und das Screening dieser Medikamente bestätigten ihre Unfähigkeit, Anfälle bei scn1-Zebrafischen zu unterdrücken (und in einigen Fällen zu verschlimmern). Bindungsdaten deckten eine bisher unbekannte Clemizolaffinität für HTR2A- und / oder HTR2B-Rezeptoren auf. Ein nachfolgender phänotypischer Bildschirm von Zielbibliotheken identifizierte zwei 5-HT-modulierende Verbindungen, Trazodon und Lorcaserin, die in der Lage sind, verhaltens- und elektrophysiologische Anfälle auf eine mit Clemizol vergleichbare Weise zu unterdrücken. Belviq® (Lorcaserin) ist ein von der FDA zugelassener HTR2C-Agonist, der zur chronischen Gewichtskontrolle verschrieben wird (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (Trazodon) ist auch ein von der FDA zugelassenes Antidepressivum, das häufig bei Schlafstörungen verschrieben wird (Mendelson, 2005). Es wird häufig als inverser HTR2A- und HTR2C-Antagonist und 5-HT-Aufnahmehemmer klassifiziert (Stahl, 2009). Studien an Ratten legen jedoch nahe, dass Trazodon oder sein Metabolit Meta-Chlorphenylpiperazin (mCPP) in höheren Konzentrationen als HTR2C-Agonist wirken kann (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Insbesondere wurde zuvor gezeigt, dass eine chronische Trazodonbehandlung bei Mäusen vor elektrokrampfinduzierten Anfällen schützt (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), Unterstützung unserer Daten von scn1Lab-mutierten Zebrafischen. Eine 5-HT-Rezeptor-vermittelte Wirkung für Clemizol steht auch im Einklang mit einem kürzlich durchgeführten phänotypischen Screening, bei dem Modulatoren der serotonergen Signalübertragung (einschließlich Clemizol) in einem präklinischen Modell der Machado-Joseph-Krankheit als wirksame Behandlung erwiesen wurden (Teixeira-Castro et al., 2015); und Studien hier legen nahe, dass Clemizol und Trazodon eine Weiterentwicklung für Off-Label-Tests bei Patienten mit Dravet-Syndrom rechtfertigen.

Unsere Ergebnisse tragen auch zu einer wachsenden Zahl von Beweisen bei, die auf eine Modulation der serotonergen Signalübertragung als potenten Suppressor der Anfallsaktivität hindeuten, insbesondere bei katastrophalen Epilepsien im Kindesalter wie dem Dravet-Syndrom. Kürzlich wurden 7 von 10 Patienten, die eine niedrig dosierte Behandlung mit dem 5-HT-Wiederaufnahmeblocker Fenfluramin erhielten, für 1 Jahr als anfallsfrei gemeldet (Ceulemans et al., 2016). Eine leichte Verdickung von einer oder zwei Herzklappen wurde bei zwei dieser Patienten berichtet, was mit einem möglichen Zusammenhang zwischen der Anwendung von Fenfluramin und pulmonaler Hypertonie übereinstimmt (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Beim Menschen werden HTR2A und HTR2C im ZNS exprimiert, während die HTR2B-Expression im Herzen angereichert ist (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Genauer gesagt wird HTR2C auf einer Subpopulation von inhibitorischen Interneuronen exprimiert (Liu et al., 2007) und die Aktivierung dieser Rezeptoren mit 5-HT erhöht die GABA-vermittelte synaptische Hemmung (Boothman et al., 2006), d. H. Der antiepileptische Wirkmechanismus, der vielen häufig verschriebenen Antiepileptika zugrunde liegt. Tatsächlich legen die meisten präklinischen Studien nahe, dass die Aktivierung von HTR2A- und / oder HTR2C-Rezeptoren antiepileptische Wirkungen hat (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), ein vernünftiger Wirkmechanismus, der Clemizol, Lorcaserin, Trazodon und den 5-HT-Wiederaufnahmeblocker Fenfluramin miteinander verbindet (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Interessanterweise war die htr2b-Expression im Zebrafischhirn relativ gering, was darauf hindeutet, dass diese Medikamente möglicherweise eine antiepileptische Aktivität über die Aktivierung des HTR2A- oder HTR2C-Rezeptors ausüben. Interessanterweise haben Studien an Drosophila-Knock-in-Fliegen, die die menschliche Mutation K1270T SCN1A im Para-Natriumkanal-Gen tragen, gezeigt, dass die Supplementierung mit einem 5-HT-Vorläufer (5-Hydroxytryptophan) den hitzeinduzierten Anfallsphänotyp rettet (Schutte et al., 2014). Darüber hinaus bewertete eine kürzlich durchgeführte Studie mit scn1Lab-Mutanten 13 5-HT-Signalverbindungen und schlug auch eine mögliche antiepileptische Rolle für Modulatoren der 5-HT-Signalübertragung vor (Sourbron et al., 2016). Diese letzteren Zebrafischstudien verwendeten jedoch ein grundlegend anderes Protokoll (24 h versus 30-90 min Arzneimittelexposition), das zuvor nicht als erfolgreich validiert wurde Identifizierung von AEDs, die beim Dravet-Syndrom verwendet werden (Benzodiazepine, Valproat, Stiripentol, Bromide und ketogene Diät). Zusätzlich Wirkstoffkonzentrationen einige 10-fach niedriger als wir zeigen, wirksam zu sein in Zebrafisch (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015) und berichten über eine antiepileptische Wirkung für das Halluzinogen TCB-2 (Abb. 5), legt nahe, dass der direkte Vergleich von Daten aus Laboratorien mit unterschiedlichen Verfahren mit Vorsicht interpretiert werden sollte.

Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass mutierte Zebrafische ein geeignetes Modell für das schnelle Screening und die Entdeckung neuartiger AEDs sind, die mit geeigneten Sicherheitsprofilen die klinische Versorgung von Risikopatienten wie dem Dravet-Syndrom direkt beeinflussen können.

Abkürzungen

Abkürzungen
• 5- HT

  Serotonin

• AED

  Antiepileptikum

• dpf

  Tage nach der Befruchtung

• GPCR

  G-Protein-gekoppelter Rezeptor

• iZAP

  integrierte Zebrafisch-Analyseplattform

Danksagung

Wir möchten den Mitgliedern des Baraban-Labors, insbesondere Brian Grone und Matthew Dinday, für nützliche diskussionen im Laufe dieser Studien.

Finanzierung

S.C.B bestätigt die Finanzierung von NINDS R01 Grant No. NS079214, UCSF Catalyst Award und der Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

Ergänzungsmaterial

Ergänzungsmaterial ist bei Brain online verfügbar.