Cisplatin Ototoxizität beinhaltet Zytokine und STAT6 Signalnetzwerk

Reagenzien

Cisplatin und 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) wurden von Sigma Chemical Co (Sigma, St. Louis, MO, USA) gekauft. Die Kunststoffkulturmaterialien wurden von Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA) gekauft. Dulbeccos modifiziertes essentielles Medium (DMEM), fetales Rinderserum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) und andere Gewebekulturreagenzien wurden von Life Technologies Inc. erhalten. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinantes Maus-IL-4- und IL-13-Protein, Antikörper gegen IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 und ELISA-Kits (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (QuantikineR) für Zytokine wurden von R& D Systems Inc. erworben. (Minneapolis, MN, USA). Diese Antikörper wurden in einer Konzentration von 1:200 für die Immunhistochemie verwendet. Antikörper gegen p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) und IkB wurden von Santa Cruz Biotech Inc. erworben. (Santa Cruz, KALIFORNIEN, USA).

Zellkultur und Lebensfähigkeit

Die Etablierung und Charakterisierung der bedingt immortalisierten HEI-OC1-Hörzellen wurde in unserem vorherigen Bericht 1 beschrieben. Die Expression von OHC-spezifischen Markern wie Math1 und Myosin 7a legt nahe, dass HEI-OC1-Zellen OHC-Vorläufer darstellen. HEI-OC1-Zellen wurden in hochglukosem DMEM (Gibco BRL) mit 10% FBS gehalten. Für die unten beschriebenen Experimente wurden HEI-OC1-Zellen unter den folgenden permissiven Bedingungen kultiviert: 33 °C und 5% CO2 in DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Zellen (3× 104 Zellen/Well einer 24-Well-Platte) wurden mit 20 µM Cisplatin für 24 h inkubiert. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde MTT (0,25 mg) zu einer 1 ml Zellsuspension für 4 h gegeben. Nach Waschen der Zellen und drei Wäschen mit PBS (pH 7,4) wurde das unlösliche Formazan-Produkt in DMSO gelöst. Die optische Dichte (OD) jeder Kulturwanne wurde dann mit einem Mikroplattenleser (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) bei 590 nm gemessen. Die OD der Kontrollzellen wurde genommen, um 100% Lebensfähigkeit anzuzeigen. Um die Wirkungen verschiedener Zytokine zu untersuchen, wurden den Kulturen neutralisierende Antikörper gegen Zytokine für 30 min zugesetzt, wonach sie mit 20 µM Cisplatin für 24 h kultiviert wurden.

Tiere

STAT4−/− (Backcross Generation N10), STAT6−/− (Backcross Generation N6) und WT BALB/c Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) gekauft. Die homozygoten KO-Mäuse STAT4 und STAT6 wurden mittels PCR identifiziert. Die KO-Mäuse zeigten keine Entwicklungsstörungen. Experimente wurden an 6 Wochen alten Mäusen durchgeführt, und alle Mäuse wurden innerhalb von 3 Tagen altersangepasst. Mäuse wurden mit einer handelsüblichen Standarddiät gefüttert, während sie bei einer Umgebungstemperatur von 20-22 ° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 ± 5% unter einem 12: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus in einer spezifischen pathogenfreien Einrichtung untergebracht waren. Alle Tierstudien wurden vom Animal Care and Use Committee der Wonkwang University School of Medicine genehmigt.

Luciferase Reporter Assay

Zellen wurden transient mit NF-kB Luciferase Reporter Plasmid unter Verwendung des Transfektionsreagenzes Lipofectamine 2000 transfiziert. Nach 36 h Inkubation wurden die Zellen mit Cisplatin für 12 h in Gegenwart von neutralisierenden Zytokin-Antikörpern behandelt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und anschließend in Reporterlysepuffer (Promega, Madison, WI, USA) lysiert. Ein 20-µl-Aliquot des Lysats wurde dann mit 100 µl Luciferase-Assay-Reagenz gemischt, wonach die emittierte Lichtintensität mit einem Luminometer AutoLumat LB953 (Z. B. und G Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) gemessen wurde. Schließlich wurde die Luciferase-Aktivität in dreifacher Ausfertigung gemessen, gemittelt und dann mit dem Galactosidase-Assay-System (Galacto-Light, Tropix Inc.) gegen die β-Galactosidase-Aktivität normalisiert., MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Transfektion mit siRNA-Konstrukten

Vordefinierte siRNAs gegen Maus-STAT4-, STAT6- und Kontroll-Scrambled-siRNA wurden von Santa Cruz Biotechnology gekauft. Die Sense-Stränge von siRNAs gegen STAT4 und STAT6 sind wie folgt. Das STAT4 siRNAs Konstrukt ist ein Pool von drei siRNA-Sequenzen wie folgt: Duplex 1 Sense Strang: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3′, Duplex 2 Sense Strang: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA A-3′ und Duplex 3 Sense Strang: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3′ (mRNA accession number: NM_011487). Das STAT6 siRNAs-Konstrukt ist ein Pool von drei siRNA-Sequenzen wie folgt: Duplex 1 Sense Strang: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 Sense Strang: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG A-3′ und Duplex 3 Sense Strang: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3′ (mRNA accession number: NM_009284). Zellen wurden transient mit 100 nM siRNA-Konstrukten in X-tremeGENE siRNA-Transfektionsreagenz (Roche Applied Science, Penzberg, Deutschland) nach dem Herstellerprotokoll transfiziert. Nach Inkubation bei 33°C und 5% CO2 für 36 h wurden die Zellen für 24 h weiter mit Cisplatin behandelt. Die Interferenz der Expression wurde durch Immunoblot-Analyse bestätigt.

Messung von proinflammatorischen Zytokinen durch ELISA

Zur Messung der Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen aus den mit Cisplatin behandelten Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt Kulturüberstände geerntet und anschließend die Spiegel von sekretierten proinflammatorischen Zytokinen durch ELISA bestimmt (proinflammatorische Zytokin-Kits; R&D Systems Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Herstellung von cytosolischen und nuklearen Extrakten

Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen, geschabt und 5 min bei 1 000×g bei 4°C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann in 200 µl Lysepuffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,5 mM dithiothreitol) und dann 15 min auf Eis inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 10 µl 10% NP-40 zugegeben und das Röhrchen für 10 s vortext. Nach 1 min Zentrifugation bei 13 000×g bei 4°C wurde der Überstand (cytosolischer Extrakt) gesammelt und bei -80°C gelagert, während das Pellet zu den Kernextrakten weiterverarbeitet wurde. Anschließend wurde das Pellet in Extraktionspuffer (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl 2, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol und 25% (vol/vol) Glycerin) resuspendiert und 30 min bei 4°C inkubiert. Kernextrakte wurden durch Zentrifugation bei 13 000×g für 30 min bei 4°C isoliert. Der Überstand wurde dann entfernt und bei -80 ° C gelagert, bis er für die Western-Blot-Analyse verwendet wurde. Schließlich wurde die Proteinkonzentration nach der Lowry-Methode bestimmt.

Western-Blot-Analyse

Die Western-Blot-Analyse wurde wie folgt durchgeführt. Kurz wurden die Zellen geerntet und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Gesamt- und kern/cytosolisch fraktionierten Lysate an 12%igen SDS-Polyacrylamidgelen 3 h bei 20 mA elektrophoretisch untersucht und anschließend auf Nitrocellulose überführt. Die Membran wurde dann in 5% (wt/vol) getrocknetem Milchprotein in PBS mit 0,05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) für 1 h inkubiert, wonach sie in PBS-T gewaschen wurden, und dann weiter mit primärem Antikörper (1: 1 000) für 1 h umgesetzt. Als nächstes wurde die Membran ausgiebig mit PBS-T gewaschen und dann mit Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper konjugiert an HRP (1: 3 000) für 1 h inkubiert. Nach ausgiebigen Wäschen wurden Proteinbanden auf der Membran wurden mit Chemilumineszenzreagenzien nach Herstellerangaben visualisiert (Supersignal Substrat; Pierce, Rockford, IL, USA).

In-vivo-Experiment zur Cisplatin-Ototoxizität

Alle Mäuse wurden zufällig in zwei Gruppen von jeweils sechs Mäusen eingeteilt. Tiere der Gruppe 1, die als Kontrollgruppe angesehen wurden, erhielten eine intraperitoneale Injektion von PBS. Tieren der Gruppe 2 wurde Cisplatin (4 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion an 4 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Die Tiere wurden dann am Tag nach der letzten Cisplatin-Injektion unter Narkose mit CO2-Gas getötet, wonach der Schläfenbein des rechten Ohrs entfernt wurde.

Messung der ABR

Zur weiteren Analyse der Hörschwelle wurde die ABR vor und 24 h nach der abschließenden Behandlung mit Cisplatin gemessen. Die ABR-Schwellenänderungen zwischen Vor- und Nachbehandlung wurden dann verglichen. Mäuse wurden mit einem Cocktail aus Ketamin (40 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) betäubt und während der ABR-Aufzeichnung mit einem Heizkissen warm gehalten. Am Scheitelpunkt wurde eine subdermale (aktive) Nadelelektrode eingeführt, während Masseelektroden und Referenzelektroden subdermal in die lose Haut unter den Ohrmuscheln der gegenüberliegenden Ohren eingeführt wurden. Die Testreize bestanden aus abwechselnden Phasentonbursts bei Frequenzen von 4, 8, 16 und 32 kHz. Die Signale wurden mit der SigGen-Software von Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) generiert. Jeder Ton-Burst (1 ms Dauer) wurde durch ein Blackmann-Fenster gated und hatte eine 0,5-ms-Anstiegs-Abfall-Zeit ohne Plateau. Die Stimuli wurden vor jeder Testsitzung kalibriert, indem der Ausgang des Lautsprechers mit einem Mikrofon auf Kopfhöhe der Tiere aufgezeichnet wurde. ABR-Wellenformen wurden als Reaktion auf 300 Tonstöße bei jeder getesteten Frequenz gemittelt. Bei jeder Frequenz wurde die Amplitude des Signals automatisch in 10-dB-Schritten von 90 dB SPL gedämpft, bis die ABR-Wellen in Spuren verschwanden, die mit Filtereinstellungen von 100-3 000 Hz aufgezeichnet wurden. Die Beurteilung der Schwelle erfolgte offline durch zwei unabhängige, experimentell blinde Beobachter auf der Grundlage der ABR-Aufzeichnungen.

Oberflächenpräparation des Organs von Corti-Explantaten

Alle Mäuse wurden am Tag nach der letzten Cisplatin-Injektion getötet. Der Schläfenbein wurde herausgeschnitten und in 4% Paraformaldehyd für 16 h bei 4°C fixiert und mit 0,1 M PBS gespült. Der Schläfenbein wurde 3 Tage lang mit 10% EDTA in PBS weiter entkalkt. Die Cochlea wurde sorgfältig herausgeschnitten. Als nächstes wurden die Stria vascularis und das Spiralbandband seziert, wobei das Corti-Organ zurückblieb. Die mittlere Wendung der Cochlea wurde für 20 min in TRITC-markiertes Phalloidin (Sigma P1951, 1:100) in PBS getaucht. Nach drei Wäschen mit PBS wurde die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung geeigneter Filter für TRITC (Anregung: 510-550 nm, Emission: 590 nm) untersucht.

Immunhistochemische Färbung und TUNEL-Assay

Der entfernte Schläfenbein wurde in 4% Paraformaldehyd für 16 h fixiert und dann mit 10% EDTA in PBS für 2 Wochen entkalkt, danach dehydriert und in Paraffinwachs eingebettet. Schnitte von 5 µm wurden in Xylol entparaffiniert und durch abgestufte Ethanolkonzentrationen rehydriert. Für die immunhistochemische Studie wurde ein Immunhistochemie-Kit (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) verwendet und Verfahren gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die endogene Peroxidase wurde dann mit 3% Wasserstoffperoxid für 5 min bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Nach dem Waschen der Schnitte in PBS wurde die unspezifische Bindung mit 1% Rinderserumalbumin für 1 h blockiert. Anschließend wurden den Objektträgern Primärantikörper (1:200 verdünnt) zugesetzt, wonach die Inkubation für 1 h erfolgte. Nach wiederholten Wäschen mit PBS wurden die Schnitte mit biotinyliertem Sekundärantikörper für 30 min inkubiert und anschließend für 30 min mit einem Meerrettichperoxidase enthaltenden Sekundärantikörper abgedeckt. Abschließend wurden die Schnitte in einer frisch hergestellten Substratlösung (3 mg 3-Amino-9-ethylcarbazol in 10 ml Natriumacetatpuffer (pH 4,9), 500 µl Dimethylformamid, 0,03% wasserstoffperoxid) für 5 min angefärbt. Die Kerne der immungefärbten Zellen wurden dann mit Mayers Hämatoxylin (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotische Zellen wurden in situ unter Verwendung des TUNEL-Assays (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Deutschland) nachgewiesen. Kurz gesagt, ein Abschnitt wurde deparaffiniert und rehydriert. Nach Inkubation mit 20 µg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde die endogene Peroxidase blockiert, indem die Proben in 2% igem H2O2 in Methanol für 30 min bei RT inkubiert wurden. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in PBS gewaschen und mit Markierungslösung für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Kerne mit Propidiumiodid (0,5 µg/ml, Molecular Probes) für 10 min bei RT gegengefärbt. Nach Waschungen mit PBS wurde die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.Die mikroskop.

Reverse Transkriptase-PCR-Amplifikation

Für die Cochlea-PCR wurde der Schläfenbein des linken Ohrs schnell geerntet und in RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) bis zur Anwendung bei -20°C. Dann wurden ganze Cochlea herausgeschnitten und zur Extraktion von Gesamt-RNA unter Verwendung von TRIzol (Invitrogen) gemäß den Protokollen des Herstellers verwendet. Nach Extraktion der Gesamt-RNA mit Trizol (Invitrogen) wurde aus der Gesamt-RNA einzelsträngige cDNA synthetisiert. Als nächstes wurde eine PCR mit Taq-DNA-Polymerase (Takara, Takara Shuzo, Japan) durchgeführt, indem die Proben 30 Zyklen von 95 ° C für 40 s, 58 ° C für 40 s und 72 ° C für 50 s unterzogen wurden. Zehn Mikroliter der PCR-Produkte wurden dann auf 1,2% Agarosegel getrennt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Sequenzen der zur PCR-Amplifikation verwendeten Primer waren wie folgt: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, rückwärts, 5′-IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3′).

Statistische Analyse

Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt, und alle angegebenen Werte stellen die Mittelwerte ± SD von Dreifachanalysen dar. Die statistische multivariate Analyse wurde durch Varianzanalyse und Duncan-Tests unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS 11 (Chicago, IL, USA) durchgeführt. Zwei-Wege-ANOVA und / oder Einweg-ANOVA wurden verwendet, um die Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. Die statistischen Ergebnisse wurden von einem Master-Level-Biostatistiker überprüft. Werte von P < 0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen.