veterinær mikrobiologi
identifikation af Clostridium chauvoei i kliniske prøver af kulturer fra blackleg-tilfælde ved hjælp af PCR –
identifikation af Clostridium chauvoei inden for materialer og kliniske tilfælde til turkis er det symptomatisk at bruge PCR
St. miyashiroi,* A. F. C. nassari; M. C. A., M. SOUSAI, J. B. CARVALHOI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biol Largico, s Larso Paulo, SP, Brasil
Iimato Grosso do Sul, Brasil
abstrakt
C. chauvoei tilstedeværelse blev påvist ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) fra supernatant af kultur i kogt kødmedium af lever -, muskel-og metatarsiske knoglemarvsprøver af syv kalve med blackleg symptomer. Isolationen under anaerobe forhold af en muskelprøve afslørede Clostridium perfringens i ren kultur.
nøgleord: Clostridium chauvoei; blackleg; bovin; PCR.
abstrakt
tilstedeværelsen af Clostridium chauvoei blev påvist ved PCR-reaktion fra kogt kødmediumkultur af lever -, muskel-og metatarsal knoglemarvsprøver fra syv kalve påvirket af symptomatisk carbuncle. Isolering af en muskelprøve under anaerobe forhold afslørede Clostridium perfringens i ren kultur.
nøgleord: Clostridium chauvoei, symptomatisk carbuncle, kvæg, PCR.
Clostridium spp er en af de slægter, der omfatter gruppen af anaerobe bakterier af betydelig medicinsk og økonomisk betydning. Clostridiosis er det generelle navn, der gives til en række sygdomme forårsaget af bakterierne i denne slægt, som kan forekomme i enhver del af kroppen, der giver betingelse for deres udvikling med deraf følgende toksinproduktion under multiplikation (1).
Clostridium chauvoei er årsagsmidlet til sortben og malignt ødem hos kvæg, får og andre drøvtyggere (4). Blackleg hos kvæg er en ikke-traumatisk endogen infektion, og en betydelig del af kvægene kan have C. chauvoei i deres lever. Berørte dyr er anorektiske, deprimerede, febrile og lamme (den ene side lem), der præsenterer en varm, smertefuld hævelse, der bliver kold, edematøs med crepitation. Døden ses inden for 12 Til 48 timer. Denne agent synes at have en præference for store muskler (lår, membran og hjerte), som ved nekropsy er mørke, røde, tørre og svampede (11). Symptomer,der ligner blackleg,kan også være forårsaget af Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens eller C. sordellii. I en nylig undersøgelse af den fylogenetiske position af C. chauvoei og C. septicum på deres 16S rRNA-gen (rrs) sekvenser blev en lighed på 99,3% mellem RRS-generne af C. chauvoei og C. septicum, der også afspejles på fænotypisk niveau, bestemt (7,8).
mens presuntiv diagnose af blackleg og malignt ødem afhænger af kliniske og patologiske fund, findes bekræftelsen af sygdom typisk ved at isolere og identificere organismen, såsom toksinproduktion og immunologiske metoder (9,13). Disse diagnostiske metoder er imidlertid tidskrævende og besværlige. Derudover kan immunologiske metoder give tvetydige resultater, fordi C. chauvoei og C. septicum har forskellige antigener til fælles (4).
nukleinsyreamplificering af en specifik målregion af bakteriegenomet ved polymerasekædereaktionen (PCR) er blevet anvendt i vid udstrækning til detektions-og diagnoseformål (15). PCR ‘ s evne til at amplificere DNA specifikt fra et lavt antal bakterier såvel som dets enkelhed, hurtighed og reproducerbarhed giver fordele i forhold til konventionelle metoder til identifikation og er faktisk blevet brugt til at identificere mange Clostridiumarter, herunder C. chauvoei i rene kulturer og i kliniske prøver (5,7,12,14). En nøjagtig diagnose af blackleg er derfor ofte vanskelig. Standarddiagnosen er baseret på et immunofluorescerende assay og på morfologiske kriterier.
i dette papir beskriver vi en PCR-baseret metode fra tidligere berigelse i kogt kødmedium af prøver fra kalve med sortben for at identificere C. chauvoei. Lever -, muskel-og metatarsiske knoglemarvsprøver fra kalve, der præsenterede blackleg-symptomer i det brasilianske efterår, blev analyseret. De indsamlede prøver var fra seks kalve fra en flok fra staten S. L. Paulo og en kalv fra staten Mato Grosso do Sul (tabel 1). Alle disse Kvæg døde pludselig og præsenterede muskel crepitation i den bageste lem.
macereret af lever-og muskelprøver og knoglemarvspinde blev inokuleret i rør med kogt kødmedium (Difco liter), der lige før blev udsat for termisk chok (100 liter i 10 minutter straks afkølet i nuværende vand) og blev derefter inkuberet ved 37 liter i 48 timer. Ti mikroliter kogt kødmedium blev dyrket i 5% fåreblodagar og inkuberet ved 37 liter i 48 timer under anaerobe forhold. Kolonier med karakteristisk form, aspekt, farve og hæmolyse blev udsat for gramfarvning til morfologisk og cellulær vægbestemmelse. Mistænkte isolater blev underkastet katalase -, lecitinase -, gelatinase -, glucose -, lactose-og tumultagtige mælkekoagulationstest til identifikation af bakteriekøn og-arter.
guanidin-thyocianatbaseret teknik (2) blev udført til DNA-ekstraktion fra supernatant af rør med kogt kødmedium. En mL af hvert rør blev centrifugeret ved 13000 g i 20 minutter, og pelleten blev resuspenderet i 200 liter Tris-EDTA-buffer før ekstraktionsprotokollen. Multipleks PCR blev udført med primere designet til flagelin gen (fliC), beskrevet af Sasaki et al. (10), specifikt for Clostridium chauvoei og Clostridium septicum, der forstærker henholdsvis 535 basepar (bp) og 294 bp. Den forreste primer FlaF er almindelig for begge arter, og FlachR og FlaseR er de omvendte primere for henholdsvis C. chauvoei og C. septicum. Amplifikation af DNA blev udført i et totalt volumen på 50 liter, med 200 liter af hver dNTP, 5 liter 10 gange reaktionsbuffer, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol af hver primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ og Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTTTTGTGAAG 3′), 1,25 UV-polymerase og 10 liter DNA. Til amplifikation, vi brugte tredive cyklusser opdelt i tre faser som følger: denaturering ved 94 liter i 60 sekunder, hybridisering ved 56 liter i 60 sekunder og forlængelse ved 72 liter i 60 sekunder. C. chauvoei IB 1559 og C. septicum 10518 (Instituto Biol-stammer) blev brugt som PCR-positive kontroller, og muskelprøve fra en normal ko blev brugt som PCR-negativ kontrol.
PCR blev også anvendt direkte fra kliniske prøver (lever, muskel og knoglemarv) under anvendelse af de samme DNA-ekstraktions-og amplifikationsprotokoller, der er citeret ovenfor. Amplifikationer blev udført i en Peltier termisk Cycler-100 (MJ-forskning), og analysen af de amplificerede produkter blev udført ved elektroforese i agarosegel 1,3% farvet med ethidiumbromid.
Gram plet af kogt kødmedium podet med de mistænkte prøver viste små gram-positive stænger med subterminale sporer i de fleste prøver (lever 1, muskler 1,2 og 7 og knoglemarv 3,4 og 5) ud over andre. Imidlertid, kun i muskel 7 prøve blev isoleret Clostridium perfringens i ren kultur, og, ingen vækst blev observeret i de andre prøver plader inkuberet under anaerobe betingelser. Multipleks PCR fra kliniske prøver viste intet positivt resultat hverken for C. chauvoei eller C. septicum. I reaktionen fra supernatanten af kogt kødmedium podet med de samme prøver var syv af dem imidlertid positive over for C. chauvoei og negative over for C. septicum (lever 1, muskler 1,2 og 7, knoglemarv 3,4 og 5), som det ses i tabel 1.
det tætte fylogenetiske forhold mellem C. chauvoei og C. septicum er en molekylær afspejling af disse organismers fænotypiske lighed. C. chauvoei er relativt vanskeligt at skelne fra C. septicum, og desuden kan C. septicum forårsage symptomer, der ligner meget blackleg symptomer (6,9).
GREGORY et al. (3) rapporterede forekomsten og behandlingen af en kvæg med sortben med høje doser penicilin. Diagnosen blev udført ved at isolere C. chauvoei fra en vatpind i myonekroseområdet og marsvin podning til identifikation.
KUHNERT et al. (7) rapporterede et system til at skelne mellem C. chauvoei og C. septicum, men det kræver begrænsning af fordøjelsen af PCR-produkterne til endelig identifikation af organismen på grund af den lille forskel i 16S rRNA-genet for begge bakterier.
vores resultater viser, at multipleks PCR-reaktion baseret på fliC-gen (10) var effektiv til at identificere C. chauvoei fra naturligt inficerede prøver dyrket i kogt kødmedium, der udfører guanidinthiocyanat til DNA-ekstraktion og differentierer denne art fra C. septicum. Imidlertid var PCR-resultater direkte fra vævsprøver negative, sandsynligvis på grund af det lave antal clostridiale mikroorganismer eller ineffektiv DNA-ekstraktionsprotokol.
isoleringen af C. chauvoei er meget vanskelig, da det kræver hårde anaerobe forhold, og kliniske prøver er ofte forurenet med andre anaerobe bakterier inklusive clostridia i jord, der vokser hurtigere end C. chauvoei i et dyrkningsmedium (9). Mikrobiologisk kultur af muskel 7 afslørede Clostridium perfringens isoleret i ren kultur under anaerobe forhold. Denne art kan også være involveret i sortbenstilfælde, og i den foreliggende undersøgelse kan den være forbundet med C. chauvoei. Under alle omstændigheder, hvis kun mikrobiologiske metoder var blevet anvendt i dette tilfælde, ville blackleg-diagnosen være forkert eller ufuldstændig. Clostridiale vacciner giver en høj grad af immunitet mod clostridiale sygdomme, og når diagnosen er korrekt, kan sygdommen let kontrolleres. Til dette skal kliniske prøver indsamles korrekt og underkastes laboratorieundersøgelse. Når alle sygdomme på grund af clostridia kan forhindres ved vaccination, hvis problemet fortsætter på trods af vaccination, skal diagnosen være forkert. Desuden er en sagsbeskrivelse af grundlæggende betydning for at gennemføre laboratorieanalyse (1).
infektioner på grund af clostridia mikroorganismer forårsager betydelige tab i produktionen, når behandlingen generelt er umulig. Kontrol og forebyggelse skal omfatte passende foranstaltninger til håndtering og sistematisk vaccination af flokken, da dyrene er i permanent kontakt med agenterne og de faktorer, der vil være i stand til at fjerne sygdommene.
påvisning af nukleinsyre af C. chauvoei fra tidligere berigelse af naturligt inficerede prøver i kogt kødmedium belyste diagnosen i disse to brasilianske udbrud af sortben, der normalt forbliver ufattelig på grund af mikrobiologisk kulturbegrænsning. På grund af PCR-teknikkens høje specificitet blev anvendelsen af marsvin til identifikation af midlet undgået.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridial toksiner potente giftstoffer, potente lægemidler. J. Venom. Anim. Toks. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Varthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Hurtig og enkel metode til oprensning af nukleinsyrer. J. Clin. Microb., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Symptomatisk carbuncle: forekomst, klinisk udvikling og opfølgning af genopretning af kvæg påvirket af “mankeira”. Ark. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstration af almindelige antigener på celleoverfladen af Clostridium chauvoei og Clostridium septicum ved indirekte immunofluorescensassay. J. Vet. Middelhavs. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; UIDA, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Hurtig påvisning og identifikation af Clostridium chauvoei ved PCR baseret på flagellingensekvens. Dyrlæge. Microb., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Fylogenetiske positioner af Clostridium chauvoei og Clostridium septicum baseret på 16S rRNA-gensekvenser. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identifikation af Clostridium chauvoei i kulturer og klinisk materiale fra blackleg ved hjælp af PCR. Dyrlæge. Microb., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigene formler til Clostridium septicum og Clostridium chauvoei.J. Sti. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikova, N.; Tamura, Y. (2002). Fylogenetisk analyse og PCR-påvisning af Clostridium chauvoei,Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi type A og B og Clostridium septicum baseret på flagellingenet. Dyrlæge. Microb., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Hurtig identifikation og differentiering af patogene clostridier i gasgangren ved polymerasekædereaktion baseret på 16S-23S rDNA spacer region. Res. Dyrlæge. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, V. L. (1982). Diagnose af Clostridiale sygdomme. J. Am. Dyrlæge. Middelhavs. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Blumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, V. R. (1997). Påvisning af Clostridium perfringens, der producerer forskellige toksiner i faece af geder ved PCR. LETT. Program. Microb., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Han, F. A. (1996). Clostridium septicum påvisning ved peroksidase-antiperoksidase (PAP) teknik, i formalin-fast, paraffin indlejret væv af får. Bue. Middelhavs. Dyrlæge., 28, 125-127.
14. A. L.; F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, V. R. (1998). PCR-påvisning af Clostridium perfringens type d i formalinfast, paraffinindlejret væv fra geder og får. LETT. Program. Microb., 29, 15-19.
15. Persing, d. H. (1996). Den rolle, som nukleinsyreforstærkning og detektion spiller i det kliniske mikrobiologiske laboratorium. Ann. Pastor Microb., 50, 349-373.