Clemizol en modulatoren van serotonine-signalering onderdrukken aanvallen bij Dravet-syndroom

Abstract

het Dravet-syndroom is een catastrofale epilepsie bij kinderen met vroege aanvallen, vertraagde taal-en motorische ontwikkeling, slaapstoornissen, angstachtig gedrag, ernstig cognitief tekort en een verhoogd risico op overlijden. Het wordt voornamelijk veroorzaakt door de novo mutaties van het scn1a gen dat codeert voor een neuronaal voltage-geactiveerd natriumkanaal. Zebravissen met een mutatie in de scn1a-homoloog recapituleren spontane aanvalsactiviteit en bootsen de convulsieve gedragsbewegingen na die zijn waargenomen bij het Dravet-syndroom. Hier laten we zien dat fenotypische screening van drugbibliotheken in zebravis scn1 mutanten snel en succesvol nieuwe therapieën identificeert. We tonen aan dat clemizol bindt aan serotoninereceptoren en zijn anti-epileptische activiteit kan worden nagebootst door geneesmiddelen die op serotonine signaalwegen werken, zoals trazodon en lorcaserine. Gelijktijdig met deze bevindingen van zebravis behandelden we vijf Medisch hardnekkige patiënten met het Dravet-syndroom met een klinisch goedgekeurde serotoninereceptoragonist (lorcaserin, Belviq®) en zagen we enkele veelbelovende resultaten in termen van vermindering van de frequentie en/of ernst van aanvallen. Onze bevindingen tonen een snelle weg aan van preklinische ontdekking bij zebravis, via doelidentificatie, tot potentiële klinische behandelingen voor het syndroom van Dravet.

Inleiding

epilepsieën bij kinderen die als catastrofaal worden geclassificeerd, worden vaak geassocieerd met een genetische mutatie. Onder deze gevallen is het syndroom van Dravet in verband gebracht met meer dan 600 de novo mutaties in één enkel gen, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Kinderen die lijden aan het Dravet-syndroom vertonen aanvallen vanaf de leeftijd van 6 maanden, vertraagde taal-en motorische ontwikkeling, slaapstoornissen, angstachtig gedrag en ernstig cognitief tekort (Dravet, 2011). Symptomen van autisme spectrum stoornis zijn ook gemeld (Li et al., 2011) en het risico op plotseling onverklaarbaar overlijden met epilepsie (SUDEP) in deze populatie wordt geschat op 15-voudig hoger dan andere epilepsies bij kinderen (Kearney, 2013). De beschikbare anti-epileptica bieden geen adequate controle van de beslagleggingen aan en resectieve neurochirurgische procedures zijn gewoonlijk geen optie. Nieuwe behandelingen voor het syndroom van Dravet blijven een belangrijke onvervulde behoefte ondanks een zekere mate van werkzaamheid in beperkte klinische studies voor cannabidiol (Epidiolex®) en stiripentol (Diacomit®), die kunnen worden geassocieerd met cognitieve of eetlust veiligheidsproblemen, respectievelijk (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutaties in SCN1A, een gen dat codeert voor de porievormende α-subeenheid van een spanningsgesloten natriumkanaal (Nav1.1), zijn geïdentificeerd bij bijna 85% van de patiënten met het Dravet-syndroom (Dravet, 2011). Nav1. 1 kanalen dragen bij aan de snelle depolarisatie van neuronale membranen gezien tijdens actiepotentiaal generatie (Hodgkin et al., 1952). Muizen heterozygote voor een verlies-van-functie mutatie in Nav1. 1 Ontwikkelen spontane en temperatuurgevoelige aanvallen vroeg in het leven, en sterven voortijdig rond postnatale dag 25 (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Acute elektrofysiologiestudies bij deze en verwante scn1a-deficiënte muizen suggereren een vermindering van de natriumstroomdichtheid en een daarmee samenhangende afname van de ontstekingsactiviteit voor een subpopulatie van GABA-expressieve remmende neuronen (maar geen prikkelende hoofdcellen), culminerend in verminderde synaptische remming en netwerkhyperexcitatie (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Deze ‘interneuronopathie’ hypothese is consistent met andere vormen van katastrofisch epilepsie bij kinderen en werd bevestigd bij muizen waar Scn1a selectief werd verwijderd uit parvalbumine – of somatostatine-expressie interneuron subpopulaties (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autistisch-achtig gedrag werd ook gemeld bij deze muizen (Han et al., 2012). Interessant is dat initiële studies naar menselijke prikkelende en remmende neuronen, afgeleid met behulp van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie van twee patiënten met het syndroom van Dravet, tekorten in voltage-geactiveerde natriumstroom voor beide celtypen rapporteerden, wat suggereert dat ofwel homeostatische compensatie voor het vroege verlies van functie van een kritisch hersenspecifiek natriumkanaal, ofwel aanvullende mechanismen die bijdragen aan het epileptische fenotype waargenomen bij deze patiënten (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).Hoewel muizen en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen bijdragen aan ons begrip van de onderliggende pathofysiologie van het Dravet-syndroom, zijn deze systemen niet goed geschikt voor de snelle identificatie van nieuwe therapieën vanwege de variabiliteit van deze modellen en de reproduceerbaarheid van kwantitatieve metingen. Als zebravis zijn een ideale gewervelde modelsysteem voor het uitvoeren van kleine molecule fenotype-gebaseerde schermen (MacRae et al., 2015), en zijn vatbaar voor genetische manipulaties, hebben we onze inspanningen gericht op een zebravis natrium kanaal mutant. Mutanten van zebravissen met een missense-mutatieverlies in de scn1a-ortholoog, scn1Lab, werden geïdentificeerd in een mutageneseonderzoek (Schoonheim et al., 2010). Als gevolg van een voorouderlijke volledige genoomduplicatie zijn zebravis scn1Lab mutanten haploinvoldoende voor Nav1.1 en analoog aan scn1a+/− muizen of patiënten met het Dravet-syndroom. Convulsief gedrag en episodes van korte interictale en langdurige polyspike ictal-achtige electrografische afscheiding worden waargenomen bij gemuteerde larven al vanaf 3 dagen na de bevruchting (dpf) met progressie naar robuuster aanvalsfenotypen tussen 4 en 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Mutant larven sterven voortijdig, vertonen metabole tekorten (Kumar et al., 2016), en zijn resistent tegen vele anti-epileptica (AED ‘ s) (Dinday et al., 2015). Net als bij de klinische behandeling van het Dravet-syndroom kan een zekere verzwakking van de aanvalsactiviteit worden verkregen met valproaat, benzodiazepinen, bromiden, stiripentol en een ketogeen dieet (Baraban et al., 2013). Met behulp van scn1Lab-gemuteerde zebravislarven en een op fenotype gebaseerde screeningsstrategie in twee fasen hebben we nu meer dan 2300 samenstellingen gescreend. Clemizol, een histaminereceptorantagonist van de eerste generatie (H1), werd geïdentificeerd als een krachtige remmer van gedrags-en elektrografische aanvallen (Baraban et al., 2013). Antihistaminica zijn echter gecontra-indiceerd bij pediatrische epilepsiepopulaties (Miyata et al., 2011) en de H1-receptoranaloog bij zebravis vertoont minder dan 50% gelijkenis met de mens (Peitsaro et al., 2007). Hier gebruiken we preklinische zebravismodellen om aan te tonen dat clemizol, maar geen antihistaminica, anti-epileptische activiteit uitoefenen. Op basis van ligand binding en extra gerichte drug screening in scn1 mutant zebrafish, identificeerden we verschillende serotonine (5-HT) modulatoren als effectief in het onderdrukken van aanvallen, waaronder twee (trazodon en lorcaserin) FDA-goedgekeurde verbindingen. Lorcaserin (Belviq®) werd in het kader van een compassionate use-programma voorgeschreven aan kinderen met het Dravet-syndroom en resulteerde bij sommige patiënten in een verminderde aanvalsactiviteit. Wij stellen voor dat modulatie van 5-HT signalisatie een nieuwe therapeutische interventie is voor deze catastrofale kinderepilepsie.

materialen en methoden

onderhoud van zebravissen

controle van aanvallen

bij 5 dpf werden individuele zebravislarven geplaatst in een enkele put van een heldere microplaat met een platte bodem van 96 boorput die embryomedia bevat. Larven werden willekeurig gekozen omdat geslachtsbepaling in dit stadium niet mogelijk is. Microplaten werden geplaatst in de daniovision motion-tracking apparaat en geacclimatiseerd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende een opnametijd van 10 minuten werden voor elke putje locomotiepercelen verkregen met behulp van een Daniovision-systeem met EthoVision XT-software (Daniovision, Noldus informatietechnologie); drempeldetectie-instellingen om objecten te identificeren die donkerder zijn dan de achtergrond, werden voor elk experiment geoptimaliseerd. Epileptische aanvallen werden gescoord met behulp van de volgende drie-fase schaal vastgesteld voor pentylenetetrazool-geïnduceerde aanvallen (Baraban et al., 2005): Fase 0, geen of zeer weinig zwemactiviteit; Fase I, toegenomen, korte periodes van zwemactiviteit; Fase II, snel ‘whirlpool-achtig’ cirkelvormig zwemgedrag; en Fase III, paroxysmale clonus-achtige convulsies, en een kort verlies van houding. In het Wild levende vissen worden gewoonlijk gescoord in Fase 0 of I. De waarnemingspunten zijn geanalyseerd op de afgelegde afstand (in millimeters) en de gemiddelde snelheid (in millimeters per seconde). Zoals eerder gemeld (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), waren snelheidsveranderingen de meest gevoelige analyse van aanvalsgedrag.

voor elektrofysiologisch onderzoek werden zebravislarven kort verlamd met α-bungarotoxine (1 mg/ml) en geïmmobiliseerd in 1,2% agarose; local field potential recordings werden verkregen uit forebrain structuren met behulp van een single-elektrode techniek, zoals eerder beschreven (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Met Agarose ingebed lokaal veld potentiele opnamesessies van 10 tot 30 minuten werden verkregen voor elke vis bij 1 kHz. Het iZAP-systeem (Hong et al., 2016) werd gebruikt voor langdurige niet-invasieve monitoring van zebravis bij afwezigheid van een verlammend middel. Het systeem vangt autonoom verscheidene zebravislarven onder veelvoudige geïntegreerde oppervlakteelektroden binnen de microfluidic kamers. scn1Lab larven werden continu gecontroleerd gedurende 5 uur. elektrisch veld potentiaal werd geregistreerd bij 1 kHz continu met uitzondering van 2-tot 3-min pauzes voor media verandering voor samengestelde behandeling en wassen. De geregistreerde gegevens werden geanalyseerd met behulp van MATLAB voor veldpotentiaalgrafieken en frequentieanalyse.

Compound library screening

Compounds for drug screening werden gekocht van Selleck Chemicals en werden geleverd als 10 mM DMSO-oplossingen. Selleck ‘ s Ion Channel Ligand Library (Catalogue # L2700), GPCR Compound Library (Catalogue #L2200) en een aangepaste 5-HT modulerende library werden gebruikt voor screening. Bibliotheekverbindingen zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. In alle schermen van de drugbibliotheek, werden samenstellingen gecodeerd en experimenten werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor de aard van de samenstelling. Uit mutanten in embryomedia werden basisgegevens van het bewegingsgedrag verkregen, zoals hierboven beschreven; na een verandering van de oplossing in een testverbinding en een equilibratieperiode van 20 minuten werd een tweede locomotieproef verkregen. Verbindingen voor motoriestudies werden opgelost in embryomedia en getest bij een concentratie van 250 µM, met een uiteindelijke DMSO-concentratie van 2,5%.

Criteria voor een positieve hit-aanwijzing waren: i) een daling van de gemiddelde snelheid van ≥40%; en ii) een vermindering tot fase 0 of Fase I aanvalsgedrag in de locomotieperceel voor ten minste 50% van de testvissen. Elke testverbinding die in de motoriektest als een ‘positieve hit’ werd geclassificeerd, werd op toxiciteit beoordeeld door directe visualisatie op een stereomicroscoop na een blootstelling van 90 minuten aan het geneesmiddel. Toxiciteit (of sterfte) werd gedefinieerd als geen zichtbare hartslag of beweging als reactie op externe stimulatie bij ten minste 50% van de testvissen. Hyperexcitatie werd gedefinieerd als een verbinding die bij ten minste 50% van de testvissen een toename van ≥40% van de zwemsnelheid en/of Fase III-aanvalsactiviteit veroorzaakt. Positieve treffers geïdentificeerd in het primaire bewegingsscherm werden bevestigd met behulp van de locomotie screening methode in een tweede test met een onafhankelijke koppeling van zebravis. Verbindingen werden vervolgens apart van Sigma-Aldrich aangeschaft en voor de derde keer getest met behulp van de locomotie screening methode op een onafhankelijk legsel van zebravissen. Geneesmiddelen die de gemiddelde zwem snelheid boven de drempel verminderden en niet toxisch waren in de drie onafhankelijke locomotie assays werden verder geanalyseerd met behulp van de elektrofysiologische assay. In elektrofysiologiestudies, werden de drugs eerst bevestigd bij een concentratie van 250 µM gebruikend de locomotietest en toen werd dezelfde zebravis geëvalueerd gebruikend een lokale veldpotentiaal registratie. Alle screening werd gedaan met gecodeerde verbindingen en geanalyseerd door onderzoekers geblindeerd voor de samenstelling identiteit.

fylogenetische analyse

fylogenetische analyse van humane htr2-en zebrafish htr2-eiwitsequenties werd uitgevoerd met de Fyml-software onder de SH-like likelihood-ratio testparameters (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Eiwitsequenties werden afgeleid van Ensembl humane htr2a (ENST00000542664), Htr2b (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198), en zebravis htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSDART00000024191) sequenties.

kwantitatieve real-time mRNA-expressieanalyse

de expressieniveaus van htr2-genen van zebravissen werden onderzocht met behulp van RNA, gepoold uit 25 koppen of staarten van 5 homozygote mutantlarven van het DPF wildtype of scn1Lab, en ontleed hersenen van individuele volwassen mannelijke zebravissen van het wildtype. Totaal RNA werd geëxtraheerd met TRIzol ® – reagens (Invitrogen), volgens het Protocol van de fabrikant en behandeld met DNase I (Invitrogen). Gezuiverd mRNA werd retrotranscribed naar cDNA met behulp van SuperScript ® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)met een mix van oligo(dT) 20. De expressieniveaus van htr2-genen van zebrafish en de eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 van het huishoudgen, zoals 1 (eef1a1l1) werden bepaald gebruikend een StepOne™ Real-Time PCR-machine (Toegepaste Biosystems). Reacties werden uitgevoerd in 20 µl volumes op 96-wells platen met SYBR ® Green Master Mix (Applied Biosystems), met 250 nM primer en 3 µl cDNA. Oligonucleotide sequenties zijn vermeld in aanvullende tabel 2. Gegevens werden geanalyseerd uit drie onafhankelijke experimenten. De gegevens werden uitgedrukt als Ct-waarden en werden gebruikt om ΔCt-waarden te bepalen.

studies bij de mens

na succesvolle identificatie van stoffen in ons zebravismodel en overweging van de farmacokinetiek, kregen kinderen Belviq® (lorcaserin) voorgeschreven onder een “compassionate use protocol” in Children ‘ s Hospital Colorado (IND 125307). Kinderen die in aanmerking kwamen voor het gebruik van Belviq® als zij een SCN1A-mutatie hadden of een klinische diagnose van het Dravet-syndroom, en niet reageerden op ten minste twee geneesmiddelen, waaronder stiripentol in sommige gevallen en met uitzondering van natriumkanaalblokkers. Kinderen moesten een elektrocardiogram en echocardiogram ondergaan bij aanvang en elke 6 maanden tijdens het gebruik van het product. Bovendien waren ze verplicht om follow-up bezoeken om de 3 maanden om voldoende groei te garanderen, evenals te beoordelen op extra bijwerkingen. Om de 6 maanden moesten laboratoriumtests worden uitgevoerd, waaronder hematologische testen, leverfunctietesten en nierfunctietesten. De dosis Belviq® werd gestart met 2,5 mg voor het slapengaan en werd zo nodig wekelijks geleidelijk verhoogd tot een maximale dosis van 10 mg tweemaal daags of 0,3 mg / kg / dag-afhankelijk van wat zich het eerst voordeed.

de goedkeuring van de institutionele toetsingsraad werd verkregen voor het verzamelen van retrospectieve gegevens, met inbegrip van het afzien van toestemming. Gegevens zijn ontleend aan een retrospectieve beoordeling van elektronische medische dossiers in Children ‘ s Hospital Colorado, waaronder leeftijd, soorten aanvallen en frequentie voor en na gebruik van Belviq®, bijwerkingen, dosis Belviq® en gelijktijdig gebruik van medicatie.

statistische analyse

gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), tenzij anders vermeld. Voor vergelijking tussen twee groepen werd de T-test van de Student gebruikt. Wanneer variantie geen normale verdeling had, werd de niet-parametrische Mann-Whitney u-test gebruikt. One-way ANOVA na ofwel Dunnett ‘ s multiple comparison test voor analyse tegen een controle monster of Holm-Sidak paarsgewijs meerdere vergelijkingen tussen gemiddelden. Statistisch significante verschillen worden aangegeven met asterisken (*P < 0,05; **P < 0,01).

resultaten

Effect van clemizol op aanvalsgedrag bij zebravis

we hebben scn1lab-mutantlarven (5 dpf) behandeld met clemizol in concentraties tussen 30 en 400 µM en vervolgens het effect op spontaan aanvalsgedrag gecontroleerd met behulp van geautomatiseerde locomotion tracking software. Op basis van 250 herhaalde motoriecontrolestudies bij onbehandelde scn1Lab-mutanten werd een vermindering van de gemiddelde zwemsnelheid ≥40% (>1,5 × SD) ten opzichte van de uitgangswaarde vastgesteld als drempelwaarde voor positieve onderdrukking van aanvalsgedrag. Clemizole (Fig. 1A) vertoonde anti-epileptische activiteit bij 300 en 400 µM (30 min blootstelling) en bij 100 µM (90 min blootstelling) (Fig. 1B); langdurige blootstelling was toxisch bij de hogere concentraties. Om te bepalen of clemizol spontaan aanvalsgedrag kan onderdrukken bij een tweede zebravis scn1 mutant, hebben we mutant scn1laa larven (5 dpf) onderzocht in de locomotion tracking assay. Larven geïdentificeerd als Fase III aanvalsgedrag (B.V. full body convulsies, hoge snelheid zwemmen activiteit en een kort verlies van houding; Fig. 1C) werden bevestigd als het vertonen van elektrografische ontladingen met interictale-en ictale-achtige componenten in de daaropvolgende veldopnames van de voorhersenen (Fig. 1D). De gemiddelde zwemsnelheid voor larven geïdentificeerd als S3 of ‘vermoedelijk scn1Laa-mutanten’ zebravis was significant hoger dan voor broer of zus controles, of alle geteste larven (Fig. 1E); mutanten werden bevestigd als scn1laa homozygoten door post hoc PCR. Vervolgens hebben we geneesmiddelen getest die eerder spontane aanvallen bij het Dravet-syndroom en scn1Lab-mutanten (250 µM stiripentol en 250 µM diazepam) en 250 µM lamotrigine (een AED die aanvallen bij het Dravet-syndroom kan verergeren) bleken te onderdrukken. Zoals verwacht onderdrukten stiripentol en diazepam, maar niet lamotrigine, significant het aanvalsgedrag bij scn1laa-gemuteerde larven; 250 µM clemizol was ook effectief in deze test (Fig. 1F). Samen tonen deze studies aan dat clemizol aanvalsgedrag kan onderdrukken in twee verschillende scn1 mutante zebravislijnen.

onderzoek naar het werkingsmechanisme van clemizol

secundaire screening met scn1Lab-mutanten

tertiaire screening ter identificatie van veelbelovende loodverbindingen voor de kliniek

5-HT-receptorexpressie bij zebravislarven

omdat clemizol een significante bindingsaffiniteit heeft voor HTR2A en HTR2B, en zowel trazodon als lorcaserine 5-HT signaalmodulatoren zijn, probeerden we de expressie van deze receptoren bij zebravis te bevestigen. De uitlijning van de eiwitopeenvolging van menselijke en zebrafish htr2 receptoren onthulde evolutional behoud met zebrafish orthologues, met Htr2aa en Htr2ab die beiden 59,3% eiwitidentiteit met menselijke HTR2A vertonen; en één enkele htr2b orthologue, htr2b die 62,0% eiwitidentiteit tonen. Kwantificering van het htr2-expressieniveau met behulp van geïsoleerde koppen of staarten van 5 DPF wild-type of scn1Lab-mutantlarven toonde een verrijkte htr2a-en htr2cl1-expressie in de kop. Vergelijkbare resultaten werden verkregen uit volwassen wild-type zebravishersenen, aangezien mutantlarven niet overleven tot volwassenheid (aanvullende Fig. 4).

vermindering van de aanvalsfrequentie bij patiënten met het Dravet-syndroom

het Dravet-syndroom is een catastrofale epilepsie en zeldzame aandoening bij kinderen (http://www.rarediseases.org/) met slopende resultaten, waaronder onbehandelbare epilepsie, ernstig beperkte cognitieve ontwikkeling en risico op SUDEP. Onze preklinische gegevens bevestigen dat de modulatie van 5-HT signalisatie aanvallen geassocieerd met scn1a loss-of-function mutaties kan onderdrukken. Omdat geïdentificeerde 5-HT-modulatoren FDA-goedgekeurde verbindingen zijn met bekende veiligheidsprofielen, kan behandeling met deze hergebruikte geneesmiddelen de frequentie van aanvallen bij kinderen met het Dravet-syndroom veranderen. Deze translationele aanpak richt zich op zeldzame en verwoestende ziekten waarvoor grootschalige klinische proeven niet haalbaar zijn (Dunoyer, 2011; Parker et al ., 2013).

omdat clemizol momenteel niet wordt vervaardigd of beschikbaar is in klinische kwaliteit en trazodon kan werken als een 5-HT-receptoragonist of-antagonist, afhankelijk van de concentratie (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998) hebben we ervoor gekozen om Belviq® (lorcaserin) te evalueren onder een ‘compassionate use off-label’ – programma bij een kleine populatie kinderen met het Dravet-syndroom. Deze kinderen bleken resistent te zijn tegen ten minste vijf goedgekeurde anti-epileptica. Vijf kinderen (gemiddelde leeftijd: 11,8 jaar; bereik: 7-18 jaar) heterozygoot voor een deletie in SCN1A werden prospectief behandeld met Belviq® en in de lengterichting gevolgd in het Children ‘ s Hospital Colorado (Aurora, CO). Het behandelingsprotocol werd goedgekeurd door de Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB) en ouders van patiënten met het Dravet-syndroom stemden schriftelijk in met de deelname van hun kind. We hebben retrospectief het aantal atonische, myoclonische en gegeneraliseerde tonisch-clonische (GTC) aanvallen, bijwerkingen en gelijktijdige AED ‘ s onderzocht.

de klinische kenmerken van kinderen met het Dravet-syndroom die behandeld werden met Belviq® zijn samengevat in Tabel 1. Er waren geen sterfgevallen onder de vijf met Belviq®behandelde patiënten en Belviq® werd goed verdragen zonder ernstige bijwerkingen die stopzetting van de behandeling veroorzaakten. Tijdens de off-label Belviq® – behandeling was één patiënt aanvankelijk 3 weken vrij van aanvallen, één patiënt 2 weken vrij van aanvallen en een derde patiënt had 1-2 dagen per week vrij van aanvallen. Alle vijf patiënten vertoonden een vermindering van het totale aantal aanvallen. Gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen waren significant verminderd bij patiënten 1, 2 en 3. Inderdaad, patiënt 2 ervaren een 90% vermindering van gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen zonder noodzaak voor reddingsmedicijnen. Twee patiënten blijven Belviq® gebruiken zonder toename van de aanvalsfrequentie en, zoals verwacht, was de meest voorkomende bijwerking die werd waargenomen een verminderde eetlust. Eén patiënt herstartte de medicatie een tweede keer met tussentijdse verbetering voor een korte periode en verminderde daarna af.

Clemizol, een antihistaminicum van de eerste generatie, ontdekt in de jaren 1950 (Zierz et al., 1952), werd geà dentificeerd als potentieel therapeutisch voor de behandeling van syndroom Dravet gebruikend scn1lab mutant zebravis om repurposed drugbibliotheken te screenen (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Hier bevestigden we een anti-epileptische activiteit voor clemizol met behulp van een tweede scn1 zebravis mutant model. Helaas wordt clemizol snel gemetaboliseerd bij muizen met een plasmahalfwaardetijd van <10 min (vergeleken met 3,4 uur bij de mens) (Nishimura et al ., 2013), beperking van de evaluatie in muriene modellen. Met succes gebruikt als een antihistamine (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) met acute en chronische studies die een lage orde van toxiciteit melden (Finkelstein et al., 1960), is clemizol niet meer vervaardigd en momenteel niet beschikbaar voor off-label klinische toediening. Bij gebrek aan een middel om clemizol efficiënt te evalueren in preklinische knaagdiermodellen, gebruikten we zebrafish voor target engagement (5-HT receptoren) en identificatie van verwante geneesmiddelen (trazodon en lorcaserine) met passende veiligheidsprofielen die een snelle vertaling naar een klinische toepassing mogelijk maken. Compassionate use, off-label recept van Belviq® (lorcaserin) aan medisch hardnekkige Dravet syndroom patiënten wordt ook beschreven.

Antihistamine H1-receptorantagonisten zijn gewoonlijk gecontra-indiceerd bij pediatrische patiëntenpopulaties (Miyata et al., 2011) en screening deze drugs bevestigden hun onvermogen om (en in sommige gevallen verergeren) aanvallen in scn1 zebravis te onderdrukken. Bindingsgegevens ontdekten een voorheen onbekende clemizol-affiniteit voor htr2a-en / of HTR2B-receptoren. Een daaropvolgend fenotypisch scherm van gerichte bibliotheken identificeerde twee 5-HT-modulerende verbindingen, trazodon en lorcaserine, die gedragsmatige en elektrofysiologische aanvallen konden onderdrukken op een manier die vergelijkbaar is met clemizol. Belviq® (lorcaserin) is een FDA-goedgekeurde htr2c-agonist voorgeschreven voor chronische gewichtsbeheersing (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodone) is ook een door de FDA goedgekeurd antidepressivum dat vaak wordt voorgeschreven voor slaapstoornissen (Mendelson, 2005). Het wordt vaak geclassificeerd als een htr2a en HTR2C inverse antagonist en 5-HT opnameremmer (Stahl, 2009). Studies bij ratten suggereren echter dat trazodon, of zijn metaboliet meta-chloorfenylpiperazine (mCPP), kan werken als een htr2c-agonist in hogere concentraties (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). In het bijzonder werd eerder aangetoond dat chronische behandeling met trazodon beschermend was tegen elektroconvulsieve geïnduceerde aanvallen bij muizen (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), die onze gegevens van scn1lab mutant zebravis steunen. Een 5-HT receptor-gemedieerde werking voor clemizol is ook consistent met een recent fenotypisch scherm waar modulatoren van serotonerge signalering (waaronder clemizol) een effectieve behandeling bleken te zijn in een preklinisch model van de ziekte van Machado-Joseph (Teixeira-Castro et al., 2015); en studies hier suggereren dat clemizol en trazodon verdere ontwikkeling voor off-label testen in patiënten met syndroom Dravet rechtvaardigt.

onze resultaten voegen ook toe aan een groeiende hoeveelheid bewijs dat modulatie suggereert van serotonerge signalisatie als een krachtige suppressor van aanvalsactiviteit, vooral bij catastrofale epilepsies bij kinderen zoals het Dravet-syndroom. Onlangs werden 7 van de 10 patiënten die behandeld werden met een lage dosis met de 5-HT reuptake Blokker fenfluramine zelf gemeld dat ze gedurende 1 jaar vrij waren van aanvallen (Ceulemans et al., 2016). Een lichte verdikking van één of twee hartkleppen werd gemeld bij twee van deze patiënten, wat overeenkomt met een mogelijk verband tussen het gebruik van fenfluramine en pulmonale hypertensie (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Bij mensen worden HTR2A en HTR2C uitgedrukt in het CZS, terwijl htr2b expressie verrijkt is in het hart (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Meer specifiek, HTR2C wordt uitgedrukt op een subpopulatie van remmende interneurons (Liu et al., 2007) en activering van deze receptoren met 5-HT verhoogt GABA-gemedieerde synaptische remming (Boothman et al., 2006), d.w.z. het anti-epileptisch werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan veel algemeen voorgeschreven anti-epileptica. De meeste preklinische studies suggereren inderdaad dat de activering van htr2a-en / of htr2c-receptoren anti-epileptische effecten heeft (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), dat is een redelijk mechanisme van actie koppelen clemizole, lorcaserin, trazodone, en de 5-HT reuptake blocker fenfluramine (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Interessant, was de uitdrukking htr2b in de hersenen van de zebravis vrij laag, die verder voorstelt dat deze drugs potentieel anti-epileptische activiteit via htr2a of htr2c receptoractivering uitoefenen. Interessant is dat studies in Drosophila knock-in vliegen die de k1270t SCN1A menselijke mutatie dragen in het para sodium channel gen hebben aangetoond dat suppletie met een 5-HT precursor (5-hydroxytryptofaan) het door hitte veroorzaakte aanvalsfenotype redt (Schutte et al., 2014). Daarnaast evalueerde een recente studie met behulp van scn1Lab mutanten 13 5-HT signaalverbindingen en suggereerde ook een potentiële anti-epileptische rol voor modulatoren van 5-HT signalisatie (Sourbron et al., 2016). Echter, deze laatste zebravis studies gebruikten een fundamenteel ander protocol (24 uur versus 30-90 min blootstelling aan het geneesmiddel) niet eerder gevalideerd als succesvol identificeren van AED ‘ s gebruikt in Dravet syndroom (benzodiazepines, valproaat, stiripentol, bromiden, en ketogeen dieet). Bovendien blijken de concentraties van geneesmiddelen die 10 maal lager zijn dan wij, effectief te zijn bij zebravis (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), en melding van een anti-epileptische werking voor het hallucinogeen TCB-2 (Fig. 5), stelt voor dat de directe vergelijking van gegevens van laboratoria met behulp van verschillende procedures met de nodige omzichtigheid moet worden geïnterpreteerd.

over het geheel genomen concluderen we dat mutante zebravis een geschikt model is voor de snelle screening en ontdekking van nieuwe anti-epileptica die, met passende veiligheidsprofielen, de klinische zorg voor risicopatiënten, zoals het syndroom van Dravet, direct kunnen informeren.

Afkortingen

Afkortingen
• 5-HT

  serotonine

• AED

  anti-epilepticum

• dpf

  dagen na de bevruchting

• GPCR

  G-eiwit-gekoppelde receptor

• iZAP

  geïntegreerde zebravis analyse platform

Dankwoord

We bedanken de leden van de Baraban laboratorium, Brian Grone en Matthew Dinday in het bijzonder, voor nuttig discussies in de loop van deze studies.

financiering

S. C. B erkent financiering van NINDS R01 grant no. NS079214, UCSF Catalyst Award en het Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

aanvullend materiaal

aanvullend materiaal is beschikbaar op Brain online.