De gekloofd-Caspase-3-antilichaam is een marker van Caspase-9-als DRONC activiteit in Drosophila

Etikettering door de gekloofd-Caspase-3 antistoffen blijft dcp-1 drICE dubbele mutanten

Voor het evalueren van de specificiteit van de gekloofd-Caspase-3-antilichaam, analyseerden we oog verbeelding schijven van derde stadium larven. In wild-type oog imaginal schijven, het antilichaam detecteert een paar stervende cellen verspreid over de schijf (figuur 1a). Verrassend, in oogschijven dubbel mutant voor de null allelen dcp-1Prev en drICEΔ1 (ref.14, 15), labelt het gespleten-caspase-3 antilichaam nog steeds cellen (figuur 1b). De etikettering in DCP-1Prev drceδ1 dubbele mutanten komt in clusters voor( figuur 1b), gelijkend aan wat eerder is waargenomen toen celdood door de uitdrukking van caspase-3 inhibitor P35 werd geblokkeerd.3 deze waarnemingen zouden suggereren dat het gespleten-caspase-3 antilichaam nog een epitope in afwezigheid van de caspase-3-achtige proteã nen DCP-1 en DRICE detecteert. Niettemin, aangezien apoptosis in dit stadium niet in een bepaald patroon voorkomt, waren wij onzeker over de specificiteit van deze etiketteersignalen.

daarom gebruikten wij GMR-verborg transgenen,een goed gekenmerkt apoptotic model, 5 om de specificiteit van het gespleten-caspase-3 antilichaam verder te onderzoeken. Door GMR-gedreven uitdrukking van het pro-apoptotic gen verborg specifiek in de posterieure helft van het zich ontwikkelende oog, veroorzaken GMR-hid transgenen apoptosis in twee verschillende golven zoals getoond door gespleten-caspase-3 antilichaam en TUNEL etiketing28 (figuur 1c,d). Om de specificiteit van het gespleten-Caspase-3 antilichaam te evalueren, onderzochten we GMR-hid oogschijven die dubbel mutant waren voor dcp-1Prev en drICEΔ1. In overeenstemming met de verwachting, het verlies van DCP-1Prev en drICEΔ1 volledig elimineert TUNEL-positieve apoptosis in GMR-hid schijven (figuur 1f). Verrassend, echter, DCP-1Prev drICEΔ1 double mutant GMR-hid oogschijven nog steeds sterke immunoreactiviteit met gespleten-Caspase-3 antilichaam (figuur 1e). Aldus, ontdekt het gespleten-caspase-3 antilichaam niet of niet alleen DRICE en / of DCP-1. Wij merken wel op, dat het etiketteringsverschijning van het gespleten-caspase-3 antilichaam in afwezigheid van DCP-1 en DROCE verandert (vergelijk figuur 1c en e). Het etiketteringssignaal is niet langer beperkt tot twee verschillende golven (figuur 1c), maar vult eerder het gehele achterste compartiment van de oogschijf en is beperkt tot interommatidiale cellen (figuur 1e). Een vergelijkbare verandering van etiketteringspatroon is gemeld voor de etikettering van CM1-antilichamen bij expressie van de caspaseremmer P35.3 Deze verandering van het etiketteringspatroon is waarschijnlijk wegens het feit dat de cellen in DCP-1Prev drceδ1 dubbele mutant GMR-hid oogschijven niet sterven (figuur 1f) en zo, de epitope handhaven ontdekt door gespleten-caspase-3 antilichaam. Nochtans, is het belangrijk om op te merken dat deze analyse de opsporing van een epitope in afwezigheid van Caspase-3-als proteã nen DCP-1 en DRICE door gespleten-caspase-3 antilichaam aantoont.

immunoreactiviteit van het gekloofde-Caspase-3-antilichaam hangt af van de apoptosoomcomponenten DRONC en ARK

er zijn twee mogelijkheden waarom de gekloofde-Caspase-3-antilichaam dubbelmutantcellen van DCP-1 drICE labelt, hoewel ze niet apoptotisch zijn. Eerst, kan het antilichaam apoptotic epitope niet ontdekken; of tweede, kan het antilichaam apoptotic epitope ontdekken die stroomopwaarts of parallel aan DCP-1 en DRICE wordt geproduceerd. Om een onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden, hebben we GMR-hid Eye discs mutant onderzocht voor de apoptosoom componenten DRONC en ARK, die stroomopwaarts werken van DRICE en DCP-1. In dronc en ark mutant GMR-hid oogschijven worden zowel TUNEL als cleaved-Caspase-3 antilichaamlabels geblokkeerd (figuur 1 g,h; figuur 3a,b). Deze gegevens bevestigen dat het gespleten-caspase-3 antilichaam inderdaad een apoptotic epitope in Drosophila detecteert. Verder, omdat het er niet in slaagt om de apoptotische epitoop in dronc en ark mutanten te detecteren, maar niet in DCP-1 drICE dubbele mutanten, is het nauwkeuriger om het gespleten-Caspase-3 antilichaam te beschouwen als een marker voor DRONC activiteit, in plaats van effector caspase activiteit, in stervende Drosophila cellen.

het tripeptide ETD is het apoptotische epitoop gedetecteerd door gesplitst-Caspase-3 antilichaam

het epitoop gedetecteerd door gesplitst-Caspase-3 antilichaam hangt af van DRONC activiteit. Het kan mogelijk zijn dat het antilichaam geactiveerde DRONC direct herkent. Alternatief, is het ook mogelijk dat het gespleten-caspase-3 antilichaam een epitoop ontdekt die door de splitsing van een onbekend substraat door actieve DRONC wordt gegenereerd, onafhankelijk van DRICE en DCP-1.

om deze twee mogelijkheden te onderscheiden, hebben we de residuen van de katalytische cysteïne (Cys163) op de splitsingsplaats bij Asp175 van humaan Caspase-3 (caspase-3 peptide) afgestemd op de overeenkomstige gebieden van de Drosophila-caspasen (figuur 2a; zie ook ref. 3). De meeste C-eindresiduen van het Caspase-3-peptide, ETD, worden bewaard in DRICE en DCP-1 (Figuur 2a). Gelijkaardig aan Caspase-3, is dit de splitsingsplaats voor activering van minstens DRICE,29 en mogelijk DCP-1. Het is interessant op te merken dat de N-terminal, twee derde van het caspase-3-peptide, de grootste gelijkenis vertoont met DRONC; zes van de negen residuen worden bewaard (figuur 2a). Dit deel van caspase-3 peptide is minder goed geconserveerd in DROCE, DCP-1 en de resterende Drosophila caspases. Hoewel splitsing tussen de grote en kleine subeenheden van DRONC niet noodzakelijk is voor zijn activiteit,30, 31 en mogelijk niet in vivo plaatsvindt, hebben we de mogelijkheid overwogen dat antilichamen gericht tegen het n-terminale deel van caspase-3 peptide actieve DRONC direct kunnen detecteren in afstervende cellen.

we gebruikten blokkerende peptiden om te evalueren welke epitopen van het caspase-3-peptide worden gedetecteerd door het gespleten caspase-3-antilichaam in stervende Drosophila-cellen. De opeenvolgingen van de blokkerende peptiden worden getoond in Figuur 2b en onderstreept in Figuur 2a. Blocking peptide A (TETD) wordt afgeleid van DRICE en DCP-1 en blocking peptide B (CRGDEYDLG) komt overeen met het gebied met de hoogste gelijkenis in DRONC (figuur 2a,b). Peptide C is een controlepeptide dat overeenkomt met de residuen direct naast peptide B in DRONC (figuur 2a,b). Peptide D is een andere controlepeptide, die zeer gelijkaardig aan peptide A is en uit prodomain van DRONC bij positie 113 wordt afgeleid. Als PRODOMAIN van DRONC op deze plaats wordt gesplitst, zal het ESD bij zijn c-Eindpunt blootstellen, dat zeer gelijkaardig aan het c-Eindpunt van caspase-3 peptide (ETD, peptide A) is en kan, aldus, door het gespleten-caspase-3 antilichaam worden ontdekt.

de blokkerende peptiden werden 60 minuten vóór incubatie met de imaginale schijven van het oog gemengd met het gekloofde-caspase-3-antilichaam. De resultaten van de blokkerende experimenten worden samengevat in Figuur 2b, en voor peptiden A en B getoond in Figuur 2c–f. Peptide A is voldoende om de volledige immunoreactiviteit van het gespleten-Caspase-3 antilichaam in GMR-hid en in DCP-1 drICE dubbele mutant GMR-hid oogschijven te blokkeren (figuur 2c,d). Peptide B daarentegen trekt de immunoreactiviteit van het antilichaam in deze schijven niet in (Figuur 2e,f). De controlepeptiden C en D slagen er ook niet in om de cleaved-Caspase-3 immunoreactiviteit te blokkeren (figuur 2b; gegevens niet getoond).

deze gegevens tonen aan dat het gesplitst-Caspase-3 antilichaam specifiek de epitope ETD detecteert in apoptotische cellen. Onder de Drosophila caspases, is deze epitope slechts aanwezig in DRICE en DCP-1, Daarom makend het zeer waarschijnlijk dat het antilichaam inderdaad deze effector caspases ontdekt. In tegenstelling, het feit dat de DRONC-afgeleide peptiden B, C en D er niet in slagen om immunoreactiviteit te blokkeren suggereert dat het onwaarschijnlijk is voor het antilichaam om actieve DRONC direct te ontdekken. Daarom, omdat het gespleten-Caspase-3 antilichaam geen immunoreactiviteit verliest in DCP-1 drce dubbele mutanten (figuur 1e), detecteert het ten minste één ander eiwit, dat de ETD-epitoop blootstelt op een DRONC-afhankelijke manier.

activering van DCP-1 onafhankelijk van ARK herstelt gesplitste-Caspase-3-immunoreactiviteit

de analyse in Figuur 2 suggereert, maar bewijst niet, dat het gesplitste-Caspase-3-antilichaam inderdaad gesplitste DCP-1 en DRICE detecteert. Om deze mogelijkheid direct te testen, hebben we een GMR-ΔN-dcp-1 transgene in ark mutant achtergrond uitgedrukt. ΔN-dcp-1 mist de N-terminal prodomain van DCP-1. Er wordt aangenomen dat PRODOMAIN-uitgeputte ΔN-DCP-1 Automatisch verwerken gemakkelijk bevordert, en consistente expressie onder GMR-controle induceert een oog ablatie fenotype.Dit fenotype voor oogablatie wordt veroorzaakt door de inductie van apoptose (figuur 3c,d). Zoals hierboven vermeld, veroorzaken ark-mutante klonen in GMR-hid-achtergrond geen TUNEL-positieve apoptose (figuur 3b) en heeft het gekloofde-caspase-3-antilichaam geen immunoreactiviteit in ark-klonen (figuur 3a) wat erop wijst dat noch DCP-1, noch DRICE, noch de onbekende DRONC-substraten worden gekloofd in ark-mutante klonen. Daarom testten wij of de uitdrukking van ΔN-Dcp-1 in afwezigheid van apoptosome activiteit, dat wil zeggen, in ark klonen, gekloofde-caspase-3 antilichaametikettering kan herstellen. Vergeleken met wild-type weefsel (gekenmerkt door GFP in Figuur 3c,c’), is het aantal gespleten-Caspase-3 positieve cellen sterk verminderd in ark mutant klonen (figuur 3c,c’) wat suggereert dat de activering van ΔN-DCP-1 ten minste gedeeltelijk afhankelijk is van het apoptosoom. Echter, ongeveer 50% van de ark mutant klonen (n=32) in GMR-ΔN-Dcp-1 Achtergrond bevatten gesplitste-Caspase-3 immunoreactieve cellen (pijlen in Figuur 3c, c’). Het is onwaarschijnlijk dat dit een etiketteringsvoorwerp is, omdat deze cellen ook TUNEL-positief zijn (figuur 3d, d’). Omdat DRONC inactief is in de achtergrond van de ark mutant, wat suggereert dat het gesplitste-Caspase-3-etiketteringssignaal niet wordt veroorzaakt door het onbekende DRONC-substraat, toont deze analyse aan dat het gesplitste-Caspase-3-antilichaam inderdaad gesplitste DCP-1 detecteert. Het is ook mogelijk dat het gespleten-caspase-3 antilichaam gespleten DROCE in dit experiment detecteert, omdat DCP-1 PROTEOLYTICALLY DROCE, minstens in vitro kan verwerken.Een soortgelijke analyse met DROCE kon niet worden uitgevoerd omdat GMR-droce en GMR-ΔN-droce geen fenotype voor oogablatie veroorzaken.32 Niettemin, of DCP-1 splitst DRICE in vivo of niet, gegeven de opeenvolgingsgelijkenis van DCP-1 en DRICE bij het c-Eindpunt van de grote subeenheid en peptide het blokkeren gegevens van Figuur 2, stelt het voor dat het antilichaam gespleten DRICE ook kan ontdekken.