veterinární mikrobiologie
identifikace Clostridium chauvoei v klinických vzorcích kultur z případů blackleg, pomocí PCR –
identifikace Clostridium chauvoei v oblastech materiálů a klinických případů až po tyrkysovou, je symptomatické použití PCR
St miyashiroi,* a. F. C. nassari; M. C. A., M. souzai, J. B. carvalhoi; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
abstrakt
C.přítomnost chauvoei byla detekována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) ze supernatantu kultury ve vařeném masném médiu vzorků jaterní, svalové a metatarské kostní dřeně sedmi telat s příznaky blackleg. Izolace za anaerobních podmínek jednoho svalového vzorku odhalila Clostridium perfringens v čisté kultuře.
klíčová slova: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
abstrakt
přítomnost Clostridium chauvoei byla detekována PCR reakcí z vařené masové střední kultury vzorků jater, svalů a metatarzální kostní dřeně ze sedmi telat postižených symptomatickou karbunkou. Izolace vzorku svalu za anaerobních podmínek odhalila Clostridium perfringens v čisté kultuře.
klíčová slova: Clostridium chauvoei, symptomatic carbuncle, bovine, PCR.
Clostridium spp je jedním z rodů, které zahrnují skupinu anaerobních bakterií značného lékařského a ekonomického významu. Klostridióza je obecný název pro různé nemoci způsobené bakteriemi tohoto rodu, které se mohou vyskytnout v jakékoli části těla, která nabízí podmínku pro jejich vývoj s následnou produkcí toxinu během množení (1).
Clostridium chauvoei je původcem blackleg a maligního edému u skotu, ovcí a jiných přežvýkavců (4). Blackleg u skotu je netraumatická endogenní infekce a značná část skotu může mít v játrech C. chauvoei. Postižená zvířata jsou anorektická, depresivní, febrilní a chromá (jedna boční končetina), představující horký, bolestivý otok, který se stává chladným, edematózním s krepitací. Smrt je vidět během 12 až 48 hodin. Zdá se, že tento agent upřednostňuje velké svaly (stehno, bránice a srdce), které jsou při nekropsii tmavé, červené, suché a houbovité (11). Příznaky připomínající blackleg mohou být také způsobeny Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens nebo C. sordellii. V nedávné studii o fylogenetické poloze C. chauvoei A C. septicum na jejich sekvencích 16S rRNA genu (rrs) byla stanovena podobnost 99,3% mezi RRS geny C. chauvoei A C. septicum, která se také odráží na fenotypové úrovni (7,8).
zatímco předběžná diagnóza blackleg a maligního edému závisí na klinických a patologických nálezech, potvrzení onemocnění se obvykle nachází izolací a identifikací organismu, jako je produkce toxinů a imunologické metody (9,13). Tyto diagnostické metody jsou však časově náročné a namáhavé. Imunologické metody mohou navíc přinést nejednoznačné výsledky, protože C. chauvoei A C. septicum mají společné různé antigeny (4).
amplifikace nukleových kyselin specifické cílové oblasti bakteriálního genomu polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) byla široce používána pro účely detekce a diagnostiky (15). Schopnost PCR amplifikovat DNA specificky z nízkého počtu bakterií, stejně jako její jednoduchost, rychlost a reprodukovatelnost, nabízí výhody oproti konvenčním metodám identifikace a byla skutečně použita k identifikaci mnoha druhů Clostridium, včetně C.chauvoei v čistých kulturách a v klinických vzorcích (5,7,12,14). Přesná diagnóza blackleg je proto často obtížná. Standardní diagnóza je založena na imunofluorescenčním testu a na morfologických kritériích.
v tomto článku popisujeme metodu založenou na PCR z předchozího obohacení vzorků z telat blackleg ve vařeném masném médiu k identifikaci C. chauvoei. Byly analyzovány vzorky jater, svalů a metatarské kostní dřeně z telat, které vykazovaly příznaky blackleg během brazilského podzimu. Odebrané vzorky byly od šesti telat hejna ze státu São Paulo a jednoho tele ze státu Mato Grosso do Sul (Tabulka 1). Všichni tito skot náhle zemřeli a představovali svalovou krepitaci v zadní končetině.
macerované vzorky jater a svalů a výtěry kostní dřeně byly naočkovány do zkumavek s vařeným masným médiem (Difco ®), které byly těsně předtím podrobeny tepelnému šoku (100ºC po dobu 10 minut okamžitě ochlazeny v současné vodě) a poté byly inkubovány při 37ºC po dobu 48 hodin. Deset mikrolitrů vařeného masného média bylo kultivováno v 5% agaru ovčí krve a inkubováno při 37 ° C po dobu 48 hodin za anaerobních podmínek. Kolonie s charakteristickou formou, aspektem, barvou a hemolýzou byly podrobeny Gramovému barvení pro stanovení morfologické a buněčné stěny. Podezřelé izoláty byly podrobeny katalázovým, lecitinázovým, želatinázovým, glukózovým, laktózovým a bouřlivým koagulačním testům mléka pro identifikaci bakteriálního pohlaví a druhu.
technika založená na guanidin-thyocianátu (2) byla provedena pro extrakci DNA ze supernatantu zkumavek s vařeným masným médiem. Jeden mL každé zkumavky byl centrifugován při 13000 x g po dobu 20 minut a peleta byla resuspendována ve 200 µL pufru Tris-EDTA před extrakčním protokolem. Multiplex PCR byl proveden s primery navrženými pro Gen bičíku (fliC), popsaný SASAKI et al. (10), specifické pro Clostridium chauvoei a Clostridium septicum, které zesilují 535 párů bází (bp) a 294 bp. Přední primer FlaF je společný pro oba druhy a FlachR a FlaseR jsou reverzní primery pro C. chauvoei a C.septicum. Amplifikace DNA byla provedena v celkovém objemu 50 µL, s 200 µM každého dNTP, 5 µL 10x reakčního pufru, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol každého primeru (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC3′ a Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG3′), 1,25 u Taq polymerázy a 10 µL DNA. Pro zesílení jsme použili třicet cyklů rozdělených do tří fází následovně: denaturace při 94ºC po dobu 60 sekund, hybridizace při 56ºC po dobu 60 sekund a prodloužení při 72ºC po dobu 60 sekund. C. chauvoei IB 1559 a C. septicum 10518 (kmeny Instituto Biológico) byly použity jako PCR pozitivní kontroly a vzorek svalů z normální krávy byl použit jako PCR negativní kontrola.
PCR byla také aplikována přímo z klinických vzorků (játra ,sval a kostní dřeň) za použití stejných protokolů extrakce a amplifikace DNA uvedených výše. Amplifikace byly provedeny v Peltierově tepelném Cykleru-100 (výzkum MJ) a analýza amplifikovaných produktů byla provedena elektroforézou v agarózovém gelu 1,3% obarveném ethidiumbromidem.
gramová skvrna vařeného masného média naočkovaná podezřelými vzorky vykazovala ve většině vzorků (játra 1, svaly 1,2 a 7 a kostní dřeně 3,4 a 5) malé grampozitivní tyčinky se subterminálními spory. Avšak pouze ve vzorku svalu 7 byl izolován Clostridium perfringens v čisté kultuře a nebyl pozorován žádný růst v ostatních vzorcích destiček inkubovaných za anaerobních podmínek. Multiplexní PCR z klinických vzorků neprokázala žádný pozitivní výsledek ani pro C. chauvoei nebo C. septicum. V reakci ze supernatantu vařeného masného média naočkovaného stejnými vzorky však bylo sedm z nich pozitivních na C. chauvoei a negativních na C. septicum (játra 1 ,svaly 1,2 a 7, kostní dřeně 3,4 a 5), Jak je vidět v tabulce 1.
blízký fylogenetický vztah mezi C. chauvoei A C. septicum je molekulárním odrazem fenotypové podobnosti těchto organismů. C. chauvoei je relativně obtížné odlišit od C. septicum a kromě toho C. septicum může způsobit příznaky velmi podobné příznakům blackleg (6,9).
GREGORY et al. (3) hlásil výskyt a léčbu skotu přípravkem blackleg s vysokými dávkami penicilinu. Diagnóza byla provedena izolací C. chauvoei z výtěru oblasti myonekrózy a inokulace morčat pro její identifikaci.
KUHNERT et al. (7) hlásil systém pro rozlišení C. chauvoei A C. septicum, vyžaduje však omezení enzymového trávení produktů PCR pro definitivní identifikaci organismu kvůli malému rozdílu v genu 16S rRNA obou bakterií.
naše výsledky ukazují, že multiplexní PCR reakce založená na fliC genu (10) byla účinná k identifikaci C. chauvoei z přirozeně infikovaných vzorků kultivovaných ve vařeném masném médiu, které dosáhly guanidin thiokyanátu pro extrakci DNA a odlišily tento druh od C.septicum. Výsledky PCR přímo ze vzorků tkáně však byly negativní, pravděpodobně kvůli nízkému počtu klostridiálních mikroorganismů nebo neefektivnímu protokolu extrakce DNA.
izolace C. chauvoei je velmi obtížná, protože vyžaduje tvrdé anaerobní podmínky a klinické vzorky jsou často kontaminovány jinými anaerobními bakteriemi včetně klostridií v půdě, které rostou rychleji než C. chauvoei v kultivačním médiu (9). Mikrobiologická kultura svalu 7 odhalila Clostridium perfringens izolovaný v čisté kultuře za anaerobních podmínek. Tento druh může být také zapojen do případů blackleg a v této studii by mohl být spojen s C. chauvoei. Pokud by v tomto případě byly použity pouze Mikrobiologické metody, diagnóza blackleg by byla nesprávná nebo neúplná. Klostridiální vakcíny poskytují vysoký stupeň imunity proti klostridiálním onemocněním a pokud je diagnóza správná, může být onemocnění snadno kontrolováno. Za tímto účelem musí být klinické vzorky řádně odebrány a podrobeny laboratornímu vyšetření. Jakmile lze očkováním zabránit všem onemocněním způsobeným klostridií, pokud problém přetrvává i přes očkování, musí být diagnóza nesprávná. Popis případu má navíc zásadní význam pro provádění laboratorních analýz (1).
infekce způsobené mikroorganismy clostridia způsobují značné ztráty ve výrobě, jakmile je léčba obecně neproveditelná. Kontrola a prevence musí zahrnovat přiměřená opatření manipulace a systémového očkování hejna, protože zvířata jsou v trvalém kontaktu s původci a faktory, které budou schopny oddělit nemoci.
detekce nukleové kyseliny C. chauvoei z předchozího obohacení přirozeně infikovaných vzorků ve vařeném masném médiu objasnila diagnózu u těchto dvou brazilských ohnisek blackleg, která obvykle zůstává neprůkazná kvůli omezení mikrobiologické kultury. Kromě toho, vzhledem k vysoké specificitě techniky PCR, bylo zabráněno zaměstnávání morčat pro identifikaci agens.
1. Baldassi, L. (2005). Klostridiální toxiny silné jedy, silné léky. J. Venom. Animo. Toxikologie. Tropa. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Rychlá a jednoduchá metoda čištění nukleových kyselin. J. Clin. Microb., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Symptomatická karbunka: výskyt, klinický vývoj a sledování zotavení skotu postiženého „manqueira“. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstrace běžných antigenů na buněčném povrchu Clostridium chauvoei a Clostridium septicum nepřímým imunofluorescenčním testem. J.Vet. Med. Věda., 56, 371-373.
5. Kojima, a.; UIDA, i.; Sekiaki, T.; Sasaki, y.; Ogikubo, y.; Tamura, y. (2001). Rychlá detekce a identifikace Clostridium chauvoei pomocí PCR na základě genové sekvence flagelinu. Veterinář. Microb., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, s. e.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Fylogenetické pozice Clostridium chauvoei a Clostridium septicum založené na 16S rRNA genových sekvencích. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, m.; Capaul, s. e.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identifikace Clostridium chauvoei v kulturách a klinickém materiálu z blackleg pomocí PCR. Veterinář. Microb., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigenní vzorce pro Clostridium septicum a Clostridium chauvoei.J.Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Fylogenetická analýza a PCR detekce Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi typů A A B a Clostridium septicum založené na genu flagellinu. Veterinář. Microb., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Rychlá identifikace a diferenciace patogenních klostridií v plynové gangréně polymerázovou řetězovou reakcí založenou na distanční oblasti 16s-23S rDNA. Res.Veterinář. Věda., 69, 289-294.
11. Sippel, W.L. (1982). Diagnostika Klostridiálních onemocnění. J.Am. Veterinář. Med. Doc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Plumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Detekce Clostridium perfringens produkujících různé toxiny v trusu koz pomocí PCR. Lette. Aplikace. Microb., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Detekce Clostridium septicum technikou peroxidázy-antiperoxidázy (PAP) ve formalinem fixovaných parafinových tkáních ovcí. Oblouk. Med. Veterinář., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). PCR detekce Clostridium perfringens typu D v tkáních koz a ovcí fixovaných parafinem. Lette. Aplikace. Microb., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d. h. (1996). Úloha amplifikace a detekce nukleových kyselin v klinické mikrobiologické laboratoři. Anna. Rev. Microb., 50, 349-373.