cisplatine ototoxiciteit omvat cytokines en STAT6 signaalnetwerk

reagentia

cisplatine en 3-(4, 5-dimethylthiazool-2-yl)-2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT) werden gekocht bij Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). De plastic cultuurmaterialen werden gekocht van Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbecco ‘ s modified essential medium (DMEM), foetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), en andere weefselkweek reagentia werden verkregen van Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Recombinant muizen IL-4 en IL-13 eiwit, antilichamen tegen IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (QuantikineR) voor cytokines werden gekocht bij R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Deze antilichamen werden gebruikt voor immunohistochemie in een concentratie van 1: 200. Antilichamen tegen p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) en IkB werden gekocht van Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

celcultuur en levensvatbaarheid

de vaststelling en karakterisering van de voorwaardelijk vereeuwigde HEI-OC1 auditieve cellen werd beschreven in ons vorige rapport 1. De uitdrukking van OHC-specifieke tellers zoals Math1 en Myosin 7a stelt voor dat de cellen van HEI-OC1 OHC voorlopers vertegenwoordigen. HEI-OC1-cellen werden gehandhaafd in hoog-glucose DMEM (Gibco BRL) die 10% FBS bevatten. Voor de hieronder beschreven experimenten werden HEI-OC1 cellen gekweekt onder de volgende tolerante omstandigheden: 33 °C en 5% CO2 in DMEM aangevuld met 10% FBS. Cellen (3 × 104 cellen/put van een 24-Wells plaat) werden geïncubeerd met 20 µM cisplatine gedurende 24 uur. om de levensvatbaarheid van de cel te bepalen, werd MTT (0,25 mg) toegevoegd aan een 1-ml celsuspensie gedurende 4 uur. na het wassen van de cellen, en drie wasbeurten met PBS (pH 7,4), werd het onoplosbare formazanproduct opgelost in DMSO. De optische dichtheid (OD) van elke cultuurput werd vervolgens gemeten met behulp van een microplaatlezer (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) bij 590 nm. De OD van de controlecellen werd genomen om 100% levensvatbaarheid aan te geven. Om de effecten van verschillende cytokines te onderzoeken werden gedurende 30 minuten neutraliserende antilichamen tegen cytokines aan de culturen toegevoegd, waarna ze gedurende 24 uur werden gekweekt met 20 µM cisplatine.

Dieren

STAT4−/− (backcrossgeneratie N10), STAT6−/− (backcrossgeneratie N6) en WT BALB/c muizen werden gekocht bij het Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). De homozygote STAT4 en STAT6 Ko muizen werden geïdentificeerd door PCR. De Ko muizen vertoonden geen ontwikkelingsafwijkingen. Experimenten werden uitgevoerd bij muizen van 6 weken oud en alle muizen waren binnen 3 dagen op dezelfde leeftijd. Muizen kregen een standaard commercieel dieet terwijl ze werden gehuisvest bij een omgevingstemperatuur van 20-22 °C en een relatieve vochtigheid van 50 ± 5% onder een 12:12 uur licht:donker cyclus in een specifieke pathogeenvrije faciliteit. Alle dierstudies werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Wonkwang University School Of Medicine.

Luciferase reporter assay

cellen werden tijdelijk getransfecteerd met NF-kB luciferase reporter plasmide met behulp van het transfectiereagens Lipofectamine 2000. Na 36 uur incubatie, werden de cellen behandeld met cisplatine gedurende 12 uur in aanwezigheid van neutraliserende cytokine antilichamen. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen met PBS buffer en vervolgens lysis in reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA). Een 20-µl aliquot van het lysaat werd vervolgens gemengd met 100 µl luciferase assay reagens, waarna de uitgezonden lichtintensiteit werd gemeten met behulp van een luminometer AutoLumat Lb953 (EG en G Berthold, Bad Wildbad, Duitsland). Ten slotte werd de luciferase-activiteit gemeten in drievoud, gemiddeld en genormaliseerd tegen de β-galactosidase-activiteit met behulp van het galactosidase-assaysysteem (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) volgens de instructies van de fabrikant.

transfectie met siRNA-constructies

vooraf ontworpen siRNAs tegen mouse STAT4, STAT6 en control scrambled siRNA werden gekocht van Santa Cruz Biotechnology. De sense strands van siRNAs tegen STAT4 en STAT6 zijn als volgt. De stat4 siRNAs construct is een pool van drie opeenvolgingen van siRNA als volgt: Duplex 1 Sense Strand: 5 ‘- IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3’, Duplex 2 Sense Strand: 5 ‘- IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′, en Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3’ (mRNA toetreding nummer: NM_011487). De stat6 siRNAs construct is een pool van drie opeenvolgingen van siRNA als volgt: Duplex 1 Sense Strand: 5 ‘- IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3′, en Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3’ (mRNA toetredingsnummer: NM_009284). Cellen werden tijdelijk getransfecteerd met 100 nM siRNA-constructies in x-tremeGENE siRNA-transfectiereagens (Roche Applied Science, Penzberg, Duitsland) volgens het Protocol van de fabrikant. Na incubatie bij 33 °C en 5% CO2 gedurende 36 uur, werden de cellen verder behandeld met cisplatine gedurende 24 uur. de monsters werden vervolgens voorbereid en geanalyseerd voor levensvatbaarheid of Western blot analyse. De interferentie van expressie werd bevestigd door immunoblot analyse.

meting van pro-inflammatoire cytokines met ELISA

om de secretie van pro-inflammatoire cytokines uit de met cisplatine behandelde cellen te meten, werden op elk tijdstip kweeksupernatanten geoogst en werden de niveaus van uitgescheiden pro-inflammatoire cytokines vervolgens bepaald met ELISA (Quantikine Cytokine Kits).; R&D Systems Inc.) volgens de instructies van de fabrikant.

bereiding van cytosolische en nucleaire extracten

cellen werd gewassen met ijskoude PBS, geschraapt en gecentrifugeerd bij 1 000× g gedurende 5 minuten bij 4 °C. De celpellet werd vervolgens geresuspendeerd in 200 µl lysisbuffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride en 0,5 mM dithiothreitol) en vervolgens gedurende 15 minuten op ijs geïncubeerd. Aan het einde van de incubatie werd 10 µl van 10% NP-40 toegevoegd en werd de buis 10 s vortexed. Na centrifugering bij 13 000× g gedurende 1 min bij 4 °C, werd het supernatant (cytosolisch extract) verzameld en opgeslagen bij -80 °C, terwijl de pellet verder werd verwerkt om de nucleaire extracten te verkrijgen. De pellet werd vervolgens geresuspendeerd in extractiebuffer (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol en 25% (vol/vol) glycerol) en geïncubeerd gedurende 30 min bij 4 °C. Kernextracten werden geïsoleerd door centrifugeren bij 13 000× g gedurende 30 min bij 4 °C. Het supernatant werd toen verwijderd en opgeslagen bij -80 °C tot gebruikt voor western blot analyse. Tenslotte werd de eiwitconcentratie bepaald door de Lowry-methode.

Western blot analyse

Western blot analyse werd als volgt uitgevoerd. Kort, de cellen werden geoogst en gewassen tweemaal met ijskoude PBS. De totale en nucleaire / cytosolic gefractioneerde lysaten werden vervolgens onderworpen aan elektroforese op 12% SDS-polyacrylamide gels gedurende 3 uur bij 20 mA, waarna ze werden overgebracht naar nitrocellulose. Het membraan werd vervolgens geïncubeerd in 5% (wt/vol), gedroogde melk eiwit in PBS bevattende 0.05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) voor 1 uur, waarna ze werden gewassen in PBS-T, en verder reageerde met het primaire antilichaam (1:1 000) voor 1 uur. Naast het membraan werd uitgebreid gewassen met PBS-T en vervolgens geïncubeerd met anti-konijn IgG-antilichaam toegevoegd aan HRP (1:3 000) voor 1 uur. Na uitgebreid wast, eiwit bands op het membraan worden gevisualiseerd met behulp van chemoluminescente reagentia volgens de instructies van de fabrikant (Supersignal Substraat; Pierce, Rockford, IL, USA).

in vivo experiment met cisplatine ototoxiciteit

alle muizen werden willekeurig verdeeld in twee groepen van elk zes muizen. Groep 1-dieren, die werden beschouwd als een controlegroep, kregen Intraperitoneale injectie met PBS. Groep 2 dieren kregen gedurende 4 opeenvolgende dagen cisplatine (4 mg/kg lichaamsgewicht) toegediend via Intraperitoneale injectie. De dieren werden vervolgens gedood onder verdoving met behulp van CO2-gas op de dag na de laatste cisplatine-injectie, waarna het slaapbeen van het rechteroor werd verwijderd.

meting van ABR

voor verdere analyse van de auditieve drempel werd de ABR gemeten vóór en 24 uur na de laatste behandeling met cisplatine. De ABR-drempelwijzigingen tussen voor en na de behandeling werden vervolgens vergeleken. Muizen werden verdoofd met behulp van een cocktail van ketamine (40 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) en warm gehouden met een verwarmingskussen tijdens ABR opname. Een subdermale (actieve) naaldelektrode werd ingebracht op de top, terwijl grond en referentie elektroden werden ingebracht subdermaal in de losse huid onder de pinnae van tegenoverliggende oren. Testprikkels bestonden uit wisselende fasetoonuitbarstingen met frequenties van 4, 8, 16 en 32 kHz. Signalen werden gegenereerd met behulp van Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen software. Elke toonuitbarsting (duur 1 ms) was omheind door een Blackmann-venster en had een stijgtijd van 0,5 ms zonder plateau. De stimuli werden vóór elke testsessie gekalibreerd door de output van de luidspreker op te nemen met een microfoon die op het niveau van het hoofd van de dieren is geplaatst. ABR-golfvormen werden gemiddeld als reactie op 300 toonuitbarstingen bij elke geteste frequentie. Bij elke frequentie werd de amplitude van het signaal automatisch verzwakt in 10 dB stappen van 90 dB SPL totdat de ABR golven verdwenen in sporen geregistreerd met filterinstellingen van 100-3 000 Hz. Het oordeel over de drempel werd off-line gemaakt door twee onafhankelijke, experimenteel blinde waarnemers op basis van de ABR-records.

oppervlaktebehandeling van het orgaan van Corti explantaten

alle muizen werden gedood op de dag na de laatste injectie met cisplatine. Het slaapbeen werd ontleed en gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 16 uur bij 4 °C, en gespoeld met 0,1 M PBS. Het slaapbeen werd verder ontkalkt met 10% EDTA in PBS gedurende 3 dagen. Het slakkenhuis is zorgvuldig ontleed. Vervolgens werden de stria vascularis en het spiraalvormige ligament ontleed, waardoor het orgaan van Corti achterbleef. De middelste bocht van het slakkenhuis werd ondergedompeld in TRITC-gelabelde phalloidin (Sigma P1951, 1:100) in PBS gedurende 20 minuten. Na drie wasbeurten met PBS werd het monster onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop met geschikte filters voor TRITC (excitatie: 510-550 nm, emissie: 590 nm).

immunohistochemische kleuring en TUNEL assay

het verwijderde slaapbeen werd gedurende 16 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde en vervolgens gedurende 2 weken ontkalkt met 10% EDTA in PBS, waarna het werd gedehydrateerd en ingebed in paraffinewas. Secties van 5 µm werden gedeparaffiniseerd in xyleen en gerehydrateerd door gesorteerde concentraties van ethanol. Voor de immunohistochemie studie werd een immunohistochemie kit (DAKO Lsab Universal K680, Carpinteria, CA, USA) gebruikt en procedures werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De endogene peroxidase werd vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur Geblokkeerd met 3% waterstofperoxide (RT). Nadat de secties in PBS waren gewassen, werd de niet-specifieke binding Geblokkeerd met 1% runderserumalbumine gedurende 1 uur. primaire antilichamen (1: 200 verdund) werden vervolgens toegevoegd aan de objectglaasjes, waarna de incubatie gedurende 1 uur verliep. na herhaalde wasbeurten met PBS, werden de secties gedurende 30 minuten geïncubeerd met gebiotinyleerde secundaire antilichamen en vervolgens gedurende 30 minuten bedekt met een secundair antilichaam dat mierikswortelperoxidase bevat. Tenslotte werden de secties gekleurd in een vers bereide substraatoplossing (3 mg 3-amino-9-ethylcarbazool in 10 ml natriumacetaatbuffer (pH 4,9), 500 µl dimethylformamide, 0,03% waterstofperoxide) gedurende 5 minuten. De kernen van de immuno-bevlekte cellen werden vervolgens tegenbehandeld met Mayer ‘ s hematoxyline (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotische cellen werden in situ gedetecteerd met behulp van de TUNEL-test (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Duitsland). In het kort werd een sectie gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd. Na incubatie met 20 µg/ml proteïnase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Duitsland), de endogene peroxidase werd geblokkeerd door incubatie van de monsters in 2% H2O2 in methanol voor 30 min op RT. Naast de coupes werden gewassen in PBS en geïncubeerd met labeling oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C. De kernen waren dan counterstained met propidium jodide (0.5 µg/ml, Moleculaire Probes) voor 10 min op RT. Na het wassen met PBS, het monster is onderzocht onder een fluorescentie microscoop.

reverse transcriptase-PCR versterking

voor de cochleaire PCR werd het linkeroor slaapbeen snel geoogst en ondergedompeld in RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) tot gebruik bij -20 °C. Vervolgens werd hele cochleae ontleed en gebruikt om totaal RNA te extraheren door het gebruik van TRIzol (Invitrogen) volgens de protocollen van de fabrikant. Na extractie van het totale RNA met behulp van Trizol (Invitrogen), werd single-stranded cDNA gesynthetiseerd uit het totale RNA. Vervolgens werd PCR met de polymerase van Taq DNA (Takara, Takara Shuzo, Japan) uitgevoerd door de steekproeven aan 30 cycli van 95 °C voor 40 s, 58 °C voor 40 s, en 72 °C voor 50 s te onderwerpen. tien microliters van de PCR-producten werden dan gescheiden op 1,2% agarose-gel en gevisualiseerd onder UV-licht. De opeenvolgingen van de inleidingen die voor PCR-versterking worden gebruikt waren als volgt: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reverse, 5′ – IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3′).

statistische analyse

elk experiment werd ten minste driemaal uitgevoerd en alle gerapporteerde waarden vertegenwoordigen de gemiddelden ± SD van triplicaatanalyses. Statistische multivariate analyse werd uitgevoerd door analyse van variantie en Duncan tests, met behulp van de SPSS 11 (Chicago, IL, USA) statistische software. ANOVA in twee richtingen en / of ANOVA in één richting werden gebruikt om de significantie van de resultaten te bepalen. De statistische resultaten werden beoordeeld door een biostatisticus op masterniveau. Waarden van P < 0.5 werden als statistisch significant beschouwd.