Der Chimärientest dient der routinemäßigen Dokumentation der Transplantation und der Nachsorge allogener Transplantatempfänger nach der Transplantation. Spender- und Empfängerzellen können unterschieden werden, indem genetische Marker getestet werden, die vor der Transplantation bestimmt werden.2 Bei geschlechtswidrigen Transplantaten Wenn Empfänger und Spender unterschiedlichen Geschlechts sind, wird der Anteil weiblicher und männlicher Zellen normalerweise durch Analyse von Geschlechtschromosomenmarkern bestimmt, meistens mit FISCH.8,9 Die Beurteilung der variablen Anzahl von Tandem-Wiederholungen (VNTR) oder kurzen Tandem-Wiederholungen (STR) durch PCR ist zur wertvollsten Methode zur Bestimmung des Chimärismus bei geschlechtsangepassten Transplantaten geworden.Zum Nachweis von MRD wurden 10 verschiedene Methoden entwickelt. Die morphologische Analyse des Knochenmarks kann Restkrankheiten identifizieren, die mehr als 5% des Markraums einnehmen, und es fehlt daher die notwendige Sensitivität für die Früherkennung. Außerdem ist es oft schwierig, eine kleine Leukämie-Blastenpopulation von normalen hämatopoetischen Blasten aus Spendern zu unterscheiden, die das Knochenmark wieder bevölkern, ohne zusätzliche Marker zu verwenden. Spezifische Tests können MRD nachweisen, wenn ein spezifischer Tumormarker wie eine spezifische zytogenetische Anomalie, ein spezifischer Immunphänotyp, der durch FACS identifiziert werden kann, spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen, die durch PCR amplifiziert werden können, oder ein spezifisches Wachstumsmuster in klonogenen Assays vorliegen. In Abwesenheit eines spezifischen Tumormarkers für MRD können Chimärientests verwendet werden, um vom Empfänger abgeleitete Zellen nachzuweisen. Der Nachweis von Empfängerzellen korreliert möglicherweise nicht immer mit dem Rückfallrisiko. Empfängerzellen, die zum gemischten Chimärismus (MC) beitragen, gehören zum malignen Klon oder können normale hämatopoetische Zellen oder sogar Stromazellen sein. Während der ersten Wochen nach der allogenen Standardtransplantation können Empfängerzellen noch nachgewiesen werden, wenn empfindliche Tests verwendet werden.9,11 Dies sind meist T-Zellen, die das Konditionierungsregime überleben. Wirtszellen können in niedrigen Konzentrationen (< 1%) auch später im Verlauf nach der Transplantation nachgewiesen werden. MC wird häufiger nach nicht-myeloablativer Konditionierung nachgewiesen.2 Daher sind tumorspezifische Markersonden wahrscheinlich überlegen und genauer als Sex-Mismatch-Sonden zum Nachweis von MRD.12 Selbst der Nachweis von MRD mit tumorspezifischen Tests kann jedoch nicht immer mit dem Rückfallrisiko korrelieren. Positive PCR-Tests für BCR / ABL wurden bei gesunden Personen berichtet.13 Die t (14;18) -Translokation wurde in anderen Linien als B-Lymphozyten bei Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom nachgewiesen.14 Es kann einen Schwellenwert für eine klinisch signifikante MRD geben. Bei verschiedenen Krankheiten wie AML mit t(8;21) wurden 15 lang anhaltende Remissionen in Gegenwart von MRD beobachtet, die durch PCR nachgewiesen wurden, während in anderen, wie bei akuter Promyelozytenleukämie, die PCR-Positivität einen Rückfall vorhersagt.16 Wiederum kann dies mit der Sensitivität des spezifischen PCR-Tests und der Schwelle zur klinischen Signifikanz zusammenhängen. Verbleibende maligne Zellen können sich in einem Ruhestatus befinden17, dem das Potenzial fehlt, zum Rückfall beizutragen, weil eine zweite genetische Veränderung fehlt oder gewonnen wird. Bei einigen Krankheiten kann es zu einer partiellen Differenzierung zu reiferen Zellen kommen, und diesen Zellen fehlt möglicherweise das Potenzial zur Proliferation. MRD kann unter Immunüberwachung stehen, oder die MRD-Zellen befinden sich in einer apoptotischen Phase, was sie für das Wiederauftreten der Krankheit irrelevant macht. Die empfindlichen PCR-Tests erhalten die Zellmorphologie nicht, und daher ist unklar, welche Zellen in diesen verschiedenen Fällen mit MRD korrelieren.
Das Duet™ -System zur kombinierten simultanen morphologischen und zytogenetischen multiparametrischen Analyse bietet einige Vorteile, die dazu beitragen können, die Relevanz des MRD-Nachweises aufzudecken. Dieses System durchsucht automatisch eine große Anzahl von Zellen (ungefähr 150000 Zellen pro Objektträger) nach kleinen zellulären Untergruppen mit einzigartigem zytogenetischen oder Immunphänotyp. Die Empfindlichkeit für den Nachweis kleiner Populationen wird erhöht. In einer Reihe von Verdünnungsexperimenten haben wir gezeigt, dass die Sensitivität für den Nachweis einer männlichen Zelle in einer weiblichen Zellpopulation höher als 1: 50000 ist, jedoch aufgrund der begrenzten Spezifität in diesem Titer der beste Nachweis zwischen 1: 10000 und 1: 50000 erfolgt (siehe Anhang). Wie aus der Analyse von Knochenmarkproben von Patient 1 (letzte Analyse) und Patient 2 hervorgeht, konnte das Duet ™ -System sehr kleine Populationen von XY-Empfängerzellen nachweisen, die von Routine-FISH nicht nachgewiesen wurden. Die quantitative Genauigkeit von FISCHEN hängt von der beobachteten Häufigkeit und der Anzahl der bewerteten Zellen ab, wodurch die Bewertung von mehr Zellen verbessert wird.18 Das Scoring einer so großen Anzahl von Zellen ist mit manuellen Scans nicht praktikabel, aber das automatische Duet ™ -System ist in der Lage, 10000 Zellen / min in der Hellfeldmikroskopie und 2000-10000 Zellen / h in der Fluoreszenzmikroskopie zu scannen, wodurch die Notwendigkeit eines schnellen und effizienten Scannens und einer erhöhten Empfindlichkeit unterstützt wird.
Sensitive Tests sind häufig mit einer verringerten Spezifität und einer relativ hohen falsch-positiven Rate verbunden. Bei Standard-FISH kann es aufgrund unspezifischer Hybridisierung der Sonde zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Falsch positives Scoring für chromosomale Translokationen kann aufgrund zufälliger räumlicher Assoziation und optischer Fusion auftreten.18 Das Duet ™ -System kann möglicherweise die Spezifität verbessern, indem es die Morphologie der Zellen in der gesuchten Population identifiziert. Der Nachweis der Fischpositivität in einer kleinen Population, aber mit einem einheitlichen Duett ™ morphologischen Erscheinungsbild, macht es wahrscheinlicher, dass es sich um ein echtes Positiv handelt, als wenn positive Zellen in verschiedenen, nicht verwandten Linien verstreut sind. Die Spezifität des Nachweises von MRD mit unspezifischen Chimärientests kann ebenfalls verbessert werden. Wie oben diskutiert, können Empfängerzellen zum malignen Klon gehören (wie bei Patient 1), normale hämatopoetische Zellen (Patient 3, Patient 1 nach Behandlung mit STI571) oder nicht hämatopoetische / Stromazellen (wie Osteoblasten, Patient 2) sein. Das Duet ™ -System ermöglicht die Unterscheidung zwischen diesen Optionen durch das morphologische Erscheinungsbild. Wir haben in der Analyse von Patient 1 und zwei weiteren Patienten (Daten nicht gezeigt) gezeigt, dass die Identifizierung von Empfängermerkmalen (z. B. Zytogenetik des anderen Geschlechts) innerhalb von Blasten oder unreifen Zellen einen offenen Rückfall vorhersagt und ihm einige Wochen bis einige Monate vorausgeht. Bei Patient 1 zeigten separate FISH-Analysen eine kleine XY-Empfängerpopulation (0,6%) und eine kleine BCR / ABL-positive Population (0,8%), die beide innerhalb der falsch positiven Rate der FISH-Analyse berücksichtigt werden konnten. Das Duet ™ -System hat jedoch gezeigt, dass ein großer Teil der XY-Empfängerzellen Blasten waren (und auch BCR / ABL-positiv durch einen zweiten FISH-Test an denselben Zellen) und somit vorhersagen konnten, dass der Patient einen Rückfall erleiden wird. Die Identifizierung einer kleinen Empfängerpopulation innerhalb reifer hämatopoetischer Zellen kann keinen Rückfall vorhersagen. Bei drei weiteren Patienten (Daten nicht gezeigt) haben wir eine kontinuierliche Remission in Gegenwart einer kleinen Empfängerpopulation mit reifer Morphologie dokumentiert. Größere Studien mit einem längeren Follow-up sind erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der Morphologie der verbleibenden Wirtszellen und dem Rückfallrisiko bei Patienten ohne andere eindeutige Marker für den malignen Klon zu bestätigen.
Das System ist relativ einfach zu bedienen, ist meist automatisch, seine Durchlaufzeit und Kosten sind vergleichbar mit anderen Systemen für Chimärismus und MRD-Detektion wie Standard-FISH und PCR und es kann für groß angelegte Tests geeignet sein. Abgesehen von der Hardware und den Kits des Systems wird nur Standardausrüstung benötigt, die in großen Labors verfügbar ist (siehe Anhang).
In den letzten Jahren hat das Studium des Chimärismus innerhalb verschiedener zellularer Teilmengen an Interesse und Popularität gewonnen.19,20 Dies ist nach nicht-myeloablativen Transplantationen von größter Bedeutung.2 Einige Gruppen haben gezeigt, dass ein vollständiger Chimärismus innerhalb der T-Lymphozyten für die Induktion von GVL erforderlich ist, und daher kann MC in dieser zellulären Untergruppe mit einem erhöhten Rückfallrisiko verbunden sein, insbesondere bei aggressiven, schnell wachsenden Malignomen.2,19 Chimärientests von zellulären Teilmengen erfordern ein umständliches und zeitaufwändiges Sortieren von Zellen mit dem theoretischen Potenzial, während dieses Prozesses einige Zellen zu verlieren. Wie im Anhang erläutert, verursacht die Vorbereitung von Objektträgern für die Duet™ -Analyse keinen Verlust oder eine Verringerung der Zellpopulation. Das Duet ™ -System verwendet den MGG-gefärbten Objektträger, um Lymphozyten und andere zelluläre Untergruppen zu lokalisieren, und kann auch immunzytochemische Färbungen (wie monoklonale Anti-CD3-Antikörper) verwenden, um diese Zellen zu lokalisieren. In einer zweiten Phase kann FISH für Chimärientests bei geschlechtswidrigen Transplantaten eingesetzt werden. Die Falldarstellung von Patient 3 zeigt, wie das System verwendet wurde, um den Chimärismus bei einem Patienten nach einer nicht-myeloablativen Transplantation zu verfolgen, und wie die Umwandlung in einen vollständigen Chimärismus nach Cyclosporinentzug das Auftreten von GVHD- und GVT-Reaktionen vorhersagte.
Dieser Bericht konzentriert sich auf die Verwendung von Duet ™ nach einer Knochenmarktransplantation. Das System kann auch dazu beitragen, die Zellen und Abstammungslinien zu untersuchen, die einen einzigartigen zytogenetischen oder immunphänotypischen Marker wie die BCR / ABL-Fusion (wie bei Patient 1) aufweisen, und ihre Morphologie mit dem Rückfallrisiko nach einer Standardchemotherapie zu korrelieren. Es kann helfen, die Art der MRD bei verschiedenen malignen Erkrankungen aufzudecken und warum die MRD-Erkennung nicht immer einen Rückfall vorhersagt. In bestimmten Situationen können kleine Spenderzellpopulationen oder Mikrochimärismus gesucht werden. Beispielsweise kann ein systemischer lymphohämatopoetischer Mikrochimerismus, der nach einer Transplantation fester Organe nachgewiesen wurde, die Toleranz gegenüber dem transplantierten Organ vorhersagen und die immunsuppressive Therapie steuern.21 Kleine mütterliche Populationen, die Nabelschnurblut-Allotransplantate kontaminieren, können ebenfalls auf ähnliche Weise nachgewiesen werden und Auswirkungen auf das Risiko für GVHD nach der Transplantation haben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Duet ™ -System durch die morphologische Analyse kleiner Populationen von Zellen mit Malignität oder empfängerassoziierten Markern die Genauigkeit von Chimärismus- und MRD-Tests verbessern und deren klinische Bedeutung abgrenzen kann. Dieses System verdient weitere Studien in größeren Studien.