výsledky a diskuse
během naší studie signalizace poškození DNA (32, 33)jsme pozorovali dvě prominentní pásma v Imunoblotech Chk1: pásmo Chk1 na 56 kDa a rychlejší migrační pásmo 43 kDa. Rychlejší migrační pásmo bylo detekováno protilátkami Chk1, které reagovaly na vnitřní kinázovou doménu nebo C-terminální sekvenci, ale ne protilátkami Chk1 rozpoznávajícími n konec (obr. 1A). Toto pásmo nebylo rozpoznáno monoklonální protilátkou G4 od Santa Cruz Biotechnology, která se běžně používá pro imunoblotovou analýzu Chk1 (24, 29). Knockdown Chk1 přes siRNA vedl ke zmizení jak CHK1, tak 43-kDa pásma, což dále potvrdilo jejich význam (obr. 1B). Protein 43-kDa nebyl ovlivněn inhibitory proteazomu a proteázy (příloha SI, obr. 1), což zvyšuje možnost, že by se mohlo jednat o alternativní variantu spoje CHK1. Národní centrum pro biotechnologickou informační databázi v současné době uvádí tři alternativně sestříhané lidské mRNA Chk1, které mají různé nepřeložené oblasti, ale kódují stejný protein CHK1 v plné délce 476 aminokyselin (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Nicméně, naše analýza s využitím est založené alternativní splicing prediktivní databáze (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) navrhl možnost jedinečného splice variant Chk1, ve kterém exon 3 je alternativně spliced nebo deleted. Abychom tuto možnost přímo otestovali, provedli jsme RT-PCR pomocí primerů v kódovací sekvenci Chk1 (obr. 1C). RT-PCR pomocí sady primerů P1, ve které byl dopředný primer navržen v rámci exonu 3, generoval jediný amplikon očekávané velikosti, zatímco RT-PCR se sadou primerů P2 nebo P3 (oba založené na sekvencích lemujících exon 3) generoval dva amplikony, jeden s očekávanou velikostí Chk1 a druhý ∼200 bp kratší (obr. 1C). Sekvenování potvrdilo, že delší amplicon byl skutečně Chk1 a zejména kratší amplicon byl alternativní variantou spoje Chk1, která postrádala exon 3 (obr. 1D a příloha SI, obr. 2A). Předpokládalo se, že tato varianta spoje se převede na n-terminálně zkrácenou formu Chk1 sestávající z 382 aminokyselin, které jsme pojmenovali Chk1-short nebo Chk1-S (obr. 1D a příloha SI, obr. 2). V gelové elektroforéze in vitro translated Chk1-S migroval podobně jako protein 43-kDa z buněk HEK293 (obr. 1E). Dále jsme imunoprecipitovali protein 43-kDa z buněčného lyzátu HEK293 pro hmotnostní spektrometrii a Potvrdili jsme jeho identitu jako Chk1-s. N-terminální zkrácení v Chk1-S je v souladu s výsledky imunoblotů, které ukazují, že nebylo rozpoznáno protilátkami reaktivními na N-terminální sekvenci Chk1 (obr. 1A). Analýza v reálném čase a RT-PCR detekovala expresi mRNA Chk1-S ve více lidských tkáních a exprese je obecně vyšší ve fetálních tkáních (příloha SI, obr. 3 A A D). Imunoblotová analýza dále detekovala expresi proteinu Chk1-S v lidských, myších a potkaních buněčných liniích a také v lidských plodových tkáních (příloha SI, obr. 3B) a myších primárních renálních tubulárních buněk (příloha SI, obr. 3C). Celovečerní cDNA Chk1-S byla také klonována ze tří normálních lidských tkání (brzlík, tlusté střevo, fetální játra) a sekvenována, aby se potvrdilo, že kóduje n-terminálně zkrácenou spojovou variantu Chk1. Společně tyto experimenty identifikovaly jedinečnou spojovou variantu Chk1, která je n-terminálně zkrácena a široce exprimována v savčích buňkách a tkáních.
identifikace Chk1-S jako jedinečné, N-terminálně zkrácené varianty spoje Chk1. (A) buněčný lyzát HEK293 byl analyzován imunoblotováním pomocí protilátek specificky rozpoznávajících n konec (α-Chk1-NT), kinázovou doménu (α-Chk1-KD) nebo C konec Chk1 (α-Chk1-CT). Kromě Chk1 byl protein 43-kDa odhalen α-Chk1-KD a α-Chk1-CT, ale ne α-Chk1-NT. (B) buňky HEK293 byly transfektovány Chk1 siRNA (siChk1) nebo kódovanou sekvencí (siCon) po dobu 48 hodin, aby se shromáždil celobuněčný lyzát pro imunoblotovou analýzu pomocí α-Chk1-KD. siChk1 snížil expresi CHK1 i proteinu 43-kDa. (C) RNA byla izolována z buněk HEK293 pro RT-PCR pomocí tří různých sad primerů pro Chk1: P1, P2 a P3 (umístění relativní sekvence jsou znázorněna na obrázku). Dva amplikony byly detekovány RT-PCR pomocí sad primerů lemujících exon 3 (P2 a P3), zatímco pouze jeden amplikon byl amplifikován pomocí sady primerů P1, z nichž přední primer byl v exonu 3 Chk1. D) schematické znázornění alternativního sestřihu Chk1, což vede k n-terminálně zkrácenému proteinu, Chk1-s. (E) Chk1-S byl klonován pro in vitro translaci a přeložený protein spolu s buněčným lyzátem HEK293 byly analyzovány imunoblotovou analýzou. In vitro přeložený Chk1 migroval podobně jako 43-kDa pásmo v buňkách HEK293.
jaká je funkce Chk1-S? Reguluje kontrolní body buněčného cyklu, jako je Chk1? S těmito otázkami jsme nejprve určili Časové a prostorové vzorce exprese Chk1-S v buněčném cyklu. Buňky HEK293 byly synchronizovány ve fázích G1, G1 / S nebo G2 / M hladem v séru, dvojitým thymidinovým blokem nebo nocodazolem. Chk1 – S byl nízký v buňkách fáze G1 a vyšší v buňkách G1/S a G2/M (příloha SI, obr. 4 A A B). Navíc, když byly buňky synchronizovány ve fázi G1/S dvojitým thymidinovým blokem a poté uvolněny, exprese Chk1 i Chk1-S se po vstupu do fáze S zvýšila (obr. 2A). Zřetelný rozdíl mezi výrazem Chk1 a CHK1-S byl ten, že zatímco exprese Chk1 dosáhla vrcholu ve fázi mid-s, exprese Chk1-s se stále zvyšovala z fáze S do fáze M (obr. 2A). Zajímavé je, že vysoké hladiny exprese Chk1 – S byly pozorovány 7 hodin po uvolnění buněčného cyklu z dvojitého thymidinového bloku, což je časový bod, kdy buňky ještě nebyly mitotické (příloha SI, obr. 4C). Dále jsme kvantifikovali poměr Chk1-S:Chk1 v asynchronních a s nebo G2/M synchronizovaných buňkách. Navzdory variacím exprese Chk1-S v HEK293, U2OS a primárních renálních tubulárních buňkách byl poměr Chk1-S: Chk1 nad 1 ve všech buňkách ve fázi G2/M (příloha SI, obr. 5). V asynchronních buňkách byly Chk1-S a Chk1 lokalizovány hlavně v jádře (příloha SI, obr. 6A). V buňkách fáze G2 / M se však některé Chk1-S a Chk1 nahromadily v centrosomech(příloha SI, obr. 6 B A C). Lokalizace Chk1 v centrosomech je kritická pro funkci kontrolního bodu G2 / M, kde zabraňuje předčasné aktivaci Cdk1 a mitotického vstupu (34, 35). Naše výsledky naznačují, že Chk1-S se může také lokalizovat na centrosomy, poskytuje prostorovou a časovou regulaci Chk1 k zahájení mitotického vstupu. Dále jsme určili účinky nadměrné exprese Chk1 nebo Chk1-S v buňkách HEK293 a U2OS. Ve srovnání s GFP-Chk1 vyvolalo GFP-Chk1-s rozlišující jaderný fenotyp, který byl charakterizován jadernou kondenzací a tvorbou mikrojader a více nebo více jader (obr. 2B). V dřívějších časových bodech vykazovaly transfekované buňky kondenzaci jaderného / chromatinu označenou slabou a bodavou fosforylací histonu-H3 (obr. 2B), svědčící o předčasném mitotickém vstupu. Později se tyto buňky vyvinuly mikrojader nebo multilobed jádra, charakteristika mitotické katastrofy (obr. 2B). Počítání buněk ukázalo, že GFP-Chk1-S indukoval jaderný fenotyp v ∼20% buněk U2OS (obr. 2C). Podobné účinky byly prokázány YFP-Chk1-S a Chk1-s-Myc (obr. 2C), což naznačuje, že pozorovaný jaderný fenotyp byl indukován CHK1-S a ne fúzními proteinovými značkami. Naproti tomu předčasný mitotický vstup nebyl vyvolán Chk1 nebo jeho kinázově mrtvým mutantem Chk1-KD (obr. 2C). Chk1-S také indukoval nápadný jaderný fenotyp v jiných typech buněk (příloha SI, obr. 7). Podobný nukleární fenotyp byl zaznamenán zejména u buněk a myších modelů, které postrádaly jednu nebo obě alely Chk1 (7, 36, 37), což naznačuje, že Chk1-S může působit jako endogenní inhibitor Chk1. Pro další testování této možnosti jsme vytvořili buněčné linie Tet-on U2OS, které mohou být indukovány k expresi Chk1, Chk1-KD nebo Chk1-s. buňky byly synchronizovány ve fázi G1/S dvojitým thymidinovým blokem, indukovaným doxycyklinem a poté uvolněny do média obsahujícího nocodazol. Asi 80% buněk exprimujících Chk1-S vstoupilo do mitózy, zatímco ∼60% buněk exprimujících Chk1 – nebo Chk1-KD Ano (obr. 2D). Důležité je, že zatímco většina mitotických buněk ve skupinách exprimujících Chk1 a Chk1-KD měla 4N DNA, ∼25% mitotických buněk ze skupiny exprimující Chk1-S mělo méně než 4N DNA (obr. 2D), což svědčí o aberantním mitotickém vstupu do těchto buněk bez dokončení replikace DNA. Kromě toho nadměrná exprese Chk1-S vedla k dřívějšímu vstupu do mitózy, jak je naznačeno výskytem pH3-pozitivních buněk (příloha SI, obr. 8). Chk1 je klíčovým regulátorem mitotického vstupu nebo přechodu S-to-G2 / M v buněčném cyklu. Fosforylací CDC25A (indukcí jeho degradace) a Wee1 zabraňuje Chk1 aktivaci CDK1 a mitotickému vstupu (5, 15-20). Ukázali jsme, že indukce Chk1-S doxycyklinem v buňkách Tet-na U2OS vedla k vyšším hladinám CDC25A a nižším hladinám fosfo-CDK1, což naznačuje, že CHK1-s antagonizoval Chk1 k indukci mitotického vstupu (obr. 2E). Specifické vyřazení Chk1-s pomocí RNAi nebylo úspěšné, protože sekvence Chk1-S je obsažena v mRNA Chk1. Antisense oligonukleotid komplementární k jedinečnému spojení exon2-exon4 v Chk1-S by však mohl specificky snížit expresi Chk1-S (příloha SI, obr. 9A). Down-regulace Chk1-S výrazně snížila buněčnou proliferaci (příloha SI, obr. 9B). Je zajímavé, že down-regulace Chk1-S významně nezměnila profil buněčného cyklu(příloha SI, obr. 9C). G2/M, vřeteno, intra-S), může Chk1-s antagonizovat Chk1, aby usnadnil progresi buněčného cyklu na více místech. Výsledkem je, že inhibice Chk1-S může zpomalit buněčný cyklus v různých fázích a vést k potlačení proliferace bez větších změn distribuce buněčného cyklu.
regulace buněčného cyklu pomocí Chk1-s. (A) buňky HEK293 byly synchronizovány dvojitým thymidinovým blokem a poté uvolněny do média obsahujícího nocodazol. (Vlevo) profil buněčného cyklu analyzovaný barvením propidium jodidem (PI) a analýzou FACS. (Vpravo) Imunoblotová analýza Chk1 a Chk1-S v buněčném lyzátu shromážděném v uvedených časových bodech po uvolnění z thymidinového bloku. Asynchronní buňky (B) buňky U2OS byly transfektovány pomocí GFP-Chk1 nebo GFP-Chk1-S (zelená) a poté fixovány pro imunofluorescenci fosfo-histonu H3 (červená) a jaderné barvení Hoechst33342 (modrá). (Horní) Chk1-S, ale ne Chk1, vyvolalo předčasnou kondenzaci chromatinu a slabé zbarvení pH3 (šipky). (Nižší) v pozdním stádiu vykazovaly buňky transfektované Chk1-S charakteristiky mitotické katastrofy včetně mikrojader a multilobedových jader (šipky). (C) buňky U2OS byly transfektovány indikovanými geny a byly počítány buňky s jaderným fenotypem předčasné kondenzace chromatinu a mitotické katastrofy. Údaje ukazují průměr ± SD; * P < 0,05 versus vektorová skupina. Výsledky ukazují, že nadměrná exprese Chk1-S konkrétně vedla k jadernému fenotypu. (D) buňky U2OS byly transfektovány indikovanými geny, synchronizovány dvojitým thymidinovým blokem a uvolněny po dobu 7 hodin. buňky byly poté fixovány pro imunofluorescenci pH3 a barvení PI a analyzovány FACS. Údaje ukazují průměr ± SD; * P < 0,05 versus vektorová skupina. Výsledky ukazují, že Chk1-s specificky indukoval předčasný mitotický vstup bez dokončení replikace DNA (buňky s <4N DNA). (E) Tet-on u2os buňky byly indukovány s doxycyklinem nebo bez něj. Buňky byly poté synchronizovány ve fázi s dvojitým thymidinovým blokem a uvolněny po dobu 7 hodin. Celobuněčný lyzát byl odebrán pro imunoblotovou analýzu indikovaných proteinů. Výsledky ukazují, že indukovaná exprese Chk1-S vedla ke zvýšení CDC25A a snížení fosfo-CDK1, což přispívá k předčasnému mitotickému vstupu.
jak Chk1-S antagonizuje Chk1? Předpokládali jsme, že Chk1-S může interagovat s Chk1 a blokovat jeho kinázovou aktivitu. Konzistentně, FLAG-Chk1-s exprimovaný v buňkách HEK293 koimunoprecipitovaných s endogenním Chk1 (obr. 3A). Navíc in vitro překládal Myc-Chk1 a Chk1-s koimunoprecipitovaný (obr. 3B), což naznačuje přímou interakci Chk1-Chk1-S. Dále jsme demonstrovali koimunoprecipitaci Chk1 S N-terminální doménou, ale ne s C-terminální doménou, Chk1-S (obr. 3C), což naznačuje požadavek n-koncové sekvence v Chk1-S na její interakci s Chk1. Funkčně jsme určili účinky Chk1-S na aktivitu CHK1 kinázy. Chk1-Myc byl exprimován a imunoprecipitován pro test in vitro kinázy v nepřítomnosti nebo přítomnosti purifikovaného Chk1-s, jak je znázorněno na obr. 3D, aktivita CHK1 kinázy byla částečně, ale významně potlačena Chk1-S, ale ne tepelně denaturovaným Chk1-s. v porovnání, Chk1-S nesnižoval aktivitu Chk2, který má podobné preference substrátu jako Chk1. Ve srovnání s Chk1 postrádá Chk1-S část kinázové domény včetně vazebného místa ATP (obr. 1D) a podle očekávání nevykazovala významnou aktivitu proteinkinázy (obr. 3D). Chk1-S může také potlačit kinázovou aktivitu N-terminálně značeného Chk1 (FLAG-Chk1)v in vitro kinázovém testu (příloha SI, obr. 10). Tyto výsledky naznačují, že Chk1-S může inhibovat Chk1 prostřednictvím molekulární interakce. Nedávná studie ukázala, že promývání Imunoprecipitátů Chk1 přísnějším radioimuno-Precipitačním testem (RIPA) může výrazně zvýšit aktivitu kinázy Chk1, což naznačuje, že Chk1 je normálně inhibován represivními faktory (29); identita represivních faktorů však není známa. Potvrdili jsme účinek promývání RIPA pufru a zejména jsme dále ukázali, že přidání exogenního Chk1-S by mohlo zvrátit účinek promývání RIPA pufru na aktivitu CHK1 kinázy (příloha SI, obr. 11), což naznačuje, že Chk1-S může být jedním z klíčových endogenních represivních faktorů pro Chk1.
Chk1-S interaguje s Chk1 za účelem potlačení jeho kinázové aktivity. (A) buňky HEK293 byly transfektovány FLAG-Chk1-S nebo prázdným vektorem za účelem sběru lyzátu pro imunoprecipitaci (IP)pomocí protilátek proti příznakům. Imunoprecipitáty byly analyzovány na Chk1 a FLAG-Chk1-S imunoblotováním pomocí anti-FLAG a anti-n terminus CHK1 protilátek. Výsledky ukazují kooperaci FLAG-Chk1 – S s endogenním Chk1. B) Chk1-Myc a Chk1-S byly vyrobeny za použití transkripční/translační soupravy TNT in vitro (Promega). (Vlevo) in vitro produkoval Chk1-Myc a Chk1-S prokázané imunoblotováním. (Vpravo) Chk1-Myc byl imunoprecipitován pomocí anti-Myc protilátek po inkubaci s nebo bez Chk1-s. imunoprecipitáty byly analyzovány na Chk1-S a Chk1-Myc imunoblotováním. Výsledky naznačují přímou interakci mezi Chk1 a CHK1-S. (C) HEK293 buňky byly transfektovány Myc-značenými Chk1 – S nebo jeho C-nebo n-terminálními delečními mutanty za účelem sběru lyzátu pro imunoprecipitaci pomocí anti-MYC protilátek. Imunoprecipitáty byly vyšetřeny na přítomnost Chk1. Výsledky ukazují koimunoprecipitaci Chk1 s Chk1-S a jeho c-terminálním delečním mutantem, ale ne s jeho n-terminálním delečním mutantem. (D) buňky HEK293 byly transfektovány Myc značenými Chk1-S, Chk1 nebo Chk2 za účelem sběru lyzátu pro imunoprecipitaci pomocí anti-MYC protilátek. Imunoprecipitáty obsahující Chk1-S-Myc, Chk1-Myc nebo Chk2-Myc byly inkubovány s Chk1-S nebo bez Chk1-S po dobu 1 hodiny a poté přidány do testu aktivity kinázy za použití Chktidu jako substrátu. Denaturovaný Chk1-S byl připraven vařením. Údaje ukazují průměr ± SD; * P < 0,05 oproti skupině Chk1-Myc. Výsledky ukazují, že nativní Chk1-S může specificky inhibovat Chk1. (E)buňky HEK293 byly transfektovány mutantem Chk1-Myc nebo CHK1-Myc(S317A/S345A). Buňky byly poté neošetřeny nebo ošetřeny 100 nM kamptothecinem po dobu 2 hodin, aby se shromáždil lyzát pro imunoprecipitaci anti-MYC protilátkami. Imunoprecipitáty byly analyzovány na Myc-Chk1, fosforylovaný (serin 345) Chk1 a Chk1-s imunoblotováním. Ve vzorcích byl také ověřen vstup Chk1. Výsledky ukazují, že Chk1-S koimunoprecipitoval nebo byl spojen s Chk1 v normálních buňkách a že asociace byla snížena během poškození DNA vyvolaného kamptothecinem. Asociace mezi Chk1-S a mutantem Chk1(S345A/S317A) však nebyla během poškození DNA narušena, což naznačuje, že fosforylace Chk1 na S345 a S317 může být vyžadována pro disociaci Chk1-s z Chk1. (F) buňky HEK293 byly kotransfikovány buď prázdným vektorem Chk1-Myc + nebo Chk1-Myc + dn-ATR, následované léčbou 100 nM kamptothecinem po dobu 2 hodin. Buněčný lyzát byl odebrán pro imunoprecipitaci anti-Myc protilátkami, následovanou imunoblotovou analýzou indikovaných proteinů. Výsledky ukazují, že narušení disociace Chk1-Chk1–S vyvolané kamptothecinem závisí na fosforylaci ATR a Chk1.
v odpovědi na poškození DNA (DDR) je Chk1 výrazně aktivován fosforylací na zbytcích S345 a S317(7, 13, 38, 39). Navzdory uznání významu fosforylace S345 / S317 zůstává nejasné, jak tato fosforylace aktivuje Chk1 (28-30). Ukázali jsme, že exprese Chk1-S se v DDR výrazně nezměnila (příloha SI, obr. 12). Interakce Chk1-Chk1-S však byla oslabena v DDR indukované kamptothecinem, inhibitorem DNA topoizomerázy I a činidlem poškozujícím DNA (obr. 3E). Zejména disociace Chk1 z Chk1 – S v DDR se zdála závislá na fosforylaci Chk1 při S345 / S317, protože mutant Chk1(S345A/S317A) se během léčby kamptothecinem nerozloučil od Chk1-S (obr. 3E). V DDR závisí aktivace Chk1 na fosforylaci zprostředkované ATR (7, 13, 14). Ukázali jsme, že inhibice ATR prostřednictvím dominantně negativního mutantu (dn-ATR)nejen potlačila fosforylaci CHK1-S indukovanou kamptothecinem, ale také zabránila disociaci Chk1–Chk1-S (obr. 3F). Podobně se CHK1 disocioval z Chk1-S během DDR indukované cisplatinou a disociaci bylo zabráněno dn-ATR (příloha SI, obr. 13). Výsledky společně naznačují, že fosforylace Chk1 může narušit jeho interakci s endogenním inhibitorem Chk1-S, což vede k aktivaci Chk1 v DDR.
identifikace Chk1-S jako jedinečného regulátoru progrese buněčného cyklu a buněčné proliferace nás vedla k prozkoumání jeho exprese v rakovinných tkáních. Na úrovni mRNA většina rakovinných tkání exprimovala vyšší hladiny Chk1 a Chk1-S než normální tkáně (příloha SI, obr. 14). Zajímavé je, že testikulární karcinomy vykazovaly výraznou up-regulaci Chk1-S, ale ne Chk1 (obr. 4A). Specifická up-regulace Chk1-S byla dále potvrzena imunoblotovou analýzou ve tkáních testikulárního karcinomu, zejména ve vzorcích rakoviny v pozdním stádiu (obr. 4B). Jak bylo uvedeno výše (5), normální i maligní testikulární tkáně měly vysoké hladiny exprese Chk1. Zvýšená exprese Chk1-S byla také zjištěna během progrese rakoviny vaječníků (obr. 4B). Relativně vysoká úroveň exprese Chk1 a Chk1-S u obou plodů (příloha SI, obr. 3) a rakovina (obr. 4) tkáně naznačují, že Chk1-S může urychlit progresi buněčného cyklu a za těchto podmínek podporovat proliferaci buněk.
regulace Chk1 – S u rakoviny. (A) analýza PCR v reálném čase exprese mRNA Chk1 a Chk1-S v normálních testikulárních tkáních a vzorcích testikulárního karcinomu, která ukazuje-regulace Chk1 – S u testikulárních karcinomů. B) Imunoblotová analýza Chk1 a Chk1 – S v lidských normálních tkáních rakoviny varlat a varlat, vykazující zvýšenou expresi Chk1-S v pozdních stádiích nádorových tkání. (C) nahé myši byly injikovány 10 × 106 Tet-na buňky MDA-MB-231, které byly doxycyklinem indukované k exprimaci Chk1, Chk1-KD nebo Chk1-S. Po vytvoření nádoru na ∼100 mm3 byly myši udržovány na pitné vodě s doxycyklinem nebo bez něj. Objem nádoru byl měřen týdně (zobrazeno pro hodnoty čtvrtého týdne, n = 8). Údaje ukazují průměr ± SD. Výsledky ukazují, že indukovaná exprese Chk1-S, ale ne Chk1 nebo Chk-KD, inhibovala růst nádoru. (D) denzitometrie imunoblotových výsledků exprese Chk1-Myc indukované doxycyklinem, CHK1-KD-Myc a CHK1-S-Myc v vyříznutých nádorech (n = 3 pro každou skupinu). Signály byly normalizovány pomocí Chk1-Myc (libovolně nastaveno jako 100). Údaje ukazují průměr ± SD. Výsledky ukazují, že doxycyklin indukoval podobné hladiny exprese Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc a Chk1-S-Myc v nádorech. (E) nahé myši byly injikovány buňkami indukovatelnými Chk1-S k vytvoření nádorů a poté udržovány na pitné vodě s doxycyklinem nebo bez něj po dobu 4 wk. Nádorové tkáně byly odebrány pro imunoblotovou analýzu. Výsledky ukazují vyšší expresi CDC25A v nádorových xenograftech s expresí CHK1-s indukovanou doxycyklinem.
dále jsme zkoumali vliv mimoděložní exprese Chk1 – S na růst nádoru xenograftu u myší. Nádorové xenografty byly stanoveny u nahých myší pomocí buněčných linií karcinomu prsu Tet-on MDA-MB-231, které mohou být indukovány doxycyklinem k expresi Chk1, Chk1-S nebo Chk1-KD. Indukce Chk1 nebo Chk1-KD doxycyklinem neovlivnila růst nádoru; indukce Chk1-S však vedla ke 40% snížení objemu nádoru (obr. 4C). Nádorové tkáně indukované Chk1-S také vykazovaly akumulaci cdc25A, což naznačuje inhibici Chk1 (obr. 4E). Ačkoli výsledky mohou znamenat jedinečnou protinádorovou strategii, fyziologický význam nucené nadměrné exprese ektopického Chk1-S zůstává nejasný. Tyto výsledky však poskytují důkaz principu, že naklonění rovnováhy Chk1-Chk1-S může vést k mitotické katastrofě a snížení buněčné proliferace.
pozorování, že nadměrná exprese Chk1-S snížila růst nádoru xenograftu (obr. 4 C–E) se zdálo být v rozporu s pozorováním, že vzorky nádorů od lidských pacientů exprimovaly relativně vysoké hladiny Chk1-S pro buněčnou proliferaci (obr. 4 a A B a Si Dodatek, obr. 14). Pro sladění těchto údajů je důležité rozpoznat rozdíly mezi experimentálními podmínkami. Relativně vysoká exprese Chk1-S u lidských nádorů může být přičítána přítomnosti proliferativních buněk v těchto tkáních. Důsledně je Chk1-S také vysoký ve fetálních tkáních, které jsou vysoce proliferativní (příloha SI, obr. 3A). Důležité je, že exprese Chk1-S v těchto proliferativních tkáních je časově omezena na pozdní fázi S až M (obr. 2 a příloha SI, obr. 4). Tato časová regulace může zajistit, že aktivita Chk1 je inhibována po (a teprve po) dokončení replikace DNA ve fázi S pro progresi buněčného cyklu do fáze G2/M. Když je však ektopický Chk1-S nucen nadměrně exprimovat v kultivovaných buňkách nebo nádorech xenograftu, časové omezení exprese Chk1-S je narušeno; jinými slovy, Chk1-S je vysoká v průběhu buněčného cyklu včetně fáze S, což má za následek konstantní blokádu Chk-1 a předčasný mitotický vstup, což vede k mitotické katastrofě a snížené proliferaci buněk.
závěrem tato studie identifikovala spojovou variantu Chk1, Chk1-S, která je klíčovým regulátorem Chk1 v normálním buněčném cyklu a během DDR (příloha SI, obr. 15). V cyklu nerušených buněk, exprese Chk1 se zvyšuje ve fázi S a některé molekuly Chk1 mohou být fosforylovány ATR zabraňující vazbě Chk1-S, což má za následek vysokou aktivitu Chk1 a udržování s-Fáze až do dokončení replikace DNA. Ve fázi G2 se exprese Chk1-S zvyšuje a, jak bylo uvedeno (29), fosforylace Chk1 klesá, což podporuje interakci Chk1–Chk1-S k potlačení aktivity Chk1. Snížení aktivity Chk1 ve fázi G2 / M je rozhodující pro vstup mitotiky. Za podmínek indukce nebo nadměrné exprese Chk1-S, nadměrné množství sekvestru Chk1 – S a snížení jeho kinázové aktivity během fáze S, což má za následek předčasný mitotický vstup bez dokončení replikace DNA, což vede k mitotické katastrofě. Během poškození DNA je Chk1 fosforylován, což má za následek sníženou vazbu Chk1-S, zvýšenou aktivitu Chk1 a zástavu G2/M (příloha SI, obr. 11). Naše zjištění podporují mechanismus „de-represe“ aktivace Chk1 (29). Důležité je, že Chk1-S se jeví jako jeden z klíčových potlačujících faktorů aktivity Chk1. Antagonizací Chk1 může Chk1-S urychlit buněčný cyklus, což vede ke zvýšené proliferaci ve fetálních a rakovinných tkáních. Vysoké hladiny Chk1 v proliferujících buňkách koordinují fázi S a mitózu, zatímco vysoké hladiny Chk1-S mohou poskytnout silný přepínač pro fázový přechod S-to-G2/M. Naproti tomu nucená nadměrná exprese Chk1 – S na nadměrných hladinách, nevyvážená Chk1, vyvolává předčasný mitotický vstup a buněčnou smrt (obr. 2) a potlačuje růst nádoru v modelech nádorových xenograftů (obr. 4). Chk1 bylo navrženo jako účinný terapeutický cíl v léčbě rakoviny a inhibitory Chk1 jsou hodnoceny v klinických studiích (40-43). Identifikace Chk1-S jako endogenního inhibitoru Chk1 může otevřít nové oblasti výzkumu v regulaci buněčného cyklu, odpovědi na poškození DNA a terapii rakoviny.