Ck20 en CK5/6 immunohistochemische kleuring van Urotheliale neoplasmata: a Perspective

Abstract

Cytokeratinen behoren tot de familie van intermediaire filamenten. Zij worden uitgedrukt op een hoogst specifieke manier in epitheliaale cellen waar zij een cruciale rol in de integriteit en mechanische stabiliteit van de cellen spelen. Verschillende soorten cytokeratines zijn beschreven in zowel normaal als neoplastisch urotheel. In het geval van urotheliale neoplasmata heeft de expressie van CK20 en CK5/6 in verschillende studies diagnostische en prognostische implicaties. Dus, low-grade urothelial carcinoma manifesteert CK expressie beperkt tot de paraplu cellen, terwijl high-grade tumoren hebben meestal een expressie in de gehele dikte van het urotheel met uitzondering van de basale laag. CK5 / 6 expressie daarentegen wordt uitgedrukt in de basale cellen in alle low-grade en sommige high-grade urothelial carcinomen. Diffuse ck20 kleuring vergezeld van verlies van CK5 / 6-positieve basale laag wordt meestal geassocieerd met agressief klinisch gedrag. Dubbele kleuring van de objectglaasjes voor deze cytokeratines kan een goede interpretatie en correlatie vergemakkelijken.

1. Inleiding

Cytokeratinen behoren tot de familie van het cytoskelet van 10 nm intermediair filament dat in alle cellen aanwezig is. De intermediaire gloeidraadproteã nen worden uitgedrukt in een hoogst celtype-specifieke manier, en hierin vertegenwoordigen keratins de typische intermediaire gloeidraadcategorie huidig in epitheliaale cellen. Deze filamenten zijn een complexe groep van in water onoplosbare polypeptiden, variërend in grootte van 40.000 tot 68.000 Mr. In epithelia, keratine filamenten kunnen worden gebundeld als tonofilamenten, vlecht de kern, spanwijdte door het cytoplasma, en hechten aan de cytoplasmic plaques van de typische epitheliale cel-cel verbindingen, de desmosomes. Aldus, spelen keratins een belangrijke functionele rol in de integriteit en mechanische stabiliteit van zowel de enige epitheliaale cellen als die van de epitheliaale weefsels en zijn een inherent deel van het continuüm van stabiliteit van de Enige Cel aan de weefselvorming .

de keratineproteïnen kunnen worden onderverdeeld in kleine zure type I en grote basische tot neutrale type II keratine. Een unieke eigenschap van de keratines is dat, in tegenstelling tot de andere intermediaire filamentproteã nen, zij slechts hun filamenteuze stadium door paarvorming van type I en type II (1 : 1) molecules kunnen vormen. Onder de menselijke keratines, omvat de recente consensus nomenclatuur de type I keratines K9-K10, K12–K28, en K31–K40 en type II keratines K1–K8 en K71-K86. In het menselijk genoom zijn de keratinegenen geclusterd op twee verschillende chromosomale plaatsen: chromosoom 17q21.2 (type I keratine, behalve K18) en chromosoom 12q13.13 (type II keratine en K18). Men denkt dat de twee cytokeratin subfamilies door genduplicatie en daaropvolgende divergentie van CK8 en CK18 voorkwamen .

elk type epitheliale cel brengt een karakteristieke combinatie van twee tot tien cytokeratineisotypen tot expressie. Aldus, kunnen de normale epitheliaale cellen in vivo of in vitro met betrekking tot hun cytokeratin isotype profiel worden geà dentificeerd. De kenmerkende cytokeratin profielen van de verschillende normale epitheliaale celtypes neigen om na neoplastic transformatie te worden behouden en deze eigenschap kan in tumordiagnose worden uitgebuit. Nochtans, kunnen de cytokeratinprofielen van epitheliaale cellen ook functionele differentiatie, eerder dan weefsel van oorsprong weerspiegelen. Aldus, drukken metaplastic cellen cytokeratin profielkenmerken van hun morfologie eerder dan dat van hun normale tegenhanger uit .

2. Cytokeratineexpressie in urotheel tijdens embryologische ontwikkeling

de cytokeratines zijn het eerste intermediaire filamenttype dat tijdens de embryogenese verschijnt, en alle cellen in een bepaald stadium van foetale ontwikkeling zijn cytokeratinepositief. De eerste cytokeratineisotypen die worden uitgedrukt zijn het CK8 + ck18 paar. Tijdens embryologische epitheliaal-mesenchymale transformatie, wordt de cytokeratinuitdrukking verloren door bepaalde geslachten van cellen, die of cytokeratin negatief blijven en zich tot bindweefsel ontwikkelen of later cytokeratins van secundaire epithelia opnieuw uitdrukken . Embryologische ontwikkeling van de urineblaas komt uit de cloaca, een achtergut structuur, dat is een gemeenschappelijke kamer voor gastro-intestinale en urine-afval. In de 4e–7e ontwikkelingsweek wordt de cloaca door het urorectale septum verdeeld in twee delen: posterior anorectale kanaal en anterior urogenitale sinus. Het bovenste deel van de urogenitale sinus vormt de urineblaas .

tijdens de vroege ontwikkeling van de blaas transformeert het beklede epitheel geleidelijk van enkel endodermaal epitheel naar meerlaagse urotheliale bekleding. Als patroon van de endodermale voering in het GI-kanaal, is de zich ontwikkelende urotheliale voering aanvankelijk diffuus positief voor CK20 in alle lagen. Tijdens de daaropvolgende rijping van het urotheel ontwikkelt zich een basale laag die kan worden aangetoond door CK5-en ck13-positiviteit. De verdere rijping van urotheel impliceert verlies van CK20 in vrijwel alle lagen behalve de paraplu cellen. Er lijken dus drie verschillende fasen van urotheliale ontwikkeling te zijn. De eerste fase wordt gekenmerkt door een gebrek aan basale cellen en ck20 expressie in alle lagen. De tweede fase wordt bepaald door het uiterlijk van de basale laag, maar het ck20 expressiepatroon is nog steeds diffuus. In de derde en laatste fase is er rijping van het ck20-expressiepatroon dat alleen in de paraplulaag door CK20 wordt gekenmerkt. De basale laag is goed ontwikkeld en kan worden aangetoond door CK5/6 of ck13 immunostaining .

3. Cytokeratine expressie in normaal urotheel

de urineblaas is bekleed met urotheel dat is gespecialiseerd om te functioneren als een barrière voor urine en om veranderingen in het intraluminale volume op te vangen. Urotheel verschijnt als een meerlaags epitheel, met drie celzones: (1) een basale cellaag die bestaat uit cellen die in contact staan met en loodrecht op het vlak van het keldermembraan staan; (2) de tussenliggende celzone die bestaat uit 2-5 cellagen; (3) een luminale of oppervlakkige cellaag die bestaat uit late tussencellen en grote, vaak binucleaire, “paraplu” cellen met hun apicale oppervlak naar het lumen gericht. De paraplu cellen worden gekenmerkt door een zonula occludens type van celverbindingen en door de aanwezigheid van gespecialiseerde plaques van de asymmetrische eenheid membraan in het apicale celmembraan en binnen intracellulaire spoelvormige blaasjes . Deze verschijning is toe te schrijven aan de aanwezigheid van overvloedige uroplakin binnen het celmembraan .

In het normale volwassen urotheel worden CK7, CK8, CK18 en CK19 in alle urotheliale cellagen uitgedrukt, wordt CK5 basaal uitgedrukt en wordt CK20 geassocieerd met paraplu cellen (figuur 1).

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 1

(a) Normale urothelium het openbaren van meerdere lagen van cellen met inbegrip van basale cel, intermediaire cellen en paraplu cellen. B) immunohistochemische vlek die een normaal kleuringspatroon van het urotheel vertoont. De paraplu cellen zijn gedecoreerd door CK20 (magenta). De tussenliggende cellen zijn Onbevlekt. Basale cellen zijn versierd met CK5 / 6 kleuring (bruin).

er kunnen ook een paar ck20-positieve cellen in de middencellaag van sommige normale specimens zijn .

4. Cytokeratine expressie in papillaire Urotheliale neoplasie

neoplastische transformatie van urotheliale cellen leidt tot urotheliaal carcinoom, de meest voorkomende vorm van blaaskanker in de meeste landen. Vele patiënten presenteren met oppervlakkige tumors die of niet-invasief zijn (pTa) of slechts lamina propria (pT1) binnenvallen. Hoewel recidief vaak voorkomt (50-70%), kan de ziekte meestal onder controle worden gehouden door lokale behandeling. Niettemin, 10-15% van de patiënten met oppervlakkige ziekte uiteindelijk vooruitgang naar spier-invasieve en metastatische ziekte. Een toename in rang, gekenmerkt door een verlies van differentiatie, en de aanwezigheid van dysplastische veranderingen zijn beide determinanten van een slechte prognose. Bovendien vertonen sommige urotheliale carcinomen basale / plaveiseldifferentiatie, wat geassocieerd is met een slechtere prognose .

het immunohistochemische kleuringspatroon voor cytokeratin20 en CK5/6 varieert met het type en de aard van het urotheliale neoplasma. Bijvoorbeeld, papillaire urothelial neoplasmata van beperkt maligne potentieel (PULLMP) evenals low-grade papillaire carcinomen onthullen ck20 beperkt tot de paraplu cellen en CK5/6 kleuring beperkt tot de basale laag, identiek aan de verdeling van deze keratins in het normale urotheel (Figuur 2).

(een)

b)

c)

(a)
b)
c)

Figuur 2

(a) Low-grade papillaire urothelial carcinoom. B) immunohistochemische vlek met de expressie CK20 (magenta) beperkt tot de paraplu cellen en een goed gevormde basale laag afgebeeld door CK5/6 kleuring (bruin). C) laaggradig urotheel carcinoom met kleuring van basale cellen, maar zonder paraplu cellen.

hoogwaardige urothelial carcinomen, anderzijds, neigen om diffuse immunoreactiviteit voor CK20 te hebben die de paraplu cellen evenals de tussenlaag impliceren. Bovendien kan de basale laag worden aangetoond door CK5/6 positiviteit (Figuur 3).

(een)

b)

c)

(a)
b)
c)

Figuur 3

(a) Hoog-kwaliteit papillaire urothelial carcinoom. b) hoogwaardig papillair urotheliaal carcinoom met diffuse kleuring op volle dikte voor CK20 en aanwezigheid van basale laag zoals aangetoond door CK5/6 kleuring. c) hoogwaardig urotheliaal carcinoom, waaruit de diffuse aanwezigheid van basale cellen en kleuring van de volledige dikte voor CK20 blijkt.

hoger grade papillair urotheel carcinoom, anderzijds, onthult ck20 expressie in de gehele dikte van het urotheel met de afwezigheid van basale laag en negatieve kleuring voor CK5/6 (figuur 4).

(een)

b)

c)

(a)
b)
c)

Figuur 4

(a) Hoog-kwaliteit urothelial carcinoom met gedeeltelijk verlies van basale cellen, maar diffuse vlekken voor CK20. B) hooggradig urotheel carcinoom met bijna volledig verlies van basale cellen. C) hoogwaardig papillair urotheliaal carcinoom dat diffuse immunohistochemische kleuring voor CK20 vertoont en volledige afwezigheid van basale laag zonder kleuring voor CK5/6.

dit patroon met diffuse volledige dikte ck20 kleuring in de afwezigheid van basale laag kleuring is ook een kenmerk aangetroffen in hoogwaardige urothelial carcinomen met lamina propria of spier invasie (Figuur 5).

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 5

(a) Hoog-kwaliteit urothelial carcinoom met het begin van de invasie die sterke CK20 cytoplasmatische kleuring en de afwezigheid van basale cellen. b) hoogwaardig urotheel carcinoom met uitgebreide invasie. De carcinoomcellen zijn diffuus positief voor CK20, maar de basale laag is afwezig.

men heeft voorgesteld dat het patroon van ck20 het bevlekken een nuttige aanvulling aan morfologie in de diagnose van urothelial carcinoma is. Men heeft ook voorgesteld dat de uitdrukking van CK20 kwaadaardig potentieel in low-grade urothelial tumors kan voorspellen, en, daarom, kan CK20 in het definiëren van behandelingsstrategieën voor patiënten met deze tumors nuttig zijn. De uitdrukking van CK20 werd behouden door het grootste deel van zuivere urothelial carcinomen, die het normale oppervlakkige localisatiepatroon in sommige goed-gedifferentieerde papillaire tumors behouden of een heterogene of uniform positieve reactie door alle cellagen tonen. Delen van het carcinoom met plaveiseldifferentiatie onthullen een vermindering van ck20 expressie. Deze gebieden reageren echter positief voor CK5 / 6(Figuren 6(A) en 6 (b)) in een patroon dat verschilt van de basale verdeling van de basale laag .

(een)

b)

c)

d)

(a)
b)
c)
d)

Figuur 6

(a) Hoog-kwaliteit urothelial carcinoom met focale squameuze differentiatie. B) immunohistochemische kleuring die sterke CK5/6 kleuring in het gebied van plaveiseldifferentiatie aantoont. Het resterende deel van carcinoomvlekken voor CK20. C) hooggradig urotheel carcinoom met basosquameuze morfologische kenmerken. d) immunohistochemische kleuring in basosquamous carcinoom met sterke immunokleuring voor CK5/6 en volledige afwezigheid van ck20 positiviteit.

In sommige gevallen kan het gehele carcinoom basosquamous kenmerken vertonen. Deze gevallen tonen een sterke Reactiviteit Voor CK5 / 6 met weinig of geen positiviteit voor CK20 (figuren 6(c) en 6(d)).

twee recent gepubliceerde studies hebben aanvullend bewijs geleverd met betrekking tot de klinische significantie van verschillende patronen van immunokleuring voor CK20 en CK5/6. In een van deze studies werden tumormonsters van 222 patiënten met urotheliale carcinomen in de bovenste tractus die werden behandeld met radicale nefroureterectomie geanalyseerd op de expressie van zeven basale/luminale immunohistochemische markers (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 en FOXA). Door gebruik te maken van CK5 en CK20, definieerden ze vier subtypes van urotheliale carcinomen in de bovenste luchtwegen:(i)Uitsluitend CK20 positieve en CK5 negatieve (CK20+/CK5−)(ii)Uitsluitend CK5 positieve en CK20 negatieve (CK20−/CK5+)(iii)Beide markers positieve (CK20+/CK5+)(iv)Beide markers negatieve (CK20−/CK5−)

In multivariate Cox regressie-analyse, de CK20+/CK5− subtype is een onafhankelijke negatieve prognostische marker met 3.83-voudig verhoogd risico op kanker-specifieke dood, vergeleken met de andere drie subtypen .

in een tweede studie werd gemeld dat immunohistochemische kleuring voor CK5/6 en CK20 gecorreleerd was met de prognose van vroeg urotheliaal carcinoom. Daarnaast werden de genexpressieprofielen van subgroepen van niet-spier-invasieve papillaire hooggradige Upper tract urothelial carcinoma (UTUC) geclassificeerd volgens CK5/6 en ck20 expressieniveaus bestudeerd en gecorreleerd met klinische resultaten. Deze subgroepen omvatten CK5 / 6-high/CK20-low, CK5/6-high/CK20-high en CK5/6-low / CK20-high. De laatste groep gekenmerkt door lage expressie van CK5/6 en hoge expressie van CK20 was voorspellend voor een slechtere prognose van niet-spier-invasieve papillaire hooggradige urotheliale carcinomen. Transcriptionele analyse onthulde 308 differentieel tot expressie gebrachte genen in de subgroepen. Functionele analyses van de genen identificeerden celadhesie als een gemeenschappelijk proces dat differentieel verrijkt is in deze subgroep in vergelijking met de andere, wat het fenotype met een hoog risico zou kunnen verklaren. Late celcyclus / proliferatie handtekeningen werden ook verrijkt in deze subgroep . Aldus, schijnt het dat urothelial die tumors door diffuse het bevlekken voor CK20 in de afwezigheid van aantoonbare basale laag worden gekenmerkt het meest agressieve subtype van papillair urothelial carcinoom vertegenwoordigen.

Cytokeratine 5/6 is aanwezig in de normale keratiniserende epidermis en plaveiselmucosale epitheel, evenals in basale cellen of myoepitheliale cellen van de borst, de speekselklieren en de prostaat . In prostaat-en borstbiopten siert CK5/6 de basaalcellaag en is dus nuttig bij de diagnose van invasief carcinoom, waarbij de laatste verstoken is van basale cellen. De architectuur van urotheel verschilt van die van het prostaat-of mammacel ductaal epitheel met als gevolg dat de aanwezigheid of afwezigheid van basale cellen niet kan worden gebruikt om urotheliale neoplasmata in goedaardige of kwaadaardige types te stratificeren. Echter, de afwezigheid van basale cellen in de urotheliale neoplasmata kan wijzen op een slechte prognose. Zo kan een hoogwaardig urotheliaal carcinoom met een bewaarde basale laag zich minder agressief gedragen in vergelijking met een andere hooggradige tumor waarin de basale laag verloren is gegaan. In ons laboratorium gebruiken we dubbele kleuring voor deze cytokeratines, wat zeer nuttig is bij de juiste interpretatie van deze vlekken.

een vergelijkbaar kleuringspatroon kan ook worden waargenomen bij urotheliaal carcinoom in situ . Deze laesies zijn meestal sterk reactief voor CK20 en kunnen al dan niet de CK5/6-positieve basale cellaag behouden. Het vastklampen type van urothelial carcinoma in situ en pagetoid uitbreiding van carcinomacellen kan ook door positieve ck20 kleuring worden herkend (Figuur 7).

(een)

b)

c)

(a)
b)
c)

Figuur 7

(a) Urothelial carcinoma in situ met een sterke full-dikte immunomarkering voor CK20 met een duidelijke basale cellaag positief voor CK5/6. (B) een ander urotheel carcinoom in situ met sterke kleuring voor CK20 en afwezigheid van basale laag. (c) pagetoïde uitbreiding van urotheliaal carcinoom aangetoond door sterke cytoplasmatische kleuring voor CK20 in een achtergrond van meerdere lagen basale cellen die reageren op CK5/6.

in een minderheid van de gevallen kan carcinoom in situ reactief zijn voor CK5/6, wat wijst op een basaloiddifferentiatie .

5. Embryologische Urotheliale differentiatie versus Dedifferentiatie bij Urotheliale neoplasie

de nauwe correlatie tussen cytokeratineisotype expressiepatronen en epitheliale differentiatie suggereert dat cytokeratines cruciaal zijn voor de structuur en/of functie van het epitheliale weefsel. Nochtans, is het moeilijk geweest om vast te stellen wat de nauwkeurige bijdragen van individuen of combinaties van cytokeratin ISO-types aan normaal en neoplastic epithelial celfenotype en gedrag zijn. Aldus, weerspiegelen de veranderingen in immunolokalisatie ck20 die op een hoger risico van herhaling van urothelial carcinoma wijzen waarschijnlijk een secundaire verandering met betrekking tot dysregulation van het urothelial differentiatieprogramma tijdens carcinogenese eerder dan dat ck20 direct betrokken is. Men kan speculeren dat de patronen van uitdrukking van CK20 en CK5/6 in diverse urothelial carcinomen neigen om de stadia van embryologische ontwikkeling en differentiatie van urothelium na te bootsen. Zo kunnen hoogwaardige urotheliale carcinomen (met of zonder invasie) die worden gekenmerkt door diffuse ck20 expressie zonder enige basale laag vertegenwoordigen het vroege stadium van urotheliale differentiatie nadat de urogenitale sinus scheidt van de cloaca . Tijdens dit stadium van ontwikkeling manifesteert urotheel diffuse ck20-kleuring, maar mist een basale laag. In sommige van de hoogwaardige urothelial carcinomen, is er eenvormige kleuring van alle lagen door CK20, maar er is ook een goed gevormde basale laag aantoonbaar door uitdrukking van CK5/6. Dit kan gelijkwaardig zijn aan het tussenstadium van embryonale urothelial differentiatie. De goed-gedifferentieerde urothelial carcinomen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een volwassen patroon van ck20 uitdrukking waar zijn uitdrukking meestal beperkt tot de paraplu cellen, terwijl goed-gedefinieerde basale cellaag immunoreactive voor CK5/6 ook aanwezig is (figuren 8 en 9).

Figuur 8

(a) Cartoon met stadia van differentiatie tijdens de embryologische ontwikkeling van het urotheel. Tijdens de vroege stadia, behoudt het zich ontwikkelende urotheel ck20 uitdrukking normaal gezien in de cloaca. Tijdens deze fase is er geen basale laag aanwezig. b) tijdens de ontwikkeling van urotheel kan de basale laag niet worden aangetoond door kleuring voor CK5/6. (C) laatste fase van urotheliale differentiatie met normale expressie van CK20 beperkt tot de paraplu cellen en aanwezigheid van normale basale laag manifesteren expressie van CK5/6.

figuur 9

a) Cartoon met een afbeelding van een immunohistochemisch kleuringspatroon in een laaggradig papillair urotheelcarcinoom met ck20-expressie beperkt tot de paraplu-cellen en aanwezigheid van een duidelijk gedefinieerde basale laag die CK5/6 uitdrukt. b) hoogwaardig urotheel carcinoom vertoont de expressie van CK20 in alle lagen van urotheel, met uitzondering van de basale laag die CK5/6 bevat. Dit kan een tussenstadium van dedifferentiatie van de tumor vertegenwoordigen. (c) bij hoogwaardig urotheliaal carcinoom kan de basale laag afwezig zijn, maar het diffuse ck20-patroon van kleuring blijft behouden. Deze kenmerken kunnen wijzen op verdere dedifferentiatie van het carcinoom.

dit patroon kan overeenkomen met het laatste stadium van urotheliale ontwikkeling en rijping tijdens de intra-uteriene periode.

samengevat kan immunohistochemische kleuring van urotheliaal carcinoom voor CK20 en CK5/6 nuttige informatie opleveren over de aard van urotheliaal carcinoom en het klinische gedrag ervan.

beschikbaarheid van gegevens

er werden geen gegevens gebruikt om dit onderzoek te ondersteunen.

belangenconflicten

de auteurs verklaren dat zij geen financiering of belangenconflicten hebben om bekend te maken.

Dankbetuigingen

de auteurs willen hun waardering uitspreken voor de waardevolle hulp en technische expertise van de volgende supervisoren en technische medewerkers van ons immunohistochemisch laboratorium bij de uitvoering van de tweekleurige immunohistochemische kleuring: mevrouw Rajaa Al Abdulla, supervisor; mevrouw Huda Ahmed Al Hijji, supervisor; en mevrouw Zuhoor Ali, senior technoloog.