Chromosom-20-Deletionen bei myeloischen Malignomen: Reduktion der gemeinsamen deletierten Region, Erzeugung eines PAC/BAC-Contig und Identifizierung von Kandidatengenen

Chromosomenbanding und -lackierung

Knochenmarkchromosomenpräparate von 107 Fällen mit myeloischen Tumoren

An den 48 Proben mit einer kleinen 20q-Deletion wurde eine FISH-Analyse unter Verwendung einer Chromosom-20-Farbe durchgeführt. In sechs Fällen zeigte sich, dass die ’20q-Deletion‘ auf kryptische Umlagerungen zurückzuführen war. In einem Fall identifizierte das gleichzeitige Auftragen von Farben für Chromosomen 15 und 20 einen Marker, der von Chromosom 15, aber zwei normalen Chromosom 20-Homologen abgeleitet war (Abbildung 1b). In den verbleibenden fünf Fällen zeigte die Chromosomenmalerei das Vorhandensein einer unausgeglichenen Translokation mit einem wiederkehrenden Haltepunkt bei 20q11.2 und variablen Chromosomenpartnern (Abbildung 1c). In allen fünf Fällen war der der(20) -Marker das einzige Translokationsprodukt, das im Genom erhalten blieb. Darüber hinaus zeigte die FISH-Kartierung, dass der Haltepunkt auf Chromosom 20 in einer Region proximal zu D20S107 aufgetreten war, und bestätigte den Verlust des Restes des langen Arms von Chromosom 20 (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse werden an anderer Stelle ausführlich berichtet.

In den verbleibenden 42 Fällen war die Chromosomenmalerei konsistent mit einer kleinen interstitiellen Deletion von 20q (Abbildung 1d). Die Mehrheit (33 Fälle) trug eine 20q-Deletion als einzige karyotypische Anomalie. In den übrigen neun Fällen ging die 20q-Deletion mit verschiedenen zusätzlichen Chromosomenaberrationen einher (Tabelle 1). Alle 42 Fälle mit einer kleinen 20q-Deletion wurden einer weiteren FISH-Kartierung mit Locus-spezifischen Sonden unterzogen.

Deletion-Mapping-Analyse

Die 42 Patienten mit kleinen 20q-Deletionen wurden von FISH unter Verwendung einer zentromeren PAC (CEP20), einer PAC-Hybridisierung zu einer distalen Region von 20q (LSI 20q13) und einer PAC-Hybridisierung innerhalb der CDR (LSI D20S108) analysiert. Bei jedem Patienten wurden Signale von LSI 20q13 und CEP20, aber nicht von LSI D20S108 auf dem deletierten Chromosom 20 beobachtet, die das Vorhandensein einer interstitiellen Deletion bestätigten (zusammengefasst in Abbildung 3). Metaphasen von jedem Patienten wurden dann mit PACS–Mapping an den Grenzen der bekannten MPD- und MDS / AML-CDRs hybridisiert-D20S107, das an der proximalen Grenze der CDRs liegt, und D20S176, das telomer an der distalen Grenze der CDRs liegt (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

Bei 37 Patienten (25 mit MDS oder AML, 12 mit MPD) produzierten beide Sonden kein Signal auf dem gelöschten Chromosom 20, was das Vorhandensein ausgedehnter Deletionen zeigte, die nicht zur Verfeinerung des CDRs beitragen würden. Solche Proben wurden nicht weiter untersucht. Bei vier Patienten mit MDS (DB53, MH40, DB122 und DB214) und einem Patienten mit MPD (JH41) gab jedoch eine der beiden Sonden ein Signal auf dem gelöschten Chromosom 20 und diese Proben wurden genauer analysiert.

Zusätzlich zu den 42 Patienten mit kleinen 20q-Deletionen, die von FISH mit locus-spezifischen Sonden analysiert wurden, wurden weitere sechs Patienten mit einer 20q-Deletion (vier mit MDS, zwei mit MPD), von denen keine Knochenmarkmetaphasen verfügbar waren, mittels Mikrosatelliten-PCR analysiert. DNA aus gereinigten Granulozyten und T-Zellen wurde unter Verwendung eines großen Panels polymorpher Marker analysiert, die die MPD- und MDS / AML-CDRs überspannten (Tabelle 2). Alle vier MDS-Patienten hatten Deletionen, die über die Grenzen der veröffentlichten CDR hinausgingen. Bei einem der beiden MPD-Patienten (RB42) reduzierte die zentromere Grenze der Deletion jedoch die MPD-CDR erheblich (Abbildung 2, Tabelle 2).

Reduktion der gemeinsamen deletierten Region bei MDS / AML-Patienten

Die vorläufige FISH-Analyse identifizierte vier MDS-Patienten mit Deletionen, die in die MDS / AML-CDR eingriffen. Die 20q-Deletion war jeweils in allen untersuchten Metaphasen vorhanden. In drei Fällen (DB53, DB214 und MH40) lag die 20q-Deletion als einzige Anomalie vor. Bei Patient DB122 war die 20q-Deletion die ursprüngliche einzige Anomalie, wobei zwei Subklone mit Trisomie 21 oder Trisomie 8 und Trisomie 21 zusätzlich zur 20q-Deletion ebenfalls vorhanden waren. Diese vier Fälle wurden mit zusätzlichen locus-spezifischen Sonden untersucht, um die Deletionsgrenzen zu ermitteln.

Die proximale Grenze der MDS / AML-CDR wurde von den Patienten DB53, MH40 und DB122 verfeinert. Die proximale Grenze der Deletion in DB53 lag zwischen D20S107 und WI-11538 (Abbildung 3), ein Abstand von ungefähr 400 kb. Bei Patient MH40 führte eine PAC, die WI-11538 (dJ357E14) enthielt, konsistent zu einem reduzierten Signal, das mit dem Vorhandensein des proximalen Deletionshaltepunkts innerhalb dieser PAC übereinstimmte (Abbildung 3). Darüber hinaus lag die proximale Grenze der Deletion bei Patient DB122 zwischen sts-R52161 und stSG25449 (Abbildung 1e, f), ein Abstand von weniger als 200 kb (Abbildungen 3 und 4). Dies stellt eine große Verfeinerung der proximalen Grenze des MDS / AML-CDR dar.

Patient DB214 ermöglichte eine erhebliche Verfeinerung der distalen Grenze des MDS / AML-CDR. Die distale Grenze dieser Deletion lag zwischen WI-12515 und stSG40369 (Abbildung 1g, h), ein Abstand von weniger als 100 kb (Abbildungen 3 und 4).

Diese Daten reduzieren daher die MDS / AML-CDR erheblich auf einen Bereich zwischen PAC dJ620E11, der sts-R52161 enthält, und PAC dJ196H17, der WI-12515 enthält (Abbildungen 3 und 4). Der unten dargestellte Bakterienklon contig zeigt, dass die physikalische Größe dieser Region ungefähr 2,6 Mb beträgt.

Reduktion der gemeinsamen deletierten Region bei MPD-Patienten

Bei Patient JH41 (Diagnose PV) wurde zuvor durch Mikrosatelliten-PCR bestimmt, dass die proximale Grenze der Deletion zwischen D20S438 und D20S107 liegt (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, das D20S107 enthält (Abbildung 4), führte konsistent zu einem reduzierten Signal, das mit dem Vorhandensein des proximalen Deletionshaltepunkts innerhalb dieses PAC übereinstimmt (Abbildung 3).

Granulozyten und T-Zellen von zwei weiteren Patienten wurden mittels Mikrosatelliten-PCR untersucht (Tabelle 2). Ein Patient mit PV (RB42) zeigte eine Beibehaltung der Heterozygotie bei D20S108, aber einen Verlust bei D20S858 (Abbildung 2, Tabelle 2). Der proximale Haltepunkt der Deletion bei diesem Patienten lag zwischen D20S108 und D20S858, ein Abstand von weniger als 200 kb (Abbildungen 3 und 4).

Diese Daten reduzieren die MPD-CDR stark, die jetzt von D20S108 (diese Studie) und D20S481 (Wang et al., 1998). Die geschätzte physische Größe dieser Region beträgt 2.7 Mb, unter Verwendung von Daten aus dem unten dargestellten Bakterienklon contig. Der Überlappungsbereich zwischen den neuen MDS / AML- und MPD-CDRs definierte eine kombinierte ‚myeloide‘ CDR von 1,7 MB (Abbildung 3).

Ein bakterieller Klon, der die MPD und MDS / AML common deleted Regionen überspannt

Wir hatten zuvor einen 11 Mb YAC contig dieser Region von Chromosom 20 konstruiert (Bench et al., 1998a). Um eine detailliertere physische Karte zu erstellen, haben wir nun eine zusammenhängende PAC- und BAC-basierte Karte erstellt. PAC- und BAC-Klone wurden durch Hybridisierung von STSs an genomische Bibliotheken identifiziert (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Klone wurden mittels Restriktions-Fingerprinting überlappt (Gregory et al., 1997) und STS Content Mapping ermöglicht Klone in Contigs gruppiert werden. Um Contigs zu überbrücken, wurden neue STSs- und DNA-Sonden, die aus den Enden von Contigs entwickelt wurden, für das weitere Bibliotheksscreening verwendet. Neue PACs und BACs wurden dann auf die gleiche Weise zu Contigs zusammengeführt, bis eine zusammenhängende Karte erstellt wurde.

Der Bakterienklon contig enthält insgesamt 456 Bakterienklone, davon 376 PACs und 80 BACs. Es erstreckt sich von D20S607 bis SEMG1 und umfasst 202 DNA-Marker, von denen 185 STSs und 17 DNA-Sonden sind. Die Größe der Contig basierte auf durchschnittlich 3,5 kb pro HindIII-Fingerabdruckband (P Deloukas (2000), unveröffentlichte Ergebnisse). Die geschätzte Größe des Contig wurde als 5 MB berechnet, indem die Gesamtzahl der verschiedenen Fingerabdruckbänder innerhalb des Contig mit 3,5 multipliziert wurde. Eine Darstellung der Karte, die den minimalen Kachelweg und die PACs veranschaulicht, die für FISH-Experimente verwendet wurden, ist in Abbildung 4 dargestellt. Eine Vollversion der Karte finden Sie unter http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map .

Identifizierung exprimierter Sequenzen

Dreiundvierzig eindeutige ESTs befanden sich einschließlich zwischen D20S607 und stSG34035. Von diesen wurden 34 ESTs durch Hybridisierung auf ein ‚Polygrid‘ aus PACs und BACs oder durch Kolonie-PCR von Bakterienkolonien, die PACs oder BACs enthielten, kartiert (Abbildung 4). Weitere neun ESTs, die zuvor in dieser Region von Chromosom 20 abgebildet wurden (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) wurden durch Blastenausrichtung der EST-Sequenz mit der verfügbaren PAC- oder BAC-Genomsequenz auf dem Contig positioniert.

Um vermeintlich neu exprimierte Sequenzen zu identifizieren, wurden 23 PAC-Klone aus dem minimalen Tiling-Pfad teilweise oder vollständig sequenziert. Die genomische Sequenz dieser Klone wurde mit dem NIX-Programm (Williams et al., 1998), die die gleichzeitige Beobachtung einer Reihe von Genidentifikationswerkzeugen einschließlich GRAIL, GENSCAN und BLAST ermöglicht. Acht zuvor nicht zugeordnete ESTs und Gene wurden identifiziert (Tabelle 3). Sechs davon lagen innerhalb der MPD CDR und sieben lagen innerhalb der MDS CDR. Es wurde nachgewiesen, dass sechs dieser acht mutmaßlich exprimierten Sequenzen gutgläubig transkribierte Gene und nicht verarbeitete Pseudogene oder genomische DNA-Kontaminanten in der EST-Datenbank darstellten. KCNS1 ist ein Gen, das für eine kaliumspannungsgesteuerte Kanaluntereinheit kodiert. Es wurde anschließend festgestellt, dass die ESTs AA053206 / AA053121 vom SGK2-Gen abgeleitet sind (Kobayashi et al., 1999). Die Ausrichtung der cDNA-Sequenz auf die genomische Sequenz zeigte eine Exon / Intron-Struktur für drei der verbleibenden sechs ESTs (AI312497, AA568401 und AA910031) mit der Spleißstellen-Konsensussequenz, die an allen Exon / Intron-Grenzen vorhanden ist. In allen drei Fällen wurde das Vorhandensein jedes Exons durch Exonvorhersageprogramme wie GRAIL bestätigt. Die Existenz eines Exons wurde auch von GRAIL, GENSCAN und Genefinder in der Region von PAC dJ1108D11 vorhergesagt, die auf EST AA993161 ausgerichtet war, was bedeutet, dass dieses EST auch ein transkribiertes Gen darstellte.

Die Sequenzanalyse von PACs innerhalb des minimalen Kachelpfades ermöglichte es uns auch, die genomische Struktur bekannter und neuartiger Gene in dieser Region zu bestimmen. Die Ausrichtung der RPTPrho-cDNA auf die PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 und dJ269M15 zeigte, dass dieses Gen mindestens 1,2 MB umfasst. PAC dJ138B7 enthielt zwei Gene (h-l(3)mbt und SGK2) sowie den 5′-Teil des Gens, der SHGC-36858 entspricht. Insbesondere enthält das h-l (3) mbt-Gen 20 Exons mit zwei mutmaßlichen alternativen Endexons. Die Analyse von dJ644L1 zeigte, dass das humane MafB-Gen aus einem einzigen Exon besteht. Die Analyse der fertigen Sequenz wurde ebenfalls vom Sanger-Zentrum durchgeführt (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) und kann unter http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence eingesehen werden.

Diese Daten belegen das Vorhandensein von sechs Genen und weiteren 14 eindeutigen ESTs innerhalb der neuen MDS/AML-CDR und insgesamt 14 Genen mit 23 eindeutigen ESTs innerhalb der neuen MPD-CDR (Tabelle 3). Sechs Gene und 10 einzigartige ESTs sind in der Region der Überlappung zwischen den beiden CDRs vorhanden.

Expressionsprofil

Es wird angenommen, dass die myeloproliferativen Erkrankungen, myelodysplastischen Syndrome und die akute myeloische Leukämie auf die Transformation einer multipotenten Zelle innerhalb des hämatopoetischen Stammzellkompartiments zurückzuführen sind (Bonnet und Dick, 1997; Kralovics und Prchal, 1998). Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass die 20q-Deletion in einer Vorläuferzelle auftreten kann, die sowohl myeloische Zellen als auch B-Zellen hervorbringen kann (White et al., 1994). Diese Überlegungen legen nahe, dass das oder die Gene auf Chromosom 20q, die bei diesen Erkrankungen inaktiviert sind, wahrscheinlich in normalen hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden. Wir haben daher bestimmt, welche der transkribierten Sequenzen im Knochenmark exprimiert wurden und CD34-positive Zellen gereinigt.

Die Reverse Transkriptions-PCR (RT–PCR) -Amplifikation wurde mit Primern durchgeführt, die jede der 51 transkribierten Sequenzen repräsentierten (Abbildung 5). Für jede transkribierte Sequenz wurden mindestens zwei unabhängige RT–PCR-Amplifikationen durchgeführt. Primer, die einem EST (WI-7685) entsprachen, der von der 3′ UTR des CD34-Gens abgeleitet war, wurden als Positivkontrolle verwendet (Abbildung 5). Wenn zwei oder mehr ESTs derselben transkribierten Sequenz entsprachen, wurde für jedes EST das gleiche Ergebnis erhalten.

Die Daten sind in Abbildung 5, Tabellen 3 und 4 dargestellt. Von den 37 exprimierten Sequenzen im MPD-CDR wurden 20 in mononukleären Zellen des Knochenmarks exprimiert. Davon wurden 16 auch in CD34-positiven Zellen exprimiert. Innerhalb der MDS / AML-CDR wurden 11 von 20 transkribierten Sequenzen in mononukleären Zellen des Knochenmarks exprimiert. Davon wurden acht auch in CD34-positiven Zellen exprimiert. Von den 16 transkribierten Sequenzen, die im Überlappungsbereich zwischen den MPD- und MDS/ AML-CDRs liegen, wurden acht in Knochenmarkszellen exprimiert, von denen fünf auch in CD34-positiven Zellen exprimiert wurden. Diese fünf transkribierten Sequenzen stellen daher erstklassige Kandidatengene dar, da sie sowohl innerhalb der MPD- als auch der MDS / AML-CDRs liegen und innerhalb des hämatopoetischen Vorläuferzellkompartiments exprimiert werden. Dazu gehören zwei unbekannte Gene entsprechend ESTs SHGC-36858 und WI-12515 sowie drei Gene, SFRS6, h-l (3) mbt und MYBL2.