Chimären

Was Sie bieten Teil I

• Eine kontonummer.
• Eine Mycoplasma-freie ES-Zelllinie mit 40 Chromosomen.

Was wir tun werden

• Wir werden ungefähr 50 Blastozysten pro ES-Zelllinie injizieren. Dies sollte dazu führen, dass 10 Mäuse geboren werden. Es wird erwartet, dass drei der Mäuse starke männliche Chimären sind. Wir haben eine nachgewiesene Erfolgsbilanz.
• Wir werden die Mäuse bis zum Absetzen (drei Wochen nach der Geburt) unterbringen.

Was Sie bereitstellen werden Teil II

• Sie werden die entwöhnten Mäuse beherbergen.

Kosten

• 3.300 USD pro 129 Zelllinien und die Kosten für Spenderweibchen; 4.950 USD pro Zelllinie und die Kosten für Spenderweibchen für andere genetische Hintergründe.
• Für lokale Bestellungen außerhalb der CWRU werden zusätzliche 200 USD für das Verpacken und den Transport von Mäusen berechnet. Nicht-lokale Bestellungen werden $ 200 und die Kosten für den Transport berechnet.

Einhaltung gesetzlicher Vorschriften

• Die Ermittler benötigen ein IACUC-Protokoll von ihrer Institution, um Informationen vom Core zu erhalten. CWRU IACUC-Protokolle müssen die Verwendung des transgenen Fallkerns angeben. Die Ermittler benötigen normalerweise kein eigenes IBC-Protokoll: Die Überprüfung auf rekombinante DNA bei Tieren wird anhand der Informationen durchgeführt, die über die Online-Bestellung für den transgenen Kern übermittelt wurden, und wird dem IBC-Protokoll des Kerns als hinzugefügt eine Änderung, falls genehmigt. Sie können von der IBC für zusätzliche Informationen im Rahmen der rDNA-Überprüfung nach Einreichung der Bestellung kontaktiert werden. Vor Beginn der Injektionen ist eine IBC-Genehmigung erforderlich.

Danksagungen

• Wir bitten Sie, den Fall Transgenic and Targeting Facility in Seminaren und Publikationen anzuerkennen.

Timeline

• Ab dem Injektionsdatum der Zellen dauert es mindestens 6 Wochen, bis wir Ihnen Mäuse liefern können (fast 3 Wochen Schwangerschaft und mindestens 3 Wochen postnatales Wachstum vor dem Absetzen). Es wird weitere 6 Wochen dauern, bis die männlichen Chimären alt genug sind, um zu züchten, und mindestens weitere 6 Wochen, bevor Sie Nachkommen entwöhnt haben, um den Genotyp für die Keimbahnübertragung zu testen – insgesamt 4.5 monate von der Injektion bis zur Prüfung auf Keimbahnübertragung.
• Die aktuelle (3/25/21) erwartete Zeit zwischen Auftragserteilung und ES-Zelleninjektion beträgt 8 Wochen. Während der 8 Wochen vor der Injektion wird die Chimärenanforderung vom rDNA-Komitee des IBC überprüft, die ES-Zellen werden aufgetaut und gezüchtet, und Mäuse werden bestellt und empfangen.

Erfolgsrate bei der Erzeugung chimärer Mäuse

Der Kern erzeugt durchschnittlich etwa 5 Chimären pro Zelllinie.

Erste Schritte
Die Wahrscheinlichkeit der Keimbahnübertragung einer gezielten Mutation ist mit der Anzahl der verfügbaren unabhängigen ES-Zelllinien erhöht. Im Durchschnitt werden etwa zwei Drittel bis drei Viertel der ES-Zelllinien auf dem genetischen Hintergrund von 129 Keimbahn gehen. Für ES-Zelllinien auf dem C57-Hintergrund gehen durchschnittlich nur die Hälfte bis zwei Drittel der Linien in die Keimbahn. Wenn Sie zielgerichtete ES-Zelllinien aus einem öffentlichen Repository kaufen, empfehlen wir daher, 3 oder mehr korrekt zielgerichtete Linien auf dem 129-Hintergrund und 4 oder mehr Linien auf dem C57-Hintergrund zu kaufen. Ebenso bestellen Sie 2 oder mehr Injektionen für 129 Zeilen und 3 oder mehr für C57 Zeilen. Für die Generierung von gewebespezifischen Knockouts mit bedingten Allelen in ES-Zellen von EUCOMM, siehe unseren Primer.

Häufig gestellte Fragen

Was sind Chimären?
Typischerweise werden Chimären konstruiert, um Mäuse aus gengerichteten oder gengefangenen ES-Zelllinien zu erzeugen. ES-Zellen, die in Wirtsembryonen injiziert werden, führen zu Mosaikmäusen, die als Chimären bekannt sind.
Männliche ES-Zellen werden in ungesexte Blastozysten injiziert. Wenn der Wirtsembryo weiblich ist und die männlichen ES-Zellen Keimzellen bilden, ist die Chimäre oft ein fruchtbarer Mann. Es werden Wirtsembryonen aus einem Stamm verwendet, der nicht zu stark mit den ES-Zellen konkurriert, und die beiden Komponenten (ES und Wirtsembryo) sind genetisch mit fellfarbenen Genen markiert, so dass der Beitrag der ES-Zellen zum Tier leicht bestimmt werden kann. Wenn der Anteil der ES-Zell-Nachkommen im Fell des Tieres hoch ist, ist auch die Wahrscheinlichkeit hoch, dass ES-Zellen in Gameten vertreten sind, da sich ES-Zellen früh in der Embryogenese gründlich mit Wirtszellen vermischen. Das Fellfarbmarkierungssystem ermöglicht es auch, mit geeigneten Kreuzen zu bestimmen, ob die Nachkommen der Chimären aus der ES-Zellkomponente oder der Wirtsembryokomponente stammen.

129 ES-Zellen führen zu einer braunen Fellfarbe, weil sie A / A sind (Wildtyp-Agouti), und die C57BL / 6J-Wirtsembryonen führen zu einer schwarzen Fellfarbe, weil sie a / a sind (rezessives nonagouti). Die ES-Zellen stammen vom 129-Stamm von Mäusen; Die Wirtsembryonen stammen vom C57BL / 6J-Stamm von Mäusen. Wenn diese Chimären mit a / a-Nicht-Agouti-Mäusen (z. B. C57BL / 6J) gezüchtet werden, müssen alle braunen Nachkommen (A / a) aus ES-Zell-abgeleiteten Gameten hervorgegangen sein, und es wird erwartet, dass 50% der braunen Nachkommen das Knockout-Allel tragen. Alternativ kann die Übertragung der Mutation direkt durch PCR- oder Southern-Blot-Assays von Geweben der Nachkommen untersucht werden.
Wenn die ES-Zellen vom Stamm C57BL / 6J stammen (a / a, Tyr / Tyr und schwarz), ist der Wirtsembryo Albino C57BL / 6J (a / a, Tyrc-2J / Tyrc2-J und weiß). Die Züchtung solcher Chimären zu Albino C57BL / 6J kann schwarze Nachkommen (a / a, Tyr / Tyrc-2J) aus der ES-Zellkomponente erzeugen, von denen 50% die Mutation tragen sollten, und weiße Nachkommen (a / a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) aus der Wirtsembryokomponente.
Die männlichen Chimären, die wahrscheinlich die Zielmutation übertragen, können durch kopulatorische Plug-Genotypisierung identifiziert werden.

Chimären für andere Zwecke
Wir stellen auch Aggregationschimären und diploidtetraploide Chimären her. Zwei Präimplantationsembryonen aus zwei verschiedenen Mäusestämmen werden zu einer Aggregationschimäre kombiniert. Diese Technologie kann verwendet werden, um genetische Mosaikembryonen für die Analyse der Autonomie und Nichtautonomie der Genaktion und anderer experimenteller Ziele zu erzeugen. Bei diploidtetraploiden Chimären führt die tetraploide Komponente weitgehend zu einem Großteil der vom Embryo abgeleiteten Plazenta und der diploiden Komponente zum Embryo. Diese Art von Chimäre kann verwendet werden, um festzustellen, ob ein Gen in Plazenta oder Embryo benötigt wird.

Warum sind meine Mäuse lustige Farben?
Einige ES-Zelllinien sind heterozygot für Fellfarbenallele, die sich erst in nachfolgenden Generationen zeigen. Die von uns verwendeten R1 129 ES-Zellen sind am Albino-Locus heterozygot, tragen eine Kopie des Chinchilla-Allels von Albino (cch, auch als Tyrc-ch bezeichnet) und sind am Pink-Eyed-Verdünnungslocus (p) heterozygot. Die Zucht von Nachkommen, die von R1 ES-Zellen abstammen, kann zu Mäusen führen, die schwarz sind, verschiedene Grautöne, verschiedene Brauntöne, oder gelb, abhängig von der Auswahl der Fellfarballele.

Was kann getan werden, um die Keimbahnübertragung sicherzustellen?
Die Keimbahnübertragung wird mit ES-Zellen maximiert, die ein Minimum an Zeit in Kultur verbracht haben, ein normales Chromosomenkomplement aufweisen und frei von Hefen, Bakterien und Mykoplasmen sind. Zielen Sie auf eine Zelllinie, von der Sie wissen, dass sie unter Ihren Bedingungen in Ihrer Einrichtung übertragen wird. Verwenden Sie eine elterliche Zelllinie, die die niedrigste verfügbare Passagenzahl aufweist (vorzugsweise weniger als die Passagennummer 16). Minimieren Sie die Zeit, die die Ziellinie kultiviert wird. Stellen Sie sicher, dass die Zielzelllinien die normale Anzahl von Chromosomen aufweisen. Testen Sie Ihre Zelllinie auf Mykoplasmen. Einige Zelllinien werden nicht übertragen, selbst wenn alle diese Parameter zu Ihren Gunsten sind. Selbst unter optimalen Bedingungen werden nur zwei Drittel der gezielten ES-Zelllinien über die Keimbahn übertragen. Beginnen Sie daher mit mindestens drei unabhängigen Zielzelllinien, um die Übertragung sicherzustellen.

Ich habe schwache Chimären/weibliche Chimären. Werden sie den Knockout übertragen?
Sowohl schwache Chimären als auch weibliche Chimären können mutierte Allele übertragen, wenn auch selten. Männliche Chimären, die wahrscheinlich die Zielmutation übertragen, können durch kopulatorische Plug-Genotypisierung identifiziert werden. Nur etwa 10% der weiblichen Chimären übertragen das ES-Zellgenom, wenn sie dies nur in den ersten Würfen tun, und viele ihrer männlichen Nachkommen haben Geschlechtschromosomen-Aneuploidien, die sie unfruchtbar machen (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

Warum sind meine stärksten Chimären gestorben?
Die Mortalität kann mit dem Anteil des Tieres, das aus ES-Zellen stammt, selbst für die besten Zelllinien zunehmen. Diese Mortalität ist weitgehend auf epigenetische Aberrationen zurückzuführen, die in der Kultur auftraten. Es wird angenommen, dass die epigenetischen Aberrationen durch nachfolgende Züchtung überlebender Mäuse korrigiert werden und sich zufällig vom Zielort trennen würden, auch wenn dies nicht der Fall wäre.

Auf welchen Mäusestamm züchte ich meine Mutanten?
Um die genetische Variabilität so schnell wie möglich zu minimieren, züchten Sie die Chimären auf den gleichen Hintergrund wie die ES-Zellen. Wenn die ES-Zellen 129 waren, züchten Sie die Chimären zu 129 Mäusen und Ihre Mutation wird in einem Schritt vollständig auf dem 129 Inzuchthintergrund sein. Der häufigste Inzuchthintergrund für genetische Studien ist der Stamm C57BL / 6. Wenn Ihre ES-Zellen C57BL / 6 sind, kreuzen Sie Ihre Chimären mit C57BL / 6J-Mäusen. Wenn Sie den Hintergrund ändern möchten, besteht der Standard darin, 9 serielle Kreuzungen mit dem Inzuchtstamm Ihrer Wahl durchzuführen (etwa 2,5 Jahre). Die Gründe für die 9 Generationen werden hier von Lee Silver erklärt. Alternativ wird etwa die Hälfte der Anzahl der Generationen durch markerunterstütztes Backcross oder Speed-Genics benötigt.Für eine maximale Reproduktion kreuzen Sie Ihre Mäuse mit einer Outbred-Sorte wie CD1. CD1-Mäuse wurden von Schweizer Mäusen abgeleitet, weisen einen hohen Grad an genetischer Variation auf und wurden für eine robuste Reproduktion ausgewählt.

ES-Zellen mit bedingten Allelen von EUCOMM
Für jede Zelllinie von EUCOMM müssen Sie eine Materialtransfervereinbarung abschließen. Starten Sie diesen Prozess so früh wie möglich.
Die Generationszeit von Mäusen und die Anzahl der Kreuzungen, die zur Erzeugung der experimentellen Mäuse erforderlich sind, ergeben eine Zeitspanne, die für diejenigen überraschend ist, die nicht an die Mausgenetik gewöhnt sind. Die Generationszeit von Mäusen (die Zeit vom geschlechtsreifen Erwachsenen bis zum geschlechtsreifen Nachwuchs) beträgt etwa 3 Monate.
Die EUCOMM-bedingten Allele haben typischerweise eine Frt-flankierte Kassette (eine „Frt-ed“ -Kassette). Die Kassette weist einen Spleißakzeptor auf, der praktisch das gesamte Spleißen in die Kassette umleitet, wodurch das Allel in dieser Konfiguration zu einer Funktionsverlustmutation wird. Um das bedingte Allel zu erzeugen, muss die Frt-flankierte Kassette durch Kreuzung mit Flpe-exprimierenden Mäusen entfernt werden. Das Flpe / Frt-System ist vergleichbar, unterscheidet sich jedoch vom Cre / loxP-System.
Wir werden die ES-Zellen in Wirtsembryonen injizieren, um chimäre Mäuse herzustellen. Von dort aus züchten Sie die Mäuse, um Mäuse zu erzeugen, die die Mutation tragen (Keimbahnübertragung). Diese neue Generation von Mäusen kann mit Mäusen gekreuzt werden, die Flpe exprimieren, um die Frt-ed-Kassette zu entfernen, wodurch das bedingte Allel erzeugt wird. Dann müssen Sie mehrere weitere Kreuze machen, um die experimentellen Mäuse zu erzeugen.

1. Von der ES-Zell-Injektion bis zu erwachsenen geschlechtsreifen Chimären ist die Generationszeit von Mäusen (3 Monate).
2. Die Chimären werden an Wildtyp-Mäuse gezüchtet, um die Mutante in der Keimbahn zu etablieren (3 Monate).
3. Die heterozygoten frtd-bedingten Mäuse werden mit Flpe gekreuzt, die Homozygoten exprimieren. Dies erzeugt Flpe / o, frtd und / + Nachkommen. (3 monate)
4. Die Flpe / o, frtd conditional /+ Mäuse werden zum Wildtyp gekreuzt, um das exzidierte Allel in der Keimbahn zu etablieren und Flpe wegzuzüchten, und die Exzision wird molekular in diesen conditional / + Mäusen verifiziert (3 Monate).
5. Die bedingten /+ Mäuse wurden dann miteinander gezüchtet, um homozygote bedingte Allelmäuse zu bilden (3 Monate).
6. Die bedingten / bedingten Mäuse werden zu gewebespezifischen-Cre / gewebespezifischen-Cre, null / + Mäusen gezüchtet, um die experimentellen gewebespezifischen-Cre / o, bedingten / null Mäusen und kontrollgewebespezifischen-Cre / o, bedingten / + Mäusen zu machen.

Zusätzlich müssen die Fple, null, Cre Mäuse gewonnen werden, die tissue-specific-Cre/tissue-specific-Cre, null/+ Mäuse müssen gezüchtet werden.
Außerdem sollte das bedingte Allel analysiert werden, um festzustellen, ob es sich vor der Exzision mit Cre um einen Wildtyp in der Funktion und nach der Exzision mit Cre um null handelt. Um festzustellen, ob es sich bei dem bedingten Allel vor der Exzision um einen Wildtyp handelt, sollten bedingte / bedingte und bedingte / Null-Mutanten untersucht werden, um festzustellen, ob ihr Phänotyp mit dem der +/+ – bzw. Null /+ -Mäuse übereinstimmt. Um festzustellen, ob die Cre-exzidierte Bedingung ein Nullallel ist, wird die Bedingung mit einer Keimbahn-Cre-Maus gekreuzt, und die exzidierten Bedingungen werden gekreuzt, um zu testen, ob der Phänotyp der exzidierten Bedingung / der exzidierten Bedingung mit null / null übereinstimmt und / oder dass kein Protein aus dem exzidierten bedingten Allel hergestellt wird.
Ein Reporter mit Cre-Aktivität wie RosaReporter oder idealer, der direkt zeigt, dass das interessierende Protein durch Immunfluoreszenz in den Zielzellen fehlt, ist eine wichtige Kontrolle. RosaReporter erzeugt permanente Beta-Galactosidase-Expression in allen Zellen, die Cre ausgesetzt waren.
Eine übermäßige Cre-Expression kann zu Chromosomenbrüchen führen, die Phänotypen verursachen können, die nichts mit der Funktion des bedingten Allels zu tun haben. Daher sind Geschwistermäuse, die Cre exprimieren, aber eine gewisse Genfunktion behalten (z. B. C /+), eine wichtige Kontrolle.