ClpP protease activation results from the reorganisation of the electrostatic interaction networks at the entree pores

Binding mode of ACP1 to EcClpP

to elucidate the structural basis for ClpP activation by ACP128, structures of NmClpP and EcClpP (Fig. 1a) in complex met ACP1 analogen werden gezocht. Hoewel een structuur van nmclpp met gebonden ACP1 ondanks herhaalde pogingen niet werd bereikt, werd een structuur van het ecclpp+ACP1-06 complex vastgesteld op 1,9 Å resolutie (Fig. 1b, C, Tabel 1), met een tetradecamer in de asymmetrische eenheid (ketens A-N). Elektronendichtheid voor n-eindresidu ‘ s die de axiale lussen van EcClpP vormen is onduidelijk in op één na alle subeenheden (keten B). In eerder gepubliceerde structuren zijn deze axiale lussen zeer flexibel en zijn ze meestal ongeordend in het kristal bij afwezigheid van activatoren of door precusion door crystal packing23. De ondubbelzinnige elektronendichtheid werd waargenomen voor één enkel acp1-06 molecuul in een zak die door subeenheden D en E wordt gevormd, die twee verschillende configuraties van de samenstelling tonen (Fig. 2a, b). Beide configuraties werden gemodelleerd in de elektronendichtheid, waarbij de eerste configuratie plaatst het trifluormethylpyridine gedeelte van de verbinding binnen een hydrofobe pocket (down configuratie), terwijl de tweede positioneert het uit de hydrofobe pocket blootgesteld aan oplosmiddel (up configuratie) (Fig. 2 bis). De overige 13 hydrofobe zakken tonen dubbelzinnige elektronendichtheid voor ACP1-06. Wij modelleerden en verfijnden alle 14 acp1-06 molecules in zowel omhoog als onderaan configuraties bij bezetting van 0.5, resulterend in betere elektronendichtheid voor elk ligand.

de bindingsmodi van ACP1-06 (Fig. 2b-d) benadert die van ADEPs waargenomen in kristalstructuren van verschillende bacteriële Clpp ‘ s (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Merk op dat verbindingen die door onze groep worden gesynthetiseerd als ACP1-YY en ADEP-YY worden genummerd, terwijl verbindingen uit studies door andere groepen worden genoemd zoals in de respectieve gepubliceerde artikelen. Alle eiwitcontacten met ACP1-06 zijn niet-polair van aard, behalve twee opmerkelijke elektrostatische bindingen die voorkomen tussen (1) De fenolhydroxyl zijketen van Y76 en de amidezuurstof van ACP1-06, en (2) de guanidinyl zijketen van R206 (het voorlaatste Arg in EcClpP) en een sulfonylzuurstof van ACP1-06 (Fig. 2b). De laatste twee interacties zijn aanwezig in beide configuraties van ACP1-06. Daarnaast wordt R206 (keten E) gestabiliseerd door ionische binding met E65 van een aangrenzende subeenheid (keten D) (Fig. 3a, b).

in de donsconfiguratie neemt het trifluormethylpyridinedeel van ACP1-06 een hydrofobe holte in die wordt gevormd door L62, T93 en F96 (keten D), en Y74, Y76, I104, L203 en L128 (keten E) (Fig. 2b en 3b). Dit is dezelfde holte bezet door de ring van de exocyclische Phe residu van de verschillende ADEP analogen gecokristalliseerd met ClpP, zoals in onze NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) of de EcClpP + ADEP1 structuren40 (Fig. 2c, d). In de up–configuratie daarentegen wordt het trifluormethylpyridine-deel rond de C-S-binding gedraaid en wordt het oplosmiddel blootgesteld terwijl van der Waals contact maakt met Y74, I104, F126 en L203 (keten E) (Fig. 2b en 3b). Het gem-dimethyldeel stapelt zich tegen de platte ring van Y74 (keten E), terwijl de verlengde alifatische keten eindigend met een ortho-chloor-gesubstitueerde fenylring, in een niet-polaire groef zit tussen twee helices van aangrenzende subeenheden (Fig. 3b). Deze binding spleet wordt gevormd door L62 (ketting D), F63 (ketting D), A66 (ketting D), L37 (ketting E), V42 (ketting E), en het niet-polaire gedeelte van E40 (ketting E) (vijgen. 2b en 3b).

in zowel ACP1-06-als ADEP1-gebonden structuren van EcClpP wordt de intrasubunit zoutbrug tussen R36 en E40 gevonden, waar de nabijgelegen alifatische staart van ADEP1 of de chloor-gesubstitueerde fenylring van ACP1-06 een hydrofobe interactie vormt met de zijketen van E40 (Fig. 3b, c). De twee activatoren worden verder gestabiliseerd in de hydrophobic plaats door twee verschillende waterstofverbindingspatronen. Terwijl ACP1-06 wordt beveiligd door een aan oplosmiddelen blootgestelde Ionische interactie tussen zijn sulfonylgroep en het C-eindresidu R206 (Fig. 3b), wordt ADEP1 op zijn plaats gehouden door twee waterstofbindingen met de hydroxylgroep van Y76 afgezonderd binnen de hydrofobe site (Fig. 3c). Een oplosmiddelgemedieerde waterstofbinding tussen E65 en de carbonylgroep van de n-acyl Phe zijketen van ADEP1 versterkt verder de interactie met EcClpP (Fig. 3c). Deze extra waterstofbinding, evenals de grotere omvang van de cyclische depsipeptide ring, die meer oppervlakte heeft om Van der Waals interacties te vormen in vergelijking met de kleinere trifluormethylpyridine groep van ACP1, kan verantwoordelijk zijn voor de over het algemeen strakkere binding die voor Adep ‘ s wordt waargenomen dan ACP1s28.

in de EcClpP + ACP1-06 structuur vonden we een onverklaarde elektronendichtheid in alle 14 subeenheden die zich uitstrekken van het nucleofiele residu S111 van de katalytische triade, wat wijst op een covalente modificatie (aanvullende Fig. 1 bis, b). De dichtheid strekt zich uit in ongeveer rechte hoeken in tegengestelde richtingen uit de buurt van de S111 zijkettingen. Ondanks uitgebreide inspanningen, kon het niet overtuigend met peptides, acylketoneproducten of diverse bekende de inhibitormolecules van het serineprotease worden uitgerust.

Bindwijze van ADEP aan NmClpP

NmClpP heeft een kortere pro-sequentie op het n-eindpunt, terwijl het vier extra residuen heeft op het c-Eindpunt in vergelijking met EcClpP (Fig. 1 bis). Hoewel NmClpP werd uitgedrukt als een full-length eiwit met een N-terminal His6-tag, merkten we herhaaldelijk gebrek aan binding aan de ni-nitrilotriazijnzuur hars. N-het eind rangschikken van de gezuiverde proteã ne onthulde dat de rijpe NmClpP bij residu Y6 begint (Fig. 1a), wat wijst op autoproteolyse om zijn n-terminale pro-sequentie (1MSFDN5) vrij te geven.

eerder hadden we de structuur van NmClpP bepaald met ADEP-0419. In deze studie bepaalden we de structuur van apo-NmClpP tot 2,0 Å en NmClpP met gebonden ADEP-14 tot 2,7 Å (Fig. 1b, c, aanvullende Fig. 1c, Tabel 1). De structuur van apo-NmClpP bevat een tetradekamer in de asymmetrische eenheid en vertoont geen duidelijke dichtheid voor een van de 14 N-terminale axiale lussen. Zwakke elektronendichtheid wordt waargenomen voor de lussen gevormd door residuen G133-G137 in streng β8 van het handvatgebied (Fig. 1 bis). De asymmetrische eenheid voor het nmclpp + ADEP-14 kristal bevat twee tetradecamers (aanvullende Fig. 1d). Er werd geen elektronendichtheid waargenomen voor residuen 1-22 van alle 28 subeenheden als gevolg van kristalverpakking (Fig. 1c, aanvullende Fig. 1d). Bovendien is de β8-streng (residuen 130-137; Fig. 1a) is slechts gedeeltelijk zichtbaar in alle subeenheden. ADEP-14 is gebonden aan NmClpP in een soortgelijke configuratie als ADEP-04 (Fig. 2e, f en 3e, f). In het kort neemt het difluorfenyl-deel van ADEP-14 een hydrofobe zak in die gevormd wordt door Y67, L95, L97 en L119 van één subeenheid, en V49, L53, T84 en F87 van een aangrenzende subeenheid (Fig. 3e). De zesvoudige ring van het pijpecolzuurdeel wordt blootgesteld aan oplosmiddelen en wordt gestabiliseerd door de fenylring van F117 en de hydrofobe zijketens van L97, L119 en L196 (Fig. 3e). De aanvullende methylsubstitutie op het allo-threonine residu van de depsipeptidering (Fig. 1b) wordt blootgesteld aan oplosmiddelen. Net als ADEP-04 wordt ADEP-14 in de zeer complementaire hydrofobe zak beveiligd door twee waterstofbindingsinteracties tussen de fenolische hydroxylgroep van Y67, de aminogroep van het difluorfenylalanine residu, en de alanine carbonylgroep in de depsipeptidring, en een oplosmiddelgemedieerde waterstofbinding met E56 (Fig. 3e, f). De octadieenzuur zijketen van ADEP-14 bevindt zich in het smalle hydrofobe kanaal gevormd door L53, F54 en S57 van één subeenheid, en R27, L28, E31, I33, F35 en Y67 van de naburige subeenheid (Fig. 3e).

ACP1-en ADEP-binding resulteren in duidelijke allosterische effecten op het clpp vat

gebruikmakend van structuren van apo-en samengestelde vormen van EcClpP en NmClpP (Fig. 1c), hebben wij de allosteric gevolgen onderzocht die op activatorband voorkomen. Zoals aangegeven in aanvullende Fig. 2, activator binding fungeert als een wig waardoor de zijdelingse verplaatsing van twee aangrenzende subeenheden. De mate van wereldwijde conformationele verandering veroorzaakt door ACP1-06 binding (rmsd = 0,84 Å ten opzichte van apo-EcClpP) is vergelijkbaar met die voor ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å ten opzichte van apo-NmClpP), maar minder dan die voor ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å ten opzichte van apo-NmClpP). Interessant is dat de richting van de verplaatsing verschilt tussen de twee klassen van activatoren (aanvullende Fig. 2 en aanvullende Films 1-4). Tussen de twee ADEPs veroorzaakt ADEP-14 een grotere algemene structurele verstoring van de nmclpp-cilinder (vergelijk aanvullende films 3 Vs.4). ADEP-binding resulteert in een uitbreiding van het apicale oppervlak van NmClpP vergezeld van vernauwing op de equatoriale regio. Het draaipunt voor deze beweging ligt in het handvatgebied dat bestaat uit helix aE en streng β8. Dit verschijnsel wordt waargenomen in alle tot op heden bekende ADEP-gebonden ClpP-structuren,met verschillende verdichtingsgraden van de clpp-cilinder 15, 18, 19,23, 40. In tegenstelling, acp1-06 binding aan EcClpP veroorzaakt een binnenwaartse beweging van alle subeenheden resulterend in het aandraaien van de clpp-cilinder (aanvullende Film 1). Aldus, tonen de structuren aan dat ACP1s en ADEPs ClpP activeren door duidelijke allosteric gevolgen te veroorzaken.

in de aan activator gebonden EcClpP-en NmClpP–structuren blijven de ring-ring-interface elektrostatische bindingen die het tetradecamer stabiliseren behouden ondanks de conformationele veranderingen (aanvullende Fig. 3). Bovendien behouden de ser-His-Asp katalytische triaden van EcClpP en NmClpP, niettegenstaande de Globale structurele verandering op activatorbinding, katalytisch competente geometrieën aangezien slechts kleine CA backbone verschuivingen plaatsvinden in de buurt van de actieve plaats (aanvullende Fig. 1a-c). Analyse van alle bestaande ACP1-en ADEP-gebonden structuren van ClpP toont aan dat samengestelde binding ook resulteert in de samentrekking van de equatoriale regio (aanvullende Fig. 4).

we hebben de verdichting van de ClpP-cilinder op ACP1 of ADEP-binding gekwantificeerd door de volumes van de respectieve katalytische kamers te meten (aanvullende Fig. 4). Acp1-06 binding veroorzaakt een ~ 5% afname van het katalytische kamervolume ten opzichte van apo-EcClpP. ADEP1-binding aan EcClpP resulteert in een vergelijkbare afname van het katalytische kamervolume. Dit wordt ook waargenomen voor andere activator-gebonden ClpP structuren zoals ADEP-14-gebonden NmClpP, ADEP-gebonden BsClpP, en de ADEP-gebonden MtClpP1P2 heterooligomeric complex (aanvullende Fig. 4).

ClpP activering resulteert in de reorganisatie van het elektrostatische bindingsnetwerk aan de axiale poriën

in de structuur van apo-NmClpP stabiliseren twee elektrostatische bindingen nabij de axiale poriën de interface van twee aangrenzende subeenheden (Fig. 3d, aanvullende Fig. 5). Ten eerste vormt de negatief geladen E58 carboxylaatgroep van één subeenheid een ionenpaar met de positief geladen R27 guanidiniumgroep van de aangrenzende subeenheid. Ten tweede vormen de hydroxyl – en E31-carboxylaatgroepen van twee aangrenzende subeenheden een waterstofbinding. Bij ADEP-binding breken deze twee niet-kovalente bindingen, terwijl de ionische binding tussen R27 en E31 van dezelfde subeenheid wordt verkort, d.w.z. versterkt (Fig. 3e, f). In apo-EcClpP verbindt slechts één ionbinding tussen E67 en R36 twee aangrenzende subeenheden, aangezien het equivalent residu aan S57 van NmClpP een alanine in EcClpP is en dus geen waterstofbinding met E40 kan vormen (Fig. 3a). Net als in NmClpP, elimineert de binding van ACP1 of ADEP1 aan EcClpP de intersubunit E67-R36 ionische binding en geeft dit aanleiding tot een sterkere intrasubunit ionische binding tussen R36 en E40 (Fig. 3b, c, aanvullende Fig. 5).

om deze waarnemingen verder te verifiëren, ontwierpen we NmClpP-en EcClpP-puntmutanten die leiden tot verlies van de bovengenoemde intersubunit elektrostatische bindingen. Zoals in Fig. 4a, terwijl WT NmClpP niet in staat was om de eiwitcaseïne te degraderen, werd de nmclpp e58a mutant gevonden om caseïne aan een hoger tarief dan de e31a mutant te degraderen. Belangrijk is dat de dubbele mutant E31A + E58A een nog hogere activiteit had dan de enkele mutanten. De mate van activering van de dubbele mutant NmClpP is vergelijkbaar met die waargenomen in de aanwezigheid van 1 µM ADEPs of 10 µM ACP1s (Fig. 4a). Vergelijkbaar gedrag werd waargenomen voor EcClpP met vergelijkbare mutaties (E40a en E67A; Fig. 4b). De respectieve EcClpP – dubbele mutant is niet oplosbaar en kon niet worden getest.

vervolgens bepaalden we Röntgenstructuren van nmclpp e58a en nmclpp e31a + e58a mutanten (Tabel 1). De katalytische plaatsen in beide mutanten zijn niet verstoord (aanvullende Fig. 1e). In de nmclpp e58a single mutant, de mutatie elimineert de intersubunit E58-R27 ionische binding en geeft aanleiding tot een sterkere intrasubunit R27-E31 interactie, terwijl de waterstofbinding tussen S57 en E31 blijft (Fig. 4c). Een soortgelijk “wig-effect” wordt dus waargenomen in de structuur, zoals blijkt uit de subtiele globale conformationele verandering in de CA backbone van de nmclpp mutant (rmsd = 0,33 Å ten opzichte van WT NmClpP) (aanvullende film 5). Mutatie van zowel E31 als E58 naar alanine om de dubbele mutant NMCLPP E31A + E58A te genereren (rmsd = 0,29 Å ten opzichte van WT NmClpP) elimineert de twee stabiliserende intersubunit elektrostatische interacties, evenals de intrasubunit R27–E31 ionische binding aanwezig in de nmclpp e58a enkele mutant (Fig. 4d en aanvullende Film 6) en in ADEP-gebonden NmClpP (Fig. 3e, f). Aldus, is de dubbele mutant nmclpp E31A + E58A in tegenstelling tot ADEP-gebonden NmClpP met de geëlimineerde intrasubunit Ionische band maar niettemin een geactiveerde proteã ne met intrinsieke proteolytische activiteit vergelijkbaar met die van klein-molecuul-geactiveerde ClpP (Fig. 4a). Net als ADEP-gebonden NmClpP, zowel nmclpp enkele en dubbele mutanten hebben verminderde katalytische kamer volumes als gevolg van clpp vat verdichting (aanvullende Fig. 4).

een dergelijke reorganisatie van het bindingsnetwerk wordt waargenomen voor alle geactiveerde ClpP-structuren die beschikbaar zijn in de PDB, hetzij in aanwezigheid van activatoren van kleine moleculen, hetzij door specifieke mutaties (aanvullende Fig. 6). Bijvoorbeeld, small-molecule activator binding aan B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP), en Homo sapiens ClpP (HsClpP) schaft een of twee intersubunit elektrostatische bindingen in de buurt van de axiale porie, en leidt tot een sterkere, intrasubunit Ionische interactie (aanvullende Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. In MtClpP2 bestaat de intersubunit ionische binding equivalent aan de E58–R27 interactie in NmClpP niet18. Het equivalente residu voor E58 van NmClpP is L66 in MtClpP2 en kan niet deelnemen aan een ionische interactie met K35 van MtClpP2 (equivalent aan R27 van NmClpP). In plaats daarvan stabiliseert een intersubunit waterstofbinding tussen S65 en E39 de interface (aanvullende Fig. 6g, h). ADEP binding aan MtClpP2 breekt de S65-E39 waterstofbinding en versterkt de intrasubunit ionbinding tussen K35 en E3918.

interessant is dat zelfs de geactiveerde SaClpP y63a variant41, met de activerende mutatie gevonden in het centrum van de hydrofobe site, en daarom niet equivalent aan de activerende mutaties van NmClpP hier gepresenteerd, ondersteunt ons voorgestelde model van de reorganisatie van het waterstofbindingsnetwerk rond de axiale porie bij ClpP activering (aanvullende Fig. 6f). In de structuur van de SaClpP Y63A mutant wordt de afstand tussen het intersubunit ionenpaar (Q54–R23) verhoogd, terwijl de intrasubunit zoutbrug (R23–D27) wordt versterkt (aanvullende Fig. 6d, f). We genereerden ook de equivalente y63a mutatie in zowel EcClpP als NmClpP. De nmclpp Y67A mutant was onoplosbaar, terwijl de EcClpP Y76A een activiteit had die iets hoger was dan de e40a mutant, maar lager dan die van de E67A mutant (Fig. 4b).

ClpP-activering resulteert in vermindering van structurele heterogeniteit van de N-terminale axiale lussen

zoals hierboven besproken, in de geordende axiale lus van het nmclpp+ADEP–04 complex dat de β1-β2 haarspeldbocht vormt, geeft ADEP-binding R27 vrij uit een intersubunit ionische binding met E58 en versterkt de intrasubunit ionische binding met E31 van helix aA (Fig. 5a). Bijgevolg vormt R27 een ionische binding met D23 van streng β1 van de axiale lus. Deze stabiliserende interactie wordt waargenomen in alle activator-gebonden structuren van ClpP waar de axiale lussen worden geordend (Fig. 5a-e).

voor de ecclpp + ACP1-06 structuur worden de axiale lussen (residuen 14-31) gedeeltelijk geordend in het kristal met slechts 1 van de 14 axiale lussen die de β1–β2 haarspeldbocht vormen (Fig. 1c-volledige bestelling lijkt gedeeltelijk te worden voorkomen door kristal verpakking effecten). In de geordende axiale lus van subeenheid A, staat de vrijgave van R36 van de Ionische band van de intersubunit met E67 het toe om een sterkere Ionische band van de intrasubunit met E40 van helix aA te vormen (Fig. 5f). Er is echter geen stabiliserende Ionische interactie tussen E22 van Bundel β1 en R36 van helix aA, waarschijnlijk als gevolg van partiële ordening (Fig. 5f). Een extra waterstofbinding tussen D32 van Bundel β2 en S21 van helix aA verankert de axiale lus aan het ecclpp-kerndomein (Fig. 5f). Ook de axiale lussen in de Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 structuur zijn slechts gedeeltelijk geordend21. De behouden waterstofbinding tussen het Arg-residu van helix aA en een negatief geladen residu van streng β1 wordt niet gezien in de gedeeltelijk geordende EfClpP-axiale lussen, hoewel EfClpP potentiële waterstofbinding heeft die residuen vormt op streng β1 (T6), en op de lus die de strengen β1 en β2 verbindt (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

naast behouden elektrostatische interacties stabiliseren uitgebreide hydrofobe contacten met het ClpP-hoofddomein de axiale lussen. In EcClpP + ACP1-06 nemen niet-polaire n-eindresiduen van streng β1 en de voorgaande gestructureerde spoel deel aan hydrofobe interacties met niet-polaire residuen van helix aA van dezelfde subeenheid, en op de hydrofobe zijden van helices aA’ en aB ‘ van een naburige subeenheid (aanvullende Fig. 7a). De niet-polaire residuen op de helices aA, aB ‘en β3’ vormen een continue hydrofobe patch op de omtrek van de axiale porie (aanvullende Fig. 7b) 15.

om een duidelijker beeld te krijgen van de conformationele heterogeniteit van de clpp-axiale lussen werden vervolgens methyltrosy NMR-experimenten uitgevoerd. Aanvankelijk werd een enkele cysteã ne mutatie geà ntroduceerd in de axiale lussen van NmClpP(T10C). Er werd een uniform gedegenereerd eiwit geproduceerd en vervolgens gereageerd met 13C-methyl-methaanthiosulfonaat (MMTS). Dit resulteert in de bevestiging van een enkele NMR zichtbare 13CH3–s groep aan de cysteã ne zijketen, wat leidt tot de vorming van een S-methylthio-cysteã ne (MTC) residue42. Deze methode biedt een gemakkelijke manier om de structuur en dynamiek van grote complexen in oplossing te monitoren. Het controleren van de NMR correlaties van de bijgevoegde spinsonde in vrije, activator-gebonden of gemuteerde vormen van het enzym verstrekt een uitlezing van de oplossingsconstructie van de axiale poriën.

aanvankelijk werden controle-experimenten uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de invoering van het t10mtc-deel de structuur van het NmClpP niet verstoort. Kort, 1h-13C heteronuclear multiple quantum coherence (hmqc) correlaties van WT en T10MTC NmClpP geëtiketteerd 13CH3 aan de zijketen van ILVM residuen in een anders volledig deuterated achtergrond werden vergeleken en bleken vrijwel identiek te zijn. Vervolgens werden 1H-13C hmqc correlaties van NmClpP T10MTC verkregen in verschillende staten (Fig. 6 bis). De apo-vorm (blauwe contouren) heeft een groot aantal correlaties, wat wijst op structureel heterogene axiale lussen. Toevoeging van tweevoudige Molaire overmaat van ADEP-28 (activiteit gegeven in Fig. 4a) over monomere ClpP verminderde beduidend het aantal correlaties (rode contouren), indicatief van starificatie of structurele orde. Daarentegen ACP1-17 binding (tweevoudige Molaire overmaat over monomeer ClpP; activiteit gegeven in Fig. 4a) resulteert in niet-detecteerbare veranderingen in de waargenomen correlaties (groene contouren), wat impliceert dat de axiale lussen onaangetast zijn.

deze benadering werd ook gebruikt om het effect van activerende mutaties te controleren (Fig. 4a, b) op de axiale lussen. In deze experimenten werden de activerende mutaties geà ntroduceerd op de achtergrond van de t10c (labeling) mutatie. Zoals in Fig. 6a, correlaties van de nmclpp t10mtc/E31A mutant (rode contouren) is iets minder heterogeen dan de pseudo WT vorm, terwijl die van de nmclpp t10mtc/E58A mutant (oranje contouren) zijn vrijwel onveranderd. De gelijktijdige aanwezigheid van beide activerende mutaties (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) heeft een veel dramatischer effect dan enkelvoudige mutaties en verwijdert een groot aantal correlaties die overeenkomen met de axiale lussen (zwarte contouren). Dit komt overeen met de waarneming dat de dubbele mutant actiever is dan de enkele mutanten (Fig. 4a).

ClpP-activering resulteert in vermindering van conformationele heterogeniteit van het handvatgebied

dezelfde NMR-gebaseerde benadering werd gebruikt om het effect van activatorbinding en mutaties op het handvatgebied te onderzoeken. Een i144mtc (helix aE) mutant van NmClpP werd voorbereid en bestudeerd door NMR in apo-, ADEP-28-, en ACP1-17-gebonden vormen. De apo-vorm (blauwe contouren, Fig. 6a) vertoont een paar pieken, wat aangeeft dat het handvatgebied geassocieerd is met een paar naast elkaar bestaande conformaties, zoals te zien is in ons vorige werk over EcClpP4. Interessant is dat toevoeging van ACP1 en ADEP leidt tot het verdwijnen van een van de pieken. Aangezien de plaats van de activatorband distal aan de NMR-spinsonde is, schijnt het dat acp1 of ADEP die allosterically voor één van de conformations in het handvatgebied selecteert. Als alternatief kunnen activators beide vormen binden, maar een verandering in een enkele toestand veroorzaken.

magnetisatie-uitwisselingsexperimenten met mengvertragingsperioden van 100, 200, 300, 400, 500, en 600 ms bij 40 °C waren niet in staat om enige interconversie tussen de conformers waargenomen voor het handvat gebied voor WT NmClpP detecteren. Dit wijst erop dat het uitwisselingsproces te traag is voor karakterisering door NMR.

SAXS demonstreert activator-geïnduceerde clpp conformationele veranderingen in oplossing

om de oligomere toestand en structurele veranderingen na binding van de verbinding verder te onderzoeken, werden APO-NmClpP en NmClpP+ADEP-04 monsters gekarakteriseerd door SAXS (Fig. 6b-g en aanvullende Fig. 8). De uiteindelijke samengevoegde curves worden weergegeven in Fig. 6b, en de SAXS profielen verkregen leek op die van holle structuren43. Er werden geen significante veranderingen gevonden in termen van totale vouwen (aanvullende Fig. 8), straal van gyration (Rg) en oligomeric staat toen ADEP-04 werd toegevoegd aan NmClpP (aanvullende Fig. 8c). Om de NMCLPP SAXS profielen verder te analyseren en oplossingen ab initio structuren te genereren, werd het GNOM programma gebruikt om pair distance distribution functies, p(r) te construeren. Apo-NmClpP p (r) onthulde een subtiele right-shift en grotere maximale dimensie (Dmax) in vergelijking met ADEP-04-gebonden NmClpP (Fig. 6c en aanvullende Fig. 8c). Vervolgens werden dummy atom models (Dammen) gegenereerd met behulp van SAXS-gegevens om de nmclpp-oplossingsstructuren visueel te analyseren (Fig. 6d-g). Tien modellen werden gegenereerd voor apo-NmClpP en ADEP-04-gebonden NmClpP, en de meest waarschijnlijke werden gekozen. Deze modellen toonden aan dat, over het algemeen, de twee nmclpp oplossing structuren zijn vergelijkbaar (holle cilinders). Echter, wanneer bovenop de overeenkomstige kristalstructuren, verschillen die overeenkomen met de hoge-resolutie structuren werden gemakkelijk waargenomen (Fig. 6d, e). Een meting van de axiale hoogte van alle tien Dammen Voor apo – en ADEP-04-gebonden NmClpP resulteerde in waarden van 93,0 ± 5,4 Å voor de apo-vorm en 103,5 ± 6,1 Å voor de ADEP-04-gebonden vorm. Om deze waarneming verder te bevestigen, worden de gemiddelden van de Waarschijnlijkheidskaarten voor Dammen en kaarten met de hoogste DAs-bezetting (Fig. 6f, g) werden geanalyseerd. De axiale hoogten vertoonden een toename van ongeveer 10 Å voor ADEP-04-gebonden NmClpP in vergelijking met apo-NmClpP. Bovendien vertoonde ADEP-04-gebonden NmClpP een grotere axiale porieomtrek dan apo-NmClpP (Fig. 6f, g). Aldus, ondanks de lage resolutie van de SAXS techniek, suggereren de resultaten dat ADEP-04 die aan NmClpP binden niet de oligomere staat van NmClpP beïnvloedt maar een uitbreiding van de axiale poriën en verhoogde bezetting aan de boven-en onderkant van de NMCLPP+ADEP-04 DAM veroorzaakt (Fig. 6e, g) vergeleken met apo-NmClpP. Dit weerspiegelt waarschijnlijk de conformational veranderingen die tot de verminderde heterogeniteit van de structuur van de n-eind axiale lijnen van nmclpp leiden die door Röntgenstraal en NMR worden waargenomen.