De rol van chordin | BMP-signalen in faryngeale ontwikkeling bij zoogdieren en DiGeorge – syndroom/ ontwikkeling

resultaten

Gastrulatiedefecten bij Chrd- / – muizen

Het door Chrd uitgescheiden Bmp-bindende eiwit wordt uitgedrukt in de muisknoop en zijn derivaten, notochord en faryngeale endoderm(Fig. 1A-F). De Chrd-proteïne bevat vier cysteine-rijke (CR) domeinen, die allen Bmps kunnen binden.CR1 en CR3 tonen de hoogste affiniteit voor Bmp4, en kunnen BMP signalsupon mRNA injectie in Xenopus embryo ‘ s(Larrain et al., 2000). Om een null allel van Chrd te genereren, bereidden wij een richtende constructie voor met de codons van het vertaaleinde in de drie mogelijke lezingskaders binnen het Signal peptide gebied. De stopcodons werden gevolgd door een frameshift en de inbrenging, na CR1, van IRES-lacZ en PGK-neo cassettes die het Chrd-gen verder ontwrichtten (Fig.1G). Transcripties van dit Chrdtm1DR allel (hierna aangeduid als Chrd -) waren niet op te sporen inchrd – / – embryo ‘ s op de knoop Stadium(Fig. 1J, pijlpunt).

heterozygote Chrdmuizen waren levensvatbaar en vruchtbaar en werden gepaard om Chrd-/- embryo ’s van verschillende ontwikkelingsniveaus te genereren. stages.At op dag E8. 5, merkten we de aanwezigheid van resorptie knobbeltjes in de baarmoeder van zwangere vrouwen en een kleine afname van het verwachte aantal chrd-/- embryo’ s (50 teruggevonden, 57 verwacht). Vier-genotypeerde homozygote mutante embryo ‘ s toonden een duidelijke verkleining van de grootte van het embryonale gebied, vergezeld van een vergroting van de allantois ten opzichte van de rest van het embryo (Fig.2A, A’). In histologische secties, een aanzienlijke hypoplasie van de neurale plaat (Fig.2B, B’), afwezigheid van somieten en notochorda (Fig. 2C, C’), en een overvloed aan extra-embryonale mesodermale cellen in de allantois (Fig. 2D, D’) werden waargenomen. De rest van de mutanten (46) waren morfologisch niet te onderscheiden van hun heterozygote en wild-type nestgenoten. Het fenotype van de fourabnormale mutanten was vergelijkbaar met, maar minder uitgesproken dan, de ventralization van het mesoderm waargenomen in dubbel homozygote Chrd;Nogmutanten (Bachiller et al., 2000) waarin bovendien ook anterieure afkapingen van de neuralplaat aanwezig waren.

bij zebravis en Xenopus veroorzaakt inactivering van Chrd anexpansion van ventraal mesoderm en reductie van dorsaal mesoderm en neuralplate (Schulte-Merker et al.,1997). Bij zoogdieren, vormt het mesoderm tijdens gastrulation door theingression van epiblastcellen door de primitieve streep. Cellen die aan het achterste uiteinde van de primitieve streep uitkomen, bewegen zich naar het extra-embryonale gebied waar ze een mesodermale afstamming veroorzaken (allantois, amnion en blooddislands van de dooierzak) die gelijk is aan het ventrale mesoderm van Xenopus. Daarentegen blijven de cellen die zich in meer voorafgaande gebieden van de breuk bevinden binnen het eigenlijke embryo en produceren het paraxiale, intermediate en laterale plaatmesoderm van de toekomstige stam. Het vroege fenotype van chrd – / – mutanten, waarbij de allantois wordt uitgebreid aan de expense van het embryonale mesoderm, is consistent met een vroege ventralization van het muizenembryo. Dit fenotype moet leiden tot de dood van de aangetaste dieren, aangezien er in latere stadia geen homozygote mutant met abnormale allantois werd teruggevonden. Analyse van dit fenotype met moleculaire markerswerd niet uitgevoerd omdat er zo weinig abnormale embryo ‘ s werden verkregen.

perinatale letaliteit

slechts 49% (95 van de 194) van de verwachte Chrd-/-dieren werd bij de geboorte teruggevonden, alle met hetzelfde volledig penetrantfenotype. Van hen was de meerderheid doodgeboren, maar enkele probeerden zonder succes hun longen op te blazen. Uitwendig waren homozygote mutante neonaten iets kleiner dan hun wild-type nestgenoten en vertoonden cyanose, microcefalie en vermindering van het uitwendige oor, dat abnormaal dicht bij het oog was geplaatst (Fig. 3A’).Histologisch onderzoek (Fig.3B ‘- C’) bleek het ontbreken van thymus (t, een derivaat van de derde faryngeale zak) en secundaire gehemelte (p), en hypoplasie van het interne oor (ie) in de mutanten. De anterieure kwab en pars intermedia van de hypofyse(pi), beide afgeleid van het dorsale orale ectoderm direct naast de cephalische grens van het anterieure endoderm, waren normaal (Fig. 3C, C’). Dit definieerde de rostrale limiet van het fenotype in de orofarynx, met malformaties beperkt tot derivaten van de Chrd-expressingendoderm. De schildklier, die zich in ventrale faryngeale endoderm aan het foramen caecum vormt, onderscheidde wel, maar was hypoplastisch en onregelmatig van vorm(TH, Fig. 3C’). De parathyroïdklieren, afgeleiden van faryngeale pouches 3 en 4, waren afwezig(gegevens niet getoond), een waarneming die consistent is met de neonatale hypocalciëmie bij personen met het syndroom van DiGeorge (DiGeorge, 1968). We concludeerdendat het fenotype van Chrd-/- doodgeboren muizen de meeste kenmerken die bij dergelijke individuen zijn beschreven, herneemt.

skeletafwijkingen

bij skeletpreparaten van Chrd – / – pasgeboren dieren waren de appendiculaire en lumbale botten normaal, maar de schedelbasis en het voorste axiale skelet vertoonden meerdere afwijkingen. Veranderingen in het temporale bot omvatten het ontbreken van de squama temporalis (st) en het inkorten van de jukbeenboog (Fig.4A, A’). We zagen ook een aanzienlijke hypoplasie van hethyoïd bot en van de schildklier en cricoïde laryngeaal kraakbeen (Fig. 4B’), en eenabnormaal kleine kaak (Fig.4C’). In de basis van de schedel leek de alisfenoïde (as)normaal, maar in de middellijn waren de basioccipitale (bo) en basisfenoïde(bs) botten versmolten, en de presphenoïde (ps) was hypoplastisch(Fig. 4D, D’). Consistent met de histologische bevindingen, de palatineplanken niet mediaal uit te breiden tot het secundaire gehemelte te vormen. In het oor werden de tympanische ring en otic capsulewerd verminderd en misvormd (Fig.4D’). Skeletafwijkingen werden ook waargenomen in cervicaland thoracale regio ‘ s van de wervelkolom. Wervellichamen (vb) waren kleiner bij Chrd – / – neonaten(Fig. 4E’), met vertraagde afbraak en incidenteel verlies van andere elementen van de wervels, zoals spinachtige processen, neurale bogen en de voorste boog van de atlas(Fig. 4E ‘ en fig. 5A’).

de skeletafwijkingen van Chrd-mutanten waren bij E14. 5 reeds detecteerbaar in kraakbeencondensaties (Fig.5A, A’). Het basioccipitale kraakbeen en het basioccipitale kraakbeen werden vervormd en het ossificatiecentrum van het basioccipitale kraakbeen werd smaller en uitgebreid tot het basioccipitale kraakbeen (Fig.5B, B’). De voorste notochordel, die aanwezig was in de middellijn van het wild-type basioccipitale, was afwezig in Chrd-mutanten (Fig. 5B, B’). De afwezigheid van een anterieure notochord werd bevestigd door histologisch onderzoek van het dienblad op E14.5 (Fig.5F’).

de door de Chrd-mutatie aangetaste botten hebben zeer verschillende oorsprong. Het basioccipitale is zuiver van somitische oorsprong; delen van de basisfenoïde ontstaan uit endochondrale ossificatie van cefalic mesenchyme; depalatine komt voort uit intramembraneuze ossificatie van neurale kam-afgeleide mesenchyme; de otic capsules onderscheiden zich van een mix van paraxiale mesodermand neurale crest cellen; en het tongbeen is strikt neurale crest afgeleid (Le Douarin and Kalcheim, 1999). Te midden van deze diversiteit van geslachten, lijkt het verenigende principe van het fenotype de locatie van misvormde structuren in de proximiteit van de Chrd-expressieve axiale mesendoderm(Fig. 1E). Deze interpretatie is consistent met de waargenomen voortijdige degeneratie van de anteriornotochord in Chrd – / – dieren, en met de eis vanprechordale plaat en mesendoderm afgeleide signalen voor de ontwikkeling van de keleton van het hoofd (Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

DiGeorge-achtige cardiovasculaire defecten

de bij de geboorte waargenomen cyanose kan een teken zijn van hartstoring. Om dit verder te onderzoeken, werden dissecties in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling uitgevoerd. Op E14.5, toonden de harten van chrd-/- dieren één enkel vat, in plaats van de normale twee, in het hartafvoerkanaal (Fig. 5D, D’, E, E’).Deze aandoening staat bij mensen bekend als persisterende truncus arteriosus en is een belangrijke misvorming bij personen met het syndroom van DiGeorge. Het gebrek aan scheiding tussen de opgaande aorta en de pulmonale romp kan de werkbelasting van de rechterventrikel verhogen, waardoor de hypertrofie ervan ontstaat, evenals de vasodilatatie, oedeem en bloedingen die bij E14.5 embryo ‘ s worden waargenomen(Fig. 5C’). Als inDiGeorge-syndroom strekten defecten in het cardiovasculaire systeem zich verder uit dan het uitstroomkanaal en omvatten ze ook de grote bloedvaten die afkomstig zijn van de faryngeale archartiesten (Fig. 6). Bij newbornChrd mutanten, de gemeenschappelijke halsslagaders direct aangesloten op de truncusarteriosus, resulterend in de afwezigheid van de brachiocephalische slagader en een deel van de aortaboog (Fig. 6A-C).De longslagaders ontstonden rechtstreeks uit de proximale truncusarteriosus, resulterend in de afwezigheid van een gemeenschappelijke pulmonale romp(Fig. 6A-C). Bovendien werden lateraliteitsdefecten waargenomen, waarbij de aorta in 40% van de mutanten abnormaal rechts draaide (Fig. 6, vergelijk 6e met 6F). Wanneer de dissecties werden uitgevoerd vanaf de posterieure, kon worden gezien dat, afhankelijk van de lateraliteit van de dalende aorta, de rechter of linker subclavische slagaders een abnormale retrooesophagealpositie (Fig. 6D-F). Soortgelijke effecten zijn beschreven in kippenembryo ‘ s met neurale crestcellen ablaties(Kirby et al., 1983), en inmice dragende deleties in de congenische Regio DiGeorge (Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutaties in Tbx1 en Fgf8(Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002;Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

bij de geboorte werd slechts 49% van de verwachte Chrd homozygote mutanten ontdekt. 48 van de verwachte 56 (86%) Chrd-/-embryo ‘ s waren echter nog in leven in nesten die werden ontleed bij E14.5, een frequentie die niet significant verschilt van die waargenomen bij E8.5 (88%). De sterke toename van de letaliteit na E14.5 valt samen met de volledige manifestatie van het cardiovasculaire fenotype en suggereert dat een storing in de bloedsomloop een belangrijke oorzaak is van de letaliteit van Chrd-/- embryo ‘ s tijdens de zwangerschap.

faryngeale afwijkingen

om het begin van het faryngeale fenotype te bepalen, hebben we zwangere vrouwen uit heterozygote paringen op verschillende tijdstippen na het coitum ontleed. Op E9.0, astage waarbij Chrd wordt uitgedrukt in de faryngeale endoderm, kunnen Chrd – / – embryo ‘ s worden geïdentificeerd door een inkeping in de nek regio (Fig.7A’, pijl). De Otic blaasjes van de mutanten werden gereduceerd tot de helft van hun normale diameter (Fig.7A’, pijlpunten) en de tweede (tongbeen) faryngeale boog was verdwenen. Faryngeale bogen drie tot zes nooit gevormd in gemuteerde embryo ‘ s(Fig. 7B ‘ en nietgetoonde gegevens). De ontbrekende of misvormde structuren zijn of directe voorlopers of spelen inductieve rollen tijdens de ontwikkeling van veel van de organen die bij geboorte in Chrd-/- muizen zijndefectief. Aangezien de meeste van de phenotypische afwijkingen waargenomen bij pasgeboren mutanten hun embryologische oorsprong hebben in de faryngeale endoderm en de perifaryngeale regio, analyseerden we de expressie van een aantal genen waarvan bekend is dat ze belangrijke ontwikkelingsrollen hebben bij erfelijke ziekten bij de mens.

we onderzochten eerst de expressie van Pax3, een transcriptie factorexpressed in neural crest, dorsal neural tube and somites (Goulding et al., 1991). Inhumans, wordt PAX3 gemuteerd in neurale crestziekten die het syndroom van Wardenburg type 1 en 3(Strachan and Read, 1994) hebben aangewezen en is samen met SOX10 een mede-regulator van het microphthalmia orMITF gen (Bondurand et al., 2000), muteerde de transcriptiefactor in Waardenburg syndrometype 2a bij mensen (Tassabehji et al.,1994). Mutatie van Pax3 in de sp2h-muis resulteert in hartafwijkingen, waaronder aanhoudende truncus arteriosus, evenals misvorming van de thymus, thyroid en bijschildklieren (Conway et al.,1997). We vonden dat pax3-expressie niet te onderscheiden was tussen mutante en wild-type embryo ‘ s bij E7.5 (niet getoond),maar bij E10.5 werden significante verschillen waargenomen. De pax3-positiveneurale kamcellen die migreren via faryngeale bogen 3, 4 en 6(Fig. 7C, pijlpunten) waren bij Chrd-/- dieren duidelijk waarneembaar(Fig. 7C’). Deze neuralcrest cellen bevolken het septum dat de aorta scheidt van de pulmonale arteryin het uitstroomkanaal, of conotruncale regio, van het hart(Li et al., 2000). Het falen van het hart neurale kam om het hart te bereiken verklaart het gebrek aan uitstroom tractseptatie en de daaropvolgende cardiovasculaire fenotype waargenomen inChrd mutanten. Interessant is dat de expressie van Pax3 in andere weefsels, zoals de mandibulaire (md) component van de eerste faryngeale boog, dermomyotomen(dm) en myoblast voorlopers in de voorpoten (fl) was onaangetast(Fig. 7C’).

vervolgens voerden we in situ hybridisatie uit met Sox10, een genemuteerde in individuen met het syndroom van Waardenburg type 4 (Pingault et al., 1998) dat wordt uitgedrukt in neurale crest-en Schwann-cellen. Bij E7. 5 was de expressie van sox10 dezelfde bij Chrd-/- embryo ‘ s en bij hun wild-type nesten (gegevens niet getoond). Bij E9, 5 was de Sox10expressie in de dorsale wortelganglia (drg) van de stam normaal(Fig. 7B, B’), maar de verdeling van gliacellen met Sox10-expressie onthulde specifieke defecten in de organisatie van het perifere zenuwstelsel in het nek-en hoofdgebied van de mutanten (Fig.7B’). In het bijzonder, craniale zintuiglijke ganglia vertoonde markedabnormaliteiten. De trigeminale (tr) en vestibulo-cochleaire (vc) ganglia,overeenkomend met respectievelijk de V en VIII craniale zenuwen, werden bij Chrd-/- embryo ‘ s samen closer gelokaliseerd dan bij wild-typelittermates. Bovendien werden abnormale zenuwprojecties gezien die de twee van hen met elkaar verbinden (Fig. 7B’, pijlpunt). De geniculate (g), petrosal (p) en nodose (n) ganglia,overeenkomend met de craniale zenuwen VII, IX en X, waren het meest aangetast, wat ofwel een extreme afname in grootte of volledige afwezigheid vertoonde. Deze drie gangliaoorkomen uit de epibranchiale placoden, en zijn bekend dat inductivesignals van anterior endoderm voor hun juiste ontwikkeling (Begbie et al., 1999). De afwezigheid van epibranchiale ganglia van placodederivaten geeft aan dat het afgescheiden proteïnchrd nodig is voor de activiteit van het inductieve signaal dat wordt afgegeven door de haryngeale endoderm.

Pax9 is een transcriptiefactor die nodig is voor de ontwikkeling van defaryngeale endoderm en zijn derivaten bij de muis(Peters and Balling, 1999; Peters et al., 1998). Op E9.5, expressie van Pax9 in de faryngeale endoderm van CRD – / – embryo ‘ s was zwakker dan in hun wild-typelittermates (pe, Fig.7D, D’). Pax9 expressie bleek dat de grootte en vorm van de keelholte werd veranderd in de Chrd mutanten, met faryngealpouches gereduceerd tot een enkele zwelling in de voorste-meeste regio (Fig. 7E, E’). Thehypoplasie van de keelholte werd bevestigd door histologische secties van E14. 5embryos, waarin de anterieure endoderm verscheen als een dunne buis waarin aangenaam verminderd lumen (ph, Fig.5F, F’). De vermindering van faryngeale endoderm is ook waargenomen bij Xenopus Chrd knockdowns(Oelgeschläger et al.,2003). Niet-faryngeale gebieden waar Pax9 mRNA normaal wordt uitgedrukt, zoals de somitische sclerotomen(sc) en facial mesenchyme (fm), vertoonden geen verschillen in de verdeling of abundantie van de transcripts (Fig.7F, F’).Uit deze studies concluderen we dat veranderingen in pax3, Sox10 enpax9-expressie beperkt zijn tot een zeer beperkt gebied van breedexpressiedomeinen, wat erop wijst dat het ontbreken van het uitgescheiden eiwit Chrd specifiek lokale reguleringsroutes verstoort die inwerken in de perifaryngeale regio rond het endoderm met Chrd-expressie.

tbx1-en Fgf8-expressie vereist chordin

om de interactie van Chrd met genen te bestuderen waarvan bekend is dat ze egeorge-of DiGeorge-achtige fenotypen veroorzaken bij muizen, analyseerden we de expressie van tbx1 en Fgf8 in Chrd-gemuteerde embryo ‘ s. Tbx1 behoort tot de T-box familie van transcriptiefactoren(Papaioannou and Silver,1998). Het maps binnen de DGS / VCFS 22q11 microdeletion in humansand is onlangs aangetoond dat DiGeorge-achtige fenotype veroorzaken bij inactivatie bij muizen (Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). De expressie van Tbx1 werd veranderd inChrd-/- embryo ‘ s. Bij wilde dieren van het type E7.5 wordt Tbx1 uitgedrukt in de foregut(toekomstige faryngeale endoderm) en het hoofdmesoderm (Fig. 8A). In dit stadium vertoonden mutante nestgenoten een duidelijke vermindering van de tbx1-expressieniveaus in dezelfde gebieden (Fig.8A’). De afname van tbx1 mRNA was even duidelijk in de faryngeale regio van Chrd homozygote embryo ‘ s bij E8.0, E8.5 ene9.0 (Fig.8B’, C’, D’). Transversale histologische secties toonden aan dat op cellulair niveau de abundantie van tbx1-transcripties drastisch werd verminderd in endoderm, zowel in de keelholte als in de voorhuid tot aan het niveau van het hepatisch diverticulum (Fig.8F-H’) vermindering van de concentratie van Tbx1 mRNA was ook duidelijk in het mesoderm, met inbegrip van kop, splanchnische (pijlpunten) ensomatisch mesoderm (pijlen) in de peripharyngeale regio(Fig.8F’, G’, H’). Bovendien was de Tbx1expressie bij E9 in de mesodermale kern van de eerste faryngeale boog verschillend, die zich uitstrekte tot het grootste deel van de boog, en tbx1 transcripten waren niet afkomstig van het Otic blaasjesje (Fig.8D-D’).

Fgf8 is een secretiegroeifactor die wordt uitgedrukt in een verscheidenheid aan tissues, waaronder het faryngeale endoderm en het naburige mesoderm(Crossley and Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Tijdens de vroege ontwikkeling is Fgf8 vereist voor gastrulatie (Sun et al., 1999) en de oprichting van de linker/rechter as van symmetrie(Meyers en Martin, 1999). Atlater stadia van Fgf8 is vereist voor ledemaat (Lewandoski et al., 2000;Moon and Capecchi, 2000) encraniofacial (Trumpp et al., 1999) ontwikkeling. Recente experimenten hebben aangetoond dat muizen met verminderde fgf8-activiteit een spectrum van cardiovasculaire enfaryngeale defecten vertonen die het syndroom van DiGeorge nauw nabootsen (Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002). Daarnaast wordt fgf8 expressie afgeschaft in de faryngeale endoderm van tbx1 – / – mutanten en beide genen interageren genetisch tijdens de differentiatie van de faryngeale boog slagaders (Vitelli et al., 2002b). AtE9, fgf8 expressie in Chrd mutanten is normaal in de mid-hindbrain isthmus, frontonasale prominentie en staart. Echter, in faryngealendoderm, Fgf8 transcript niveaus zijn drastisch verlaagd (Fig. 8E’). De vermindering van tbx1 en fgf8 uitdrukking in Chrd-/-embryo ‘ s stelde voor dat beide genen stroomafwaarts van Chrd in de zelfde regulatory weg handelen. Deze experimenten bepalen niet of Chrdis vereist is voor het onderhoud of voor de inductie van Tbx1 en fgf8 in de keelholte en naburige weefsels.

om te testen of Chrd Tbx1 en Fgf8 kan induceren,injecteerden we Chrd mRNA (50 pg) in het ventrale gebied van Xenopus embryo ‘ s in het viercellige Stadium. Ventrale marginale zone (VMZ) explantaten werden ontleed in de vroege gastrula, gekweekt tot broer of zus embryosreached vroege neurula Stadium, en geanalyseerd door RTPCR. Tbx1 en fgf8 mRNAs werden uitgedrukt op hoge niveaus in hele embryo ‘ s en dorsalmarginale zone (DMZ) explantaten in dit stadium, en op lage niveaus in VMZ explantaten(Fig. 8i, rijstroken 1-3). Uponmicro-injectie, Chrd mRNA verhoogde de niveaus van Tbx1 en fgf8 in VMZ (Fig. 8i, rijstrook 4). In situ hybridisatie van micro-geïnjecteerde Xenopus-embryosbevestigde dat de tbx1-transcripten die door Chrd mRNA werden geïnduceerd, zich in faryngeale endoderm bevonden (gegevens niet getoond). We concluderen dat chrd, een BMP-antagonist, Tbx1-en Fgf8-expressie kan induceren in Xenopus-embryo ‘ s, en vereist is voor de volledige expressie van deze genen in de faryngeale regio van het muizenembryo.