Comparative measurement of CNP and NT-proCNP in human blood samples: a methodological evaluation

Introduction

C-type natriuretic peptide (CNP), geïdentificeerd in 1990 door Sudoh et al., is het oudste lid van de natriuretic peptide familie . CNP stimuleert selectief de humane natriuretische peptide receptor 2 (NPR2), die het cGMP-afhankelijke kinase (cGK) activeert door de intracellulaire concentratie van cGMP te verhogen . Daarnaast bindt CNP NPR3 en deactiveert op zijn beurt eiwitkinase a door Gi-eiwitafhankelijke remming van adenylaatcyclase . CNP heeft anti-proliferatieve en anti-migratie eigenschappen en werd ook geïdentificeerd als een endotheel afgeleide ontspannende factor . Bovendien remt CNP neointimale restenose, vermindert vasculaire constrictieve remodellering en cardiale ischemie-reperfusie letsel . CNP speelt een belangrijke rol in botgroei, reproductie, zenuwgroei, re-endothelialisatie, evenals nier -, pancreas-en hartfunctie . Bovendien is onlangs erkend dat CNP betrokken is bij de ontwikkeling van atherosclerotische plaquevorming .

door de overvloed aan CNP-functies heeft dit peptide de afgelopen jaren een toenemende belangstelling voor cardiovasculair onderzoek verkregen. Onderzoeken naar CNP-concentraties in bloedmonsters zijn echter inconsistent. In sommige van deze studies werden concentraties van CNP of zijn amino-terminale pro-peptide (NT-proCNP) in serummonsters gemeten en in andere werden plasmamonsters gebruikt . Helaas zijn er nog geen details bekend over mogelijke vertragingen bij het nemen van bloedmonsters en de daaropvolgende monsterverwerking. In de tot dusver beschikbare literatuur zijn geen gegevens beschikbaar over het verschil tussen de CNP/nt-proCNP concentraties tussen serum-en plasmamonsters. Ook de invloed van de vertraging van de verwerking van bloedmonsters blijft onduidelijk. Bovendien varieerde de CNP-concentratie in serum-en plasmamonsters aanzienlijk (Tabel 1). Daarom was het doel van deze studie om de volgende methodologische vragen te beantwoorden: (1) veroorzaakt vertraagde verwerking van de bij kamertemperatuur opgeslagen bloedmonsters bias? (2) is er een verschil tussen serum-en plasmaconcentraties van CNP of NT-proCNP? (3) zijn deze verschillen tijdsafhankelijk?

we bestudeerden 12 mannelijke vrijwilligers (gemiddelde leeftijd 29 ± 2 jaar, normaal gewicht, geen medicamenteuze behandeling, geen voorgeschiedenis van cardiovasculaire of andere ziekten, 3 rokers). Van alle onderzochte proefpersonen werd informed consent verkregen. Bij alle vrijwilligers werden om 8 uur ‘ s ochtends drievoudige vasten bloedmonsters genomen. Bloedmonsters werden verzameld met behulp van het 7,5 ml s-Monovette® inzamelsysteem (Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland) dat ofwel stollingsactivator (kaolien) voor serummonsters, natriumcitraat voor plasmamonsters of kalium-EDTA voor volbloed monsters bevat. Alle monsters voor baseline-analyses werden onmiddellijk gecentrifugeerd bij 2.000 × g gedurende 10 min bij 4°C en het supernatans werd bewaard bij -70°C tot de analyse. Voor tussentijdse analyses (30 minuten of 2 uur) werden plasmamonsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 2.000 × g. Supernatant werd verwijderd en gedurende 30 min of 2 uur bij kamertemperatuur bewaard. Na bloedstolling werden serummonsters identiek aan plasmamonsters verwerkt. Supernatant werd bewaard en ook bewaard bij kamertemperatuur gedurende 30 min of 2 uur. Volledige bloedmonsters werden bij kamertemperatuur bewaard zonder centrifugeren. Na 30 min of 2 uur werden volledige bloedmonsters gecentrifugeerd bij 2000 × g gedurende 10 min bij 4°C. Supernatant werd verwijderd en bewaard bij -70°C tot analyse. De concentratie van CNP werd gemeten met behulp van de CNP-22 EIA-Kit (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Duitsland) volgens het Protocol van de fabrikant. De nt-proCNP-concentratie werd gemeten met de NT-proCNP EIA-Kit (Biomedica, Wenen, Oostenrijk) volgens het Protocol van de fabrikant. Eenrichtingsanova werd gebruikt voor vergelijking tussen groepen. Voor paarsgewijze vergelijkingen werd de t-test toegepast. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) of 95% betrouwbaarheidsinterval (95%-BI). Statistische significantie werd aangenomen bij p < 0,05. De gegevens zijn geanalyseerd met MedCalc® Voor Windows, versie 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, België).

resultaten

zoals getoond in Figuur 1a waren de uitgangsconcentraties van CNP in serum, plasma en volbloedmonsters respectievelijk 0,997 ± 0,379 ng/ml, 1,933 ± 0,699 ng/ml en 0,991 ± 0,489 ng/ml. Plasmaconcentraties van CNP waren significant hoger in vergelijking met serum-en volbloedmonsters op alle tijdstippen (ANOVA, p = 0,001 bij baseline, p < 0,001 bij 30′ min. en p = 0,003 bij 120 ‘ min.). Er werd op geen enkel moment een significant verschil waargenomen tussen serum-en volbloedmonsters (ANOVA, p > 0,05). Baseline concentraties van NT-proCNP in serum, plasma en volbloed monsters waren respectievelijk 58,5 ± 28,3 pg/ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml en 50,7 ± 21,4 pg/ml (figuur 1b). Er werd op geen enkel moment een significant verschil tussen de groepen gevonden (ANOVA, p > 0,05). In volledige bloedmonsters nam de lactaatconcentratie na 2 uur significant toe ten opzichte van de uitgangswaarde (3,2 ± 0,8 mM vs.2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). Bovendien daalde de pH-waarde van 7,34 ± 0.Bij aanvang tot 7,29 ± 0,03 na 2 uur (p < 0,001).

discussie

onze studie toonde aan dat CNP en nt-proCNP stabiel zijn in serum en in volbloed monsters gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur. Bijgevolg wordt de stabiliteit van CNP-peptide hoogstwaarschijnlijk niet beïnvloed door om het even welke vertraging in steekproefverwerking minstens twee uren. ProCNP is al gemeld (Protocol van de fabrikant, Onbekende opslagcondities van bloedmonsters) stabiel te zijn voor ten minste 2,5 uur. Onze experimenten bevestigden de stabiliteit van nt-proCNP zelfs bij kamertemperatuur. De concentratie van nt-proCNP in alle monstertypes bleef gedurende de tijd gedurende maximaal 2 uur constant, wat wijst op langdurige stabiliteit van dit eiwit. Zoals vermeld in Tabel 1, De gemiddelde concentratie van NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg / ml) gemeten in deze studie lag binnen het gerapporteerde bereik (zie Tabel 1) bij gezonde personen (3,7-432 pg/ml).

in tegenstelling tot NT-proCNP was de concentratie van CNP significant hoger in plasmamonsters vergeleken met serum-en volbloedmonsters (figuur 1). Tot nu toe hebben noch onze groep noch de Technische Dienst van de fabrikanten enig bewijs gevonden betreffende de invloed van het type monster op de ELISA-test die in dit onderzoek wordt gebruikt. Bij aanvang waren echter de supernatans van plasma en volledig bloedmonsters identiek, met uitzondering van het type gebruikte bloedstollingsremmer. Deze remmer was natriumcitraat in de plasmagroep en EDTA in de volledige bloedsteekproefgroep. Volbloedmonsters toonden vergelijkbare resultaten aan als serummonsters (p = 0,98). Daarom is het zeer waarschijnlijk dat natriumcitraat de gemeten concentratie van CNP in plasma significant kan beïnvloeden en bijgevolg de resultaten die met deze techniek worden bereikt, kan vervalsen.

onverwacht waren de UITGANGSCONCENTRATIES van CNP in zowel plasma-als serummonsters ongeveer duizend keer hoger dan in andere meldingen (Tabel 1) . In al deze studies werd de radio-immunoassay (Ria-Kit) gebruikt voor de bepaling van CNP-concentraties. In twee andere studies daarentegen waren de gemeten CNP concentraties in serum en plasma monsters vergelijkbaar met onze resultaten met betrekking tot de grootte van dimensie . Interessant is dat in de laatste studies, dezelfde ELISA-Kit werd gebruikt als in ons onderzoek. Zelfs na uitgebreide evaluatie van verschillende interne en externe factoren kon geen bevredigende verklaring voor deze discrepantie worden gevonden. Controlemetingen met exogeen CNP in menselijk serum toonden een niet-significante meetfout aan van + 7,8% (95%-KI: –). De CNP-peptide die voor de referentiekromme wordt gebruikt werd samengesteld door de fabrikant zelf (Phoenix). Daarentegen werd het CNP-peptide dat als “exogene” controle werd gebruikt door Bachem geleverd. Zoals verzekerd door beide fabrikanten, waren de opeenvolgingen van aminozuren identiek en werden de disulfidebanden gevormd in beide peptides.

de resultaten van interne controlemetingen kunnen echter als volgt worden samengevat:: Ten eerste bleek uit de in ons onderzoek uitgevoerde controlemetingen dat de ELISA-kits correct werden gebruikt, in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Ten tweede is bij metingen met controlemonsters de geschiktheid van de toegepaste standaardkromme bevestigd. Ten derde, controleserummonsters met exogene CNP toonden een aanvaardbare nauwkeurigheid aan en de resultaten lagen binnen de verwachte orde van grootte. Ten vierde is een hogere concentratie CNP in plasmamonsters hoogstwaarschijnlijk een artefact veroorzaakt door natriumcitraat.

zoals gemeld door Clerico en collega ‘ s, zijn ook vergelijkbare grote verschillen in resultaten tussen verschillende RIA-en Meia-methoden bekend, zoals ANP en BNP . Clerico en collega ‘ s concludeerden dat de grote verschillen in deze resultaten het meest waarschijnlijk te wijten zijn aan de specificiteit van monoklonale of polyclonale antilichamen gebruikt, het ontwerp van immunoassay systeem (competitieve VS .niet-competitieve assay), de analytische matrix (serum vs. EDTA vs. heparinized plasma) gebruikt, en de overvloed aan circulerende vormen van natriuretische peptiden, zoals eerder gemeld voor ANP en BNP immunoassays. Deze methodologische bronnen van bias kunnen ook denkbaar zijn voor CNP en NT-proCNP assays en verklaren dus het grote verschil in resultaten in de geciteerde studies (Tabel 1).

beperkingen van de studie

wij erkennen dat een steekproefgrootte van 12 te klein is om te concluderen dat er helemaal geen verschil is. Uit statistisch oogpunt zou het echter belangrijk zijn te specificeren hoe groot het verschil moet zijn om medisch relevant te zijn. Voor zover wij weten, is dat laatste nog niet duidelijk gedefinieerd. Daarom werden de middelen en 95%-betrouwbaarheidsintervallen van alle metingen in de figuur gegeven om elke lezer in staat te stellen ook zijn eigen interpretatie uit de gegevens te trekken.

ten aanzien van serum-en plasmaconcentraties moet worden vermeld dat de in Tabel 1 vermelde waarden met verschillende methoden (RIA, ELISA) werden gemeten bij patiënten die aan verschillende ziekten leden. Het zou zeer nuttig zijn geweest om CNP-RIA te vergelijken met CNP-ELISA-analyses die direct dezelfde specimens gebruiken, omdat een duizendvoudig verschil in de Orde van grootte merkbaar blijft. Helaas waren Ria assays metingen niet beschikbaar in ons laboratorium. Voor de nt-proCNP-concentratie werd deze laatste vergelijking door Olney en collega ‘ s onderzocht, waaruit bleek dat de commerciële ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wenen, Oostenrijk) waarden opleverde die gemiddeld 21% (spreiding 11-52%) van de RIA-waarden bedroegen. Kruisvalidatie van de referentiestandaard van de ELISA kit met behulp van RIA assay toonde een verschil van 15% aan .

samenvatting

metingen van CNP en NT-proCNP werden hoogstwaarschijnlijk niet beïnvloed door vertraging van de monsterprocessie of het type bloedmonster (behalve voor CNP in plasmamonsters). Voor plasmamonsters waren alleen EDTA-antistollingsbloedmonsters geschikt voor de CNP-ELISA-test die in dit onderzoek werd gebruikt. Bijgevolg kan de concentratie van CNP en NT-proCNP in klinische toepassingen worden gebruikt om CNP-effecten te bepalen. Er moet ook van worden uitgegaan dat de concentratie van nt-proCNP, die slechts een bijproduct van het actieve peptide is, de ware aard van CNP kan verbergen. De discrepantie in gemeten CNP-concentraties, bepaald door RIA-assays of door ELISA-assays, blijft echter nog steeds onverklaard, maar lijkt het meest waarschijnlijk te wijten te zijn aan methodologische problemen. Daarom moeten immunoassays voor CNP , zoals aanbevolen voor ANP en BNP, in de toekomst ook gestandaardiseerd of geharmoniseerd worden.