De Chp1 chromodomain bindt de H3K9me staart en de nucleosome kern te monteren heterochromatin

Plasmiden en stammen bouw

Chp1CD mutanten voor expressie en zuivering werden gegenereerd door middel van inverse PCR met behulp van de primers vermeld in Aanvullende Tabel S2 vanaf de pET28a Chp1 chromodomain plasmide . Heterochromatine Rescue assays werden uitgevoerd door introductie van plasmiden die chp1 wt en chp1 mutant eiwit bevatten onder de endogene promotor in een chp1δ stam (SP170, zie aanvullende tabel S3) . chp1 full-length gen en zijn endogene promotor (-949 bp vanaf het begin van chp1+ codering sequentie) werden gekloond in de prep1 plasmide. CHP1 chromodomain mutanten werden gegenereerd door inverse PCR met behulp van de primers vermeld in aanvullende tabel S2 en omgezet in de aangegeven chp1δ stam.

Voor genomische integratie, de pREP1 plasmide werd aangepast voor het vervangen van de nmt1+ promotor met de volgende integratie cassette: (SphI) Regio op de 5′ van Chp1 gen (Chromosoom ik, 2215500-2215055) (AscI)—HphMX6 weerstand cassette -(SphI) Chp1 endogene promotor (Chromosoom ik, 2214829-2214664)—Chp1 codeerschema—(BamHI) Chp1 terminator (Chromosoom ik, 2210976-2210582) (BamHI). De integratiecassette (zowel de CHP1 + als de chp1loop1b/2B cassette) werd vervolgens PCR versterkt en getransformeerd door elektroporatie, in SP101, SP170 en SP64 stammen. Cellen werden vervolgens geselecteerd op Yes + Hygromycine (50 mg ml−1 Hygromycine) platen. Enkele kolonies werden geïsoleerd, PCR gescreend en gesequenced voor de genomische insertie van de hphmx6 resistentiecassette en de LOOP1B/2B mutaties.

plasmiden bevattende stammen werden gekweekt op Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu media. Alle stammen en plasmiden die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn vermeld in de aanvullende tabellen S3 en S4.

eiwitzuivering

His6-SUMO-Chp1CD en alle CD-mutanten werden uitgedrukt in E. coli BL21 (de3) (pLys) en gezuiverd door affiniteitschromatografie met behulp van Ni-NTA-hars (GE Healthcare, Freiburg, Duitsland). His6-SUMO-Chp1CD bevat trombine splitsingsplaats tussen twee tags .

in totaal werd 0,2 mM IPTG toegevoegd om eiwitexpressie te induceren, gevolgd door groei bij 18 ° C O/N. cellen werden geoogst door middel van centrifugering en opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer (20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 mM imidazol). Na het invriezen van de flits werden de cellen ontdooid en gedurende 30 minuten geïncubeerd in lysozym vóór sonicatie (Branson-Sonifier 250-uitgang 4, duty cycle 40). De suspensie werd gecentrifugeerd (12000 g, 20 min bij 4 °C) en het supernatant toegevoegd aan de ni-NTA-hars pre-equilibreerd in bindbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) en geïncubeerd gedurende 30 min bij 4 °C onder rotatie. Vervolgens werd de hars 5× gewassen met bindingsbuffer en de eiwitten werden geëlueerd in elutiebuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Chp1CD wt en mutanten werden vervolgens O/N gedyaliseerd in een buffer met 20 mm HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD werd vervolgens verder gezuiverd door gelfiltratie (Superdex 75 pg; GE Healthcare) en gedialyseerd in een buffer met 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.

Silencing assays

cellen voor silencing assays werden gegroeid tot een OD 0,7–1 en vervolgens genormaliseerd tot een uiteindelijke concentratie van 1×107 cellen ml−1 van cultuur. Tienvoudige seriële verdunningen werden gemaakt zodat de hoogste dichtheidsvlek 1×105 cellen bevatte. Cellen werden gespot op niet-selectieve (ja) en 5-fluoro-orotinezuur (5−FOA 1 g l-15-FOA) platen. De platen werden 2-3 dagen bij 32 °C geïncubeerd en afgebeeld. Cellen hebben een ura4 reporter gen ingebracht in pericentromere imr herhalingen (heterochromatische locus). Wanneer ura4-verslaggeversgen tot zwijgen wordt gebracht, kunnen cellen op 5-FOA groeien die medium bevatten. Wanneer heterochromatin verloren gaat, wordt het ura4-verslaggeversgen uitgedrukt en de cellen kunnen op 5-FOA-medium niet groeien.

detectie van RNA-niveaus door qPCR (RT-qPCR)

gistculturen (10 ml) werden gekweekt tot een OD600 van 0,7–1,5. De cellen werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 500 µl lysis buffer (300 mM naoac pH 5,2, 1% natriumdodecylsulfaat) en 500 µl fenolchloroform en geïncubeerd bij 65 °C gedurende 10 minuten met constante menging. De waterige fractie werd van fenolchloroform gescheiden door centrifugering (10 min., 20 000 g) en door precipitatie van ethanol. Nucleïnezuren werden behandeld met DNAse I (Roche, Bazel, Zwitserland) gedurende 30 min bij 37 °C gevolgd door 15 min bij 75 °C warmte-inactivatie. Complementaire DNA werd samengesteld gebruikend 100 ng van RNA en 1 pmol van oligos van DNA met Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Duitsland) gebruikend standaardvoorwaarden. RNA-niveaus werden gekwantificeerd met qPCR door gebruik te maken van de biozym DyNAmo Flash qRT-PCR kit en genormaliseerd tot euchromatic gen tdh1.

RNA – elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests

RNA-verschuivingstests werden uitgevoerd volgens de eerder gerapporteerde condities . In totaal 0.66 pmolen van 32P radioactief gelabeld 30 nt centromerisch RNA werden geïncubeerd met 10 µM Chp1 chromodomain (wild-type en mutant) in een buffer met 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT en 3% Glycerol. Voor het RNA EMSA met 100 nt dg centromere transcripten, werden 2 pmols van 32P radioactief gemerkt RNA geïncubeerd met 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmolen van chp1cd-eiwit (Mutant wt en LOOP1B/2B) in het uiteindelijke volume van 15 µl. H3K9me3 peptide (Eurogentec, Köln, Duitsland) werd toegevoegd bij een 1:1 Chp1CD – h3k9me peptide, zoals gerapporteerd in . De incubatie werd gedurende 1 uur op ijs uitgevoerd en de monsters (eindvolume 20 µl) werden vervolgens geladen op een acrylamide-TBE-Gel van 10% (Bis-Acrylamideverhouding 1:29). Voor de in vitro RNA-pull-downs werd 1 µg SUMO-Chp1CD (wild-type en LOOP1B/2B-mutant) gebonden aan 15 µl Ni-NTA-hars (GE Healthcare) en werd het H3k9me3nucleosoom toegevoegd om het chp1cd-H3k9me3nucleosoomcomplex in bindende buffer samen te stellen (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol). Na drie keer wassen met 50 µl bindbuffer, werden 2 pmolen van 32P-gelabeld 100nt dg RNA toegevoegd en geïncubeerd met de Chp1cd-Nucleosoomhars op ijs gedurende 1 uur. de hars werd gecentrifugeerd bij lage snelheid (60 g, 10 s) en de flow-through verzameld. Hars werd driemaal gewassen met ten minste 3× (v/v) Bindingsbuffer en het chp1cd-nucleosoom-RNA-complex werd geëlueerd door toevoeging van 300 mm imidazoolbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidazol), geïncubeerd gedurende 1 uur op ijs met 5 minuten interval mengen (gebonden fractie). De monsters werden geladen op een 10% TBE Native Acrylamide gel (Bis-Acrylamide verhouding 1:29) en gedurende 2 uur uitgevoerd bij 10 mA bij 4 °C. na blootstelling ‘ s nachts werden de gels gescand met behulp van de TyphoonFLA9000 fosfoimager.

chromatine-immunoprecipitatie

gistculturen (100 ml) werden gekweekt tot een OD600 van 0,7 en Vernet met 3% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 min, zoals beschreven . De reactie werd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gedoofd met 125 mM glycine. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 500 µl lysis buffer (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 m natriumacetaat, 5 mM MgCl2, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 2 mM ethyleenglycol Tetra-azijnzuur, 0,1% NP-40, 20% glycerol) bevattende proteaseremmers (proteaseremmer cocktailtabletten, Roche, compleet, ethyleendiaminetetra-azijnzuur vrij). Bevroren cellen werden gelyseerd met behulp van de MP Biospec bead klopper. Na lysis werd het extract 35× gedurende 30 s gesoniceerd (Bioruptor, Diagenode, Seraing, België) en gedurende 15 minuten gesponnen op 13 000 g om het chromatine supernatant te verkrijgen. Voor input-DNA werd 50 µl van het supernatant gebruikt. Voor immunoprecipitaties, werden de supernatants genormaliseerd op basis van de eiwitconcentratie en geïncubeerd met anti-dimethyleerde h3k9 antilichaam of anti-Chp1 antilichaam (H3K9me2, Abcam nr. Ab1220 en Chp1, abcam nr. Ab18191), geïmmobiliseerd op magnetische Dynabeads, gedurende 2 uur bij 4 °C. De parels en geïmmobiliseerde proteã ne werden 5× gewassen met 1 ml lysis buffer. Eiwitten werden geëlueerd door incubatie met 150 µl elutiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 1% natriumdodecylsulfaat) bij 65 °C gedurende 15 min. De dwarsverbindingen werden omgekeerd door incubatie bij 65 °C ‘ s nachts, gevolgd door degradatie van RNA met RNase A en eiwitdegradatie met proteïnase K. vervolgens werd DNA teruggevonden door fenolchloroformextractie en ethanolprecipitatie en gekwantificeerd met behulp van qPCR. Euchromatic gen tdh1 werd gebruikt voor normalisatie. Oligonucleotiden gebruikt in chromatin immunoprecipitation assays worden vermeld in aanvullende lijst S2.

nucleosoom in vitro reconstitutie en (H3K9me3) methylering

nucleosomen werden gereconstitueerd met Xenopus laevis histonen en de 601 sequentie zoals eerder beschreven . In vitro methylering werd gedaan zoals beschreven . De piek op + 42 Da is waargenomen in de originele publicatie en het is geen besmetting (Matt Simon, persoonlijke communicatie en beschreven in ).

in vitro Chp1CD–H3K9me3 vorming en elutie van MLA-Nucleosoomcomplex

in totaal werd 5 µg Chp1CD gebonden aan 15 µl Ni-NTA-hars in bindbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) gedurende 20 minuten bij 4 °C. De hars werd eenmaal gewassen met vijf volumes bindingsbuffer en 10 µg h3k9me3 methyl-lysine-analoge (MLA) nucleosomen werden toegevoegd (MLA-nucleosomen werden eerder gedialyseerd in bindingsbuffer) in een eindvolume van 20 µl en geïncubeerd 1 uur op ijs met constante resuspensie om de 5 minuten. Na incubatie werd de hars gecentrifugeerd (60 g voor 10 s) en de doorstroming opgevangen. De hars werd vervolgens drie keer gewassen met vijf volumes bindbuffer. Het SUMO-Chp1CD-H3k9me3nucleosoomcomplex werd geëlueerd door trombine (Sigma, München, Duitsland) toe te voegen gedurende 2 uur op ijs in 20 µl bindingsbuffer. Complexe vorming werd vervolgens beoordeeld door SDS-polyacrylamidegelelektroforese op 15% acrylamidegelen en door negatieve vlek-EM.

Chp1CD h3k9me3 peptidebindingstesten

in totaal werd 1 µg Histon H3 (1-21)- GGK(biotine) peptide (Eurogentec) geïncubeerd met 15 µl streptavidin-agarosehars (Invitrogen) in 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Vervolgens werd ongeveer 5 µg Chp1CD (zowel wt als mutanten) toegevoegd in een eindvolume van 20 µl en gedurende 1 uur geïncubeerd op ijs onder dezelfde bufferomstandigheden. De hars werd drie keer gewassen en vervolgens werd de bindingsefficiëntie beoordeeld op SDS-polyacrylamidegelelektroforese op 15% acrylamidegel. Kwantificering van de binding werd gedaan met behulp van de ImageJ software. De Binding van elke mutant werd genormaliseerd aan wt Chp1CD voor elke test.

thermoforese op microschaal (MST)

voor MST SUMO-tag werd verwijderd uit chp1cd-constructies met Ulp1-protease. In totaal werden 100 µg wild-type en mutant Chp1CD fluorescerend geëtiketteerd met behulp van de MO-L003 Monolith Protein Labeling Kit BLUE-NHS (Amine reactief) volgens de instructies van de fabrikant (Nanotemper Technologies, München, Duitsland). Een 1: 1 fluorescentie: eiwit verhouding werd geschat met behulp van de nanodrop1000 software ‘eiwitten en Labels’ functie en elk CHP1 Chromodomein werd uitgevoerd op een 15% SDS acrylamide gel om concentraties te normaliseren tot 0,1 mg ml−1.

reacties werden verzameld in 20 µl met 300 ng fluorescerend Chp1CD en toenemende hoeveelheden-Histon H3(1-21)-GGK (biotine) peptide (Eurogentec) of H3k9me3nucleosomen, in een buffer die 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT en 0,05% Tween-20 bevat. Voor h3k9me3nucleosomes-bindende assays werd glycerol toegevoegd aan 10% uiteindelijke concentrractie. Voor h3k9me3-tests werden deze verdunningen gebruikt voor metingen: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Voor de H3k9me3nucleosoomtest hebben we de volgende verdunningen gebruikt voor metingen: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

MST-runs werden uitgevoerd met standaard behandelde capillairen(Nanotemper Cat # K002) op de NT.115 monoliet instrument. Alle metingen werden uitgevoerd met 80% LED en 40% MST vermogen, met 30 s laser op tijd en 5 S Laser uit tijd. Voor elk experiment werden vijf afzonderlijke metingen uitgevoerd.

gegevens werden geanalyseerd met de GraphPad Prism software Versie 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) en de SigmaPlot software versie 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Voor de peptide-bindende assays, met de curven die een duidelijke sigmoid trend tonen, pasten we de Richards vijf parameter logistische Asymmetrische Sigmoidale vergelijking aan en berekenden automatisch de Kd. Voor de h3k9me3nucleosoom-bindende analyses, aangezien de ruwe gegevenstrend niet meer sigmoid voor alle geanalyseerde proteã nen was, werd een derde orde polynoom (kubieke) vergelijking gebruikt voor montage en het vergelijken van de ruwe gegevenspunten van wild-type Chp1CD en de verschillende mutanten. Kd werd berekend op basis van de’ interpolatie ‘ – functie van de GraphPad prism-software, met behulp van de 50% – gebonden/niet-gebonden waarde op de y-as.

nucleosoomtrypsine spijsvertering

staartloze nucleosomen werden bereid door het incuberen van gereconstitueerde nucleosomen met een geïmmobiliseerde tpck-Trypsinehars (Thermoswetenschappelijk) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een buffer met 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . De tryptische spijsvertering Genereert zeer gedefinieerde histonbanden en het is in detail gekarakteriseerd waar precies trypsine snijdt .

Nucleosoombindingstests met chp1cd-mutanten

chp1cd wild-type en mutantnucleosoombindingstests werden uitgevoerd zoals eerder beschreven voor de vorming van Chp1cd—H3KC9me3 MLA-Nucleosoomcomplex in 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Harsen en INPUTs werden uitgevoerd op SDS-polyacrylamide gelelektroforese 15% acrylamide gels. Alle monsters werden vervolgens geanalyseerd door immunoblot met anti – H3 histone (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000), of Anti-H3k9me3 antilichaam (AbCam, 1:1000), anti-geit IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) anti-konijn IgG-HRP (BioRad, München, Duitsland, 1:3000).

Negative stain elektronenmicroscopy

na trombine–elutie werd 3 µl van het chp1cd-H3KC9me3 nucleosomencomplex Gespot op een glow-lossed koperen rooster (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Duitsland) dat gedurende 45 s met een koolstoffilm van 1 nm werd bedekt. na een snelle wasbeurt met water werd het rooster gedurende 15 s geïncubeerd in 2% Uranylacetaat. Negatieve vlekbeelden werden verzameld met een FEI Morgagni transmissie elektronenmicroscoop.

Cryo-EM op het chp1cd-H3KC9me3 nucleosomen complex

Cryo-EM grids (holey carbon coated grids, Cu 300 Mesh R3 / 3+1 nm carbon layer, Quantifoil) werden bereid met behulp van een Vitrobot Mark IV (FEI Company). Cryo-EM gegevens werden verzameld met behulp van een Titan-Krios transmissie elektronenmicroscoop (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) bij 200 KeV en een vergroting van 113 000× op het vlak van de CCD met behulp van een F816 CMOS camera (TVIPS GmbH, Gauting, Duitsland) resulterend in een beeldpixelgrootte van 1,2 Å per pixel op de objectschaal (pixelgrootte van de CCD was 13,6 µm). Voor de geautomatiseerde gegevensverzameling werd gebruik gemaakt van de EM-TOOLS-software en werden de gegevens verzameld in een defocusbereik van 10 000-40 000 Å.

in totaal werden 2 480 micrografen voor het Chp1CD–h3kc9me3-complex en 991 micrografen voor de h3kc9me3-nucleosoombesturing geselecteerd voor analyse met één deeltje met behulp van het xmipp-softwarepakket (aanvullende figuur S9A) . Enkele duizenden deeltjes werden handmatig geplukt en zorgvuldig van lawaai gereinigd. Deze deeltjes werden vervolgens gebruikt voor semi-automatische en automatische particle picking in XMIPP. De contrasttransferfunctie werd bepaald door CTFFIND3 . Geselecteerde afzonderlijke deeltjes werden omgezet in SPIDER en RELION formaten voor verdere analyse (aanvullende figuur S9B). De tweedimensionale klasse gemiddelden werden gegenereerd met RELION software pakket (Aanvullende figuur S9C). Slechte klasse gemiddelden werden verwijderd uit verdere data-analyse. De driedimensionale verfijningen werden vervolgens gedaan met de SPIDER en RELION software pakketten .

unsupervised particle classification werd uitgevoerd door random seeding met de complete density maps zonder gerichte classificatie in SPIDER software package. Pogingen om gerichte classificatie te gebruiken resulteerden in een sterke bias en overbevissing van lawaai in regio ‘ s van belang. Daarom hebben we geen gerichte classificatie gebruikt om vooroordelen te verminderen. In de eerste classificatie gedaan in SPIDER, werden de klassen C0–C6 en N0–N5 backprojected met behulp van hoeken van C0 en N0 kaarten en deze klassen waren niet volledig verfijnd. Hier wilden we alleen klassen selecteren die extra dichtheid hadden die gebonden was aan het nucleosoom. Deeltjes die kaarten genereren met verschillende chp1cd-dichtheden werden gescheiden en verder geclassificeerd. Ongeveer 20 rondes van random seeding classificaties werden uitgevoerd totdat we deeltjes in vijf verschillende groepen hebben verdeeld (aanvullend figuur S3). De klassen C11–C15 werden verfijnd met RELION softwarepakket. De laatste verfijningen van Chp1CD-H3k9me3nucleosoomcomplexen (klasse C15) en Nucleosoomcontrole werden gedaan met RELION softwarepakket. Voor de uiteindelijke verfijning werd de referentie gefilterd op ~50 Å (RELION filter). De referentie die we gebruikten had geen van de kenmerken die werden waargenomen bij verfijnde reconstructies (de dubbele DNA-helix is niet opgelost, de grote groef is niet zichtbaar, α-helices zijn niet opgelost). Dit wijst op geen referentie bias in onze structuur. De resolutie van Nucleosoomcontrole bereikte 7.3 Å gebruikend auto-raffinage in RELION en C2 symmetrie (FSC 0.143 cutoff van twee onafhankelijk verfijnde kaarten). Chp1CD-H3k9me3nucleosoom complex werd verfijnd tot 10 Å (FSC 0,143 cut-off van twee onafhankelijk verfijnde kaarten) zonder symmetrie toegepast.

lokale resolutie werd berekend met behulp van Resmapsoftware (eindvolume, minRes=7, maxRes=14, automask). De gemiddelde resolutie bepaald door Resmap is 9,4 Å voor Chp1CD-H3k9me3nucleosoomcomplex, onafhankelijk van de eerder vastgestelde gemiddelde resolutie van 10 Å (FSC 0,143) (figuur 1c). Voor Chp1CD-H3k9me3nucleosoom complex is de lokale resolutie voor nucleosoom 9-10 Å en voor ligand ~ 10 Å (figuur 2a). Euler hoekverdeling voor definitieve reconstructies wordt getoond voor zowel nucleosoom als Chp1CD-H3k9me3nucleosoom complex (aanvullend figuur S9D). Alle oriëntaties zijn aanwezig met een voorkeur voor boven-en zijaanzicht.

moleculaire modellen werden gebouwd met behulp van Chimera software pakket met Star lichaam fitting van kristalstructuren . De pasvorm in dichtheid werd gedaan met Chimera opties ‘Fit in Map’ en ‘Fit in segmenten’ met slechts kleine handmatige aanpassingen. Segmentatie en visualisatie van alle cryo-EM kaarten werd ook gedaan met Chimera software .