CK20 und CK5 / 6 Immunhistochemische Färbung von urothelialen Neoplasmen: Eine Perspektive

Zusammenfassung

Zytokeratine gehören zur Familie der Zwischenfilamente. Sie werden hochspezifisch in Epithelzellen exprimiert, wo sie eine entscheidende Rolle für die Integrität und mechanische Stabilität der Zellen spielen. Verschiedene Arten von Zytokeratinen wurden sowohl im normalen als auch im neoplastischen Urothel beschrieben. Bei urothelialen Neoplasmen wurde in mehreren Studien gezeigt, dass die Expression von CK20 und CK5 / 6 diagnostische und prognostische Auswirkungen hat. So manifestiert ein niedriggradiges Urothelkarzinom eine CK-Expression, die auf die Schirmzellen beschränkt ist, während hochgradige Tumoren normalerweise eine Expression in der gesamten Dicke des Urothels mit Ausnahme der Basalschicht aufweisen. Die CK5/ 6-Expression hingegen wird in allen niedriggradigen und einigen hochgradigen Urothelkarzinomen in den Basalzellen exprimiert. Eine diffuse CK20-Färbung, die mit einem Verlust der CK5 / 6-positiven Basalschicht einhergeht, ist normalerweise mit aggressivem klinischem Verhalten verbunden. Eine Doppelfärbung der Objektträger für diese Zytokeratine kann die korrekte Interpretation und Korrelation erleichtern.

1. Einleitung

Zytokeratine gehören zur Familie des 10 nm intermediären Filamentzytoskeletts, das in allen Zellen vorhanden ist. Intermediäre Filamentproteine werden hoch zelltypspezifisch exprimiert, wobei Keratine die typische intermediäre Filamentkategorie darstellen, die in Epithelzellen vorhanden ist. Diese Filamente sind eine komplexe Gruppe von wasserunlöslichen Polypeptiden mit einer Größe von 40.000 bis 68.000 Mr. In Epithelien können Keratinfilamente als Tonofilamente gebündelt sein, den Kern flechten, das Zytoplasma überspannen und an den zytoplasmatischen Plaques der typischen Epithelzellen-Zellverbindungen, den Desmosomen, anhaften. Somit spielen Keratine eine wichtige funktionelle Rolle bei der Integrität und mechanischen Stabilität sowohl der einzelnen Epithelzellen als auch der Epithelgewebe und sind ein inhärenter Teil des Kontinuums der Stabilität von der Einzelzelle bis zur Gewebebildung .

Die Keratinproteine können in kleine saure Keratine vom Typ I und große basische bis neutrale Keratine vom Typ II unterteilt werden. Eine einzigartige Eigenschaft der Keratine ist, dass sie im Gegensatz zu den anderen intermediären Filamentproteinen ihr filamentöses Stadium nur durch Paarbildung von Typ I und Typ II (1 : 1) Molekülen bilden können. Unter den menschlichen Keratinen umfasst die jüngste Konsensusnomenklatur die Keratine vom Typ I K9–K10, K12–K28 und K31–K40 sowie die Keratine vom Typ II K1–K8 und K71-K86. Im menschlichen Genom sind die Keratingene an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen gruppiert: Chromosom 17q21.2 (Keratine vom Typ I, außer K18) und Chromosom 12q13.13 (Keratine vom Typ II und K18). Es wird angenommen, dass die beiden Cytokeratin-Unterfamilien durch Genduplikation und anschließende Divergenz von CK8 und CK18 entstanden sind .

Jede Art von Epithelzelle exprimiert eine charakteristische Kombination von zwei bis zehn Zytokeratin-Isotypen. So können normale Epithelzellen in vivo oder in vitro hinsichtlich ihres Zytokeratin-Isotypenprofils identifiziert werden. Die charakteristischen Zytokeratinprofile der verschiedenen normalen Epithelzelltypen neigen dazu, nach neoplastischer Transformation erhalten zu bleiben, und dieses Merkmal kann in der Tumordiagnostik ausgenutzt werden. Zytokeratinprofile von Epithelzellen können jedoch auch die funktionelle Differenzierung und nicht das Ursprungsgewebe widerspiegeln. Daher exprimieren metaplastische Zellen eher Zytokeratinprofilmerkmale ihrer Morphologie als die ihres normalen Gegenstücks .

2. Zytokeratinexpression im Urothel während der embryonalen Entwicklung

Die Zytokeratine sind der erste intermediäre Filamenttyp, der während der Embryogenese auftritt, und alle Zellen in einem bestimmten Stadium der fetalen Entwicklung sind Zytokeratin-positiv. Die ersten zu exprimierenden Zytokeratin-Isotypen sind das CK8 + CK18-Paar. Während der embryologischen epithelial-mesenchymalen Transformation geht die Zytokeratinexpression durch bestimmte Zelllinien verloren, die entweder zytokeratinnegativ bleiben und sich zu Bindegewebe entwickeln oder später Zytokeratine sekundärer Epithelien wieder exprimieren . Die embryologische Entwicklung der Harnblase erfolgt aus der Kloake, einer Hinterdarmstruktur, die eine gemeinsame Kammer für Magen-Darm- und Harnabfälle darstellt. In der 4.-7. Entwicklungswoche wird die Kloake durch das urorektale Septum in zwei Teile geteilt: den hinteren anorektalen Kanal und den vorderen Urogenitalsinus. Der obere Teil des Sinus urogenitalis bildet die Harnblase .

Während der frühen Entwicklung der Blase wandelt sich das Auskleidungsepithel allmählich vom einfachen endodermalen Epithel in ein mehrschichtiges Urothelfutter um. Als Muster der endodermalen Auskleidung im GI-Trakt ist die sich entwickelnde Urothelauskleidung zunächst in allen Schichten diffus positiv für CK20. Während der anschließenden Reifung des Urothels entwickelt sich eine Basalschicht, die durch CK5- und CK13-Positivität nachgewiesen werden kann. Die weitere Reifung des Urothels beinhaltet den Verlust von CK20 in praktisch allen Schichten mit Ausnahme der Schirmzellen. Somit scheint es drei verschiedene Phasen der Urothelentwicklung zu geben. Das erste Stadium ist durch einen Mangel an Basalzellen und CK20-Expression in allen Schichten gekennzeichnet. Die zweite Phase wird durch das Auftreten der Basalschicht bestimmt, aber das CK20-Expressionsmuster ist immer noch diffus. Im dritten und letzten Stadium reift das CK20-Expressionsmuster, das nur in der Umbrella-Schicht durch CK20 gekennzeichnet ist. Die Basalschicht ist gut entwickelt und kann durch CK5 / 6- oder CK13-Immunfärbung nachgewiesen werden .

3. Cytokeratin-Expression im normalen Urothel

Die Harnblase ist mit Urothel ausgekleidet, das darauf spezialisiert ist, als Barriere für den Urin zu fungieren und Veränderungen des intraluminalen Volumens aufzunehmen. Urothel erscheint als mehrschichtiges Epithel mit drei Zellzonen: (1) eine Basalzellschicht, die aus Zellen besteht, die mit der Ebene der Basalmembran in Kontakt stehen und senkrecht zur Ebene der Basalmembran ausgerichtet sind; (2) die Zwischenzellzone, die aus 2-5 Zellschichten besteht; (3) eine luminale oder oberflächliche Zellschicht, die aus späten Zwischenzellen und großen, häufig zweikernigen „Regenschirm“ -Zellen besteht, deren apikale Oberfläche dem Lumen zugewandt ist. Die Schirmzellen sind durch einen Zellübergang vom Typ Zonula occludens und durch das Vorhandensein spezialisierter Plaques der asymmetrischen Einheitsmembran in der apikalen Zellmembran und in intrazellulären fusiformen Vesikeln gekennzeichnet . Dieses Aussehen ist auf das Vorhandensein von reichlich Uroplakin in der Zellmembran zurückzuführen .

Im normalen adulten Urothel werden CK7, CK8, CK18 und CK19 in allen Urothelzellschichten exprimiert, CK5 wird basal exprimiert und CK20 ist mit Regenschirmzellen assoziiert (Abbildung 1).

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 1

(a) Normales Urothel, das mehrere Zellschichten aufweist, einschließlich Basalzellen, Zwischenzellen und Schirmzellen. (b) Immunhistochemische Färbung, die ein normales Färbemuster des Urothels zeigt. Die Schirmzellen sind mit CK20 (magenta) verziert. Die Zwischenzellen sind ungefärbt. Basalzellen werden durch CK5 / 6-Färbung (braun) dekoriert.

Es kann auch einige CK20-positive Zellen in der Zwischenzellschicht einiger normaler Proben geben .

4. Die Zytokeratinexpression in papillärer Urothelneoplasie

Die neoplastische Transformation von Urothelzellen führt zum Urothelkarzinom, der häufigsten Form von Blasenkrebs in den meisten Ländern. Viele Patienten haben oberflächliche Tumoren, die entweder nichtinvasiv sind (pTa) oder nur in die Lamina propria eindringen (pT1). Während Rezidive häufig sind (50-70%), kann die Krankheit in der Regel durch lokale Behandlung kontrolliert werden. Dennoch entwickeln sich 10-15% der Patienten mit oberflächlicher Erkrankung schließlich zu nicht-invasiven und metastasierten Erkrankungen. Ein Anstieg des Grades, der durch einen Differenzierungsverlust gekennzeichnet ist, und das Vorhandensein dysplastischer Veränderungen sind beide Determinanten für eine schlechte Prognose. Darüber hinaus zeigen einige Urothelkarzinome eine basale / Plattenepitheldifferenzierung, die mit einer schlechteren Prognose verbunden ist .

Das immunhistochemische Färbemuster für Cytokeratin20 und CK5/ 6 variiert mit der Art und Art des Urothelneoplasmas. Beispielsweise zeigen papilläre Urothelneoplasmen mit begrenztem malignen Potential (PUNLMP) sowie niedriggradige papilläre Karzinome CK20, das auf die Schirmzellen beschränkt ist, und CK5 / 6-Färbung, die auf die Basalschicht beschränkt ist, identisch mit der Verteilung dieser Keratine im normalen Urothel (Abbildung 2).

(ein)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 2

(a) Niedriggradiges papilläres Urothelkarzinom. (b) Immunhistochemische Färbung, die die CK20-Expression (magenta) darstellt, die auf die Schirmzellen beschränkt ist, und eine wohlgeformte Basalschicht, die durch CK5 / 6-Färbung (braun) dargestellt ist. (c) niedriggradiges Urothelkarzinom mit Färbung der Basalzellen, aber ohne Schirmzellen.

Hochgradige Urothelkarzinome hingegen neigen zu einer diffusen Immunreaktivität für CK20, an der sowohl die Schirmzellen als auch die Zwischenschicht beteiligt sind. Zusätzlich kann die Basalschicht durch CK5 / 6-Positivität nachgewiesen werden (Abbildung 3).

(ein)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 3

(a) Hochgradiges papilläres Urothelkarzinom. (b) Hochgradiges papilläres Urothelkarzinom mit diffuser Vollschichtfärbung für CK20 und Vorhandensein einer Basalschicht, wie durch CK5 / 6-Färbung nachgewiesen. (c) Hochgradiges Urothelkarzinom, das das diffuse Vorhandensein von Basalzellen und eine Färbung in voller Dicke für CK20 zeigt.

Höhergradiges papilläres Urothelkarzinom hingegen zeigt eine CK20-Expression in der gesamten Dicke des Urothels ohne Basalschicht und negative Färbung für CK5 / 6 (Abbildung 4).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 4

(a) Hochgradiges Urothelkarzinom mit partiellem Verlust von Basalzellen, aber diffuser Färbung für CK20. (b) Hochgradiges Urothelkarzinom mit fast vollständigem Verlust von Basalzellen. (c) Hochgradiges papilläres Urothelkarzinom mit diffuser immunhistochemischer Färbung für CK20 und vollständigem Fehlen einer Basalschicht ohne Färbung für CK5 / 6.

Dieses Muster mit diffuser CK20-Färbung in voller Dicke ohne Basalschichtfärbung ist auch ein Merkmal, das bei hochgradigen Urothelkarzinomen mit Lamina propria oder Muskelinvasion auftritt (Abbildung 5).

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 5

(a) Hochgradiges Urothelkarzinom mit früher Invasion, das eine starke CK20-zytoplasmatische Färbung und das Fehlen von Basalzellen aufweist. (b) Hochgradiges Urothelkarzinom mit ausgedehnter Invasion. Die Karzinomzellen sind diffus positiv für CK20, aber die Basalschicht fehlt.

Es wurde vorgeschlagen, dass das Muster der CK20-Färbung eine nützliche Ergänzung zur Morphologie bei der Diagnose von Urothelkarzinomen darstellt. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die CK20-Expression das maligne Potenzial bei niedriggradigen Urotheltumoren vorhersagen kann, und daher kann CK20 bei der Definition von Behandlungsstrategien für Patienten mit diesen Tumoren nützlich sein. Die CK20-Expression wurde von den meisten reinen Urothelkarzinomen beibehalten, wobei das normale oberflächliche Lokalisationsmuster in einigen gut differenzierten Papillentumoren erhalten blieb oder eine heterogene oder gleichmäßig positive Reaktion in allen Zellschichten zeigte. Teile des Karzinoms mit Plattenepitheldifferenzierung zeigen eine Reduktion der CK20-Expression. Diese Bereiche reagieren jedoch positiv für CK5 / 6 (Abbildungen 6 (a) und 6 (b)) in einem Muster, das sich von der Basalverteilung der Basalschicht unterscheidet .

(ein)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Abbildung 6

(a) Hochgradiges Urothelkarzinom mit fokaler Plattenepitheldifferenzierung. (b) Immunhistochemische Färbung, die eine starke CK5 / 6-Färbung im Bereich der Plattenepitheldifferenzierung zeigt. Der verbleibende Teil der Karzinomflecken für CK20. (c) Hochgradiges Urothelkarzinom mit basosquamösen morphologischen Merkmalen. (d) Immunhistochemische Färbung beim basosquamösen Karzinom mit starker Immunfärbung für CK5 / 6 und vollständigem Fehlen einer CK20-Positivität.

In einigen Fällen kann das gesamte Karzinom basosquamöse Merkmale aufweisen. Diese Fälle zeigen eine starke Reaktivität für CK5 / 6 mit geringer oder keiner Positivität für CK20 (Abbildungen 6 (c) und 6 (d)).

Zwei kürzlich veröffentlichte Studien haben zusätzliche Hinweise auf die klinische Bedeutung verschiedener Muster der Immunfärbung für CK20 und CK5 / 6 geliefert. In einer dieser Studien wurden Tumorproben von 222 Patienten mit Urothelkarzinomen des oberen Trakts, die mit radikaler Nephroureterektomie behandelt wurden, auf die Expression von sieben basalen / luminalen immunhistochemischen Markern (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 und FOXA) analysiert. Mit CK5 und CK20 definierten sie vier Subtypen von Urothelkarzinomen des oberen Trakts:(i) Ausschließlich CK20 positiv und CK5 negativ (CK20 + / CK5−)(ii) Ausschließlich CK5 positiv und CK20 negativ (CK20− / CK5+)(iii)Beide Marker positiv (CK20+ / CK5+)(iv)Beide Marker negativ (CK20−/ CK5−)

In der multivariaten Cox−Regressionsanalyse war der CK20 + / CK5- Subtyp ein unabhängiger negativer prognostischer Marker mit einem 3,83-fach erhöhten Risiko für krebsspezifischen Tod im Vergleich zu den anderen drei Subtypen .

In einer zweiten Studie wurde berichtet, dass die immunhistochemische Färbung für CK5 / 6 und CK20 mit der Prognose eines frühen Urothelkarzinoms korrelierte. Darüber hinaus wurden die Genexpressionsprofile von Untergruppen des nicht muskelinvasiven papillären hochgradigen Urothelkarzinoms (UTUC) des oberen Trakts, klassifiziert nach CK5 / 6- und CK20-Expressionsniveaus, untersucht und korreliert mit klinischen Ergebnissen. Zu diesen Untergruppen gehörten CK5/6-high/ CK20-low, CK5/6-high/ CK20-high und CK5/6-low/CK20-high. Die letztere Gruppe, die durch eine geringe Expression von CK5 / 6 und eine hohe Expression von CK20 gekennzeichnet war, war prädiktiv für eine schlechtere Prognose von nicht-muskelinvasiven papillären hochgradigen Urothelkarzinomen. Die Transkriptionsanalyse ergab 308 differentiell exprimierte Gene in den Untergruppen. Funktionelle Analysen der Gene identifizierten die Zelladhäsion als einen gemeinsamen Prozess, der in dieser Untergruppe im Vergleich zu den anderen unterschiedlich angereichert war, was ihren Hochrisiko-Phänotyp erklären könnte. Späte Zellzyklus- / Proliferationssignaturen wurden auch in dieser Untergruppe angereichert . Es scheint also, dass Urotheltumoren, die durch diffuse Färbung für CK20 in Abwesenheit einer nachweisbaren Basalschicht gekennzeichnet sind, den aggressivsten Subtyp des papillären Urothelkarzinoms darstellen.

Cytokeratin 5/6 ist in der normalen keratinisierenden Epidermis und im Plattenepithelschleimhautepithel sowie in Basalzellen oder Myoepithelzellen der Brust, der Speicheldrüsen und der Prostata vorhanden . In Prostata- und Brustbiopsien schmückt CK5 / 6 die Basalzellschicht und ist daher nützlich bei der Diagnose von invasiven Karzinomen, wobei letztere keine Basalzellen aufweisen. Die Architektur des Urothels unterscheidet sich von der des Prostata- oder Brustduktalepithels, so dass das Vorhandensein oder Fehlen von Basalzellen nicht zur Stratifizierung von Urothelneoplasmen in gutartige oder bösartige Typen verwendet werden kann. Das Fehlen von Basalzellen in den Urothelneoplasmen kann jedoch auf eine schlechte Prognose hinweisen. Somit kann sich ein hochgradiges Urothelkarzinom mit einer erhaltenen Basalschicht weniger aggressiv verhalten als ein anderer hochgradiger Tumor, bei dem die Basalschicht verloren gegangen ist. In unserem Labor verwenden wir für diese Zytokeratine eine Doppelfärbung, die bei der richtigen Interpretation dieser Färbungen äußerst hilfreich ist.

Ein ähnliches Färbemuster kann auch beim Urothelkarzinom in situ beobachtet werden . Diese Läsionen sind normalerweise stark reaktiv für CK20 und können die CK5 / 6-positive Basalzellschicht behalten oder nicht. Der klammernde Typ des Urothelkarzinoms in situ und die pagetoide Ausdehnung von Karzinomzellen können auch durch positive CK20-Färbung erkannt werden (Abbildung 7).

(ein)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 7

(a) Urothelkarzinom in situ mit starker Immunfärbung in voller Dicke für CK20 mit einer deutlichen Basalzellschicht, die für CK5 / 6 positiv ist. (b) Ein weiteres Urothelkarzinom in situ mit starker Färbung für CK20 und Fehlen einer Basalschicht. (c) Pagetoide Ausdehnung des Urothelkarzinoms, nachgewiesen durch starke zytoplasmatische Färbung für CK20 in einem Hintergrund mehrerer Schichten von Basalzellen, die für CK5 / 6 reaktiv sind.

In einer Minderheit der Fälle kann Carcinoma in situ für CK5 / 6 reaktiv sein, was auf eine Basaloiddifferenzierung hinweist .

5. Embryologische urotheliale Differenzierung versus Dedifferenzierung bei urothelialer Neoplasie

Die enge Korrelation zwischen Zytokeratin-Isotyp-Expressionsmustern und epithelialer Differenzierung legt nahe, dass Zytokeratine für die Struktur und / oder Funktion des Epithelgewebes entscheidend sind. Es war jedoch schwierig festzustellen, welchen genauen Beitrag Einzelpersonen oder Kombinationen von Zytokeratin-Isotypen zum normalen und neoplastischen Phänotyp und Verhalten von Epithelzellen leisten. Daher spiegeln die Veränderungen der CK20-Immunlokalisation, die auf ein höheres Risiko für ein Wiederauftreten des Urothelkarzinoms hinweisen, wahrscheinlich eine sekundäre Veränderung wider, die mit einer Dysregulation des Urotheldifferenzierungsprogramms während der Karzinogenese zusammenhängt, anstatt darauf hinzudeuten, dass CK20 direkt beteiligt ist. Es kann spekuliert werden, dass die Expressionsmuster von CK20 und CK5 / 6 in verschiedenen Urothelkarzinomen dazu neigen, die Stadien der embryologischen Entwicklung und Differenzierung des Urothels nachzuahmen. So können hochgradige Urothelkarzinome (mit oder ohne Invasion), die durch diffuse CK20-Expression ohne Basalschicht gekennzeichnet sind, das frühe Stadium der Urotheldifferenzierung darstellen, nachdem sich der Sinus urogenitalis von der Kloake getrennt hat . Während dieses Entwicklungsstadiums zeigt das Urothel eine diffuse CK20-Färbung, es fehlt jedoch eine Basalschicht. In einigen der hochgradigen Urothelkarzinome gibt es eine gleichmäßige Färbung aller Schichten durch CK20, aber es gibt auch eine wohlgeformte Basalschicht, die durch Expression von CK5 / 6 nachgewiesen werden kann. Dies kann dem Zwischenstadium der embryonalen Urotheldifferenzierung entsprechen. Die gut differenzierten Urothelkarzinome sind durch das Vorhandensein eines reifen Musters der CK20-Expression gekennzeichnet, wobei seine Expression größtenteils auf die Schirmzellen beschränkt ist, während auch eine gut definierte Basalzellschicht vorhanden ist, die für CK5 / 6 immunoreaktiv ist (Abbildungen 8 und 9).

Abbildung 8

(a) Karikatur, die Stadien der Differenzierung während der embryologischen Entwicklung des Urothels darstellt. In den frühen Stadien behält das sich entwickelnde Urothel die CK20-Expression bei, die normalerweise in der Kloake zu sehen ist. In diesem Stadium ist keine Basalschicht vorhanden. (b) Während der Entwicklung des Urothels kann die Basalschicht nicht durch Färbung auf CK5 / 6 nachgewiesen werden. (c) Endstadium der Urotheldifferenzierung mit normaler Expression von CK20, die auf die Schirmzellen beschränkt ist, und Vorhandensein einer normalen Basalschicht, die die Expression von CK5 / 6 manifestiert.

Abbildung 9

(a) Karikatur mit immunhistochemischem Färbemuster in einem niedriggradigen papillären Urothelkarzinom mit CK20-Expression, die auf die Schirmzellen beschränkt ist, und Vorhandensein einer gut definierten Basalschicht, die CK5 / 6 exprimiert. (b) Ein hochgradiges Urothelkarzinom zeigt die Expression von CK20 in allen Schichten des Urothels mit Ausnahme der Basalschicht, die CK5 / 6 enthält. Dies kann ein Zwischenstadium der Dedifferenzierung des Tumors darstellen. (c) Beim hochgradigen Urothelkarzinom kann die Basalschicht fehlen, aber das diffuse CK20-Färbemuster bleibt erhalten. Diese Merkmale können auf eine weitere Dedifferenzierung des Karzinoms hinweisen.

Dieses Muster kann dem Endstadium der Urothelentwicklung und -reifung während der intrauterinen Periode entsprechen.

Zusammenfassend kann die immunhistochemische Färbung des Urothelkarzinoms für CK20 und CK5 / 6 nützliche Informationen über die Art des Urothelkarzinoms und sein klinisches Verhalten liefern.

Datenverfügbarkeit

Es wurden keine Daten zur Unterstützung dieser Studie verwendet.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass sie keine Finanzierung oder Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Danksagung

Die Autoren möchten die wertvolle Unterstützung und das technische Fachwissen der folgenden Aufsichts- und technischen Mitarbeiter unseres immunhistochemischen Labors bei der Durchführung der zweifarbigen immunhistochemischen Färbung anerkennen: FRAU Rajaa Al Abdulla, Supervisor; FRAU Huda Ahmed Al Hijji, Supervisor; und FRAU Zuhoor Ali, Senior Technologist.